Продажа квадроциклов, снегоходов и мототехники
second logo
Пн-Чт: 10:00-20:00
Пт-Сб: 10:00-19:00 Вс: выходной

+7 (812) 924 3 942

+7 (911) 924 3 942

Содержание

новый бренд и новые модели

В 2004 году автомобили LADA приняли участие в крупнейших международных и российских автосалонах, серийные и перспективные модели АВТОВАЗа демонстрировались и во время »передвижных выставок» — автопробегов. Таким образом, продолжалась реализация новой маркетинговой политики автогиганта и продвижение бренда LADA. Подробнее об этом рассказывает начальник центра управления массовыми коммуникациями ОАО »АВТОВАЗ» Александр Егошин.

— Ежегодно автомобили LADA участвуют в нескольких десятках автовыставок, как в пределах России, так и за рубежом. Наиболее крупные и яркие автошоу, на которых демонстрируется серийная продукция АВТОВАЗа и его потенциал — это такие автосалоны, как Женевский, который по традиции открывает выставочный год, автошоу в Париже, Лейпциге, Москве, Киеве. Кстати, Лейпцигская ярмарка сегодня имеет для нас особое значение: в 2005 году изменится формат проведения автосалона в Лейпциге, расширятся его площади, резко увеличится состав участников.

В 2004 году на каждом крупном автосалоне демонстрировались как серийные и мелкосерийные автомобили, так и перспективные разработки АВТОВАза. К последним относятся представители семейства LADA KALINA, LADA PRIORA. В ушедшем году публике был представлен концепт-кар »Силуэт». Демонстрировались и другие проекты, например, экологически чистый автомобиль на топливных элементах LADA ANTEL. Как и в прошлых выставочных сезонах, в 2004 году АВТОВАЗ показал модели и модификации, которые имеют реальную перспективу. Так, производство LADA KALINA уже запущено. А автомобиль LADA REVOLUTION, который в 2003 году был представлен в качестве прототипа, сейчас стал боевым болидом, который открыл новый класс в отечественном автоспорте.

В прошлом году АВТОВАЗ принял участие в ряде российских региональных автосалонов. Эти мероприятия проводили предприятия фирменной сервисно-сбытовой сети при поддержке автозавода. Дилеры и дистрибьюторы получили рекламно-сувенирную продукцию, видеоматериалы, рекомендации по сценарию проведения выставки. Также АВТОВАЗ готовил для участия в региональных автосалонах отдельные образцы новой техники. В 2004 году в 10 городах в качестве »гвоздя программы» прошла презентация LADA KALINA. Эту практику демонстрации новой техники мы будем продолжать и дальше, причем значительно расширяя географию показа последних разработок АВТОВАЗа. На каждом региональном автосалоне работали специалисты и руководители АВТОВАЗа. Были организованы официальные встречи представителей завода с руководством местных предприятий дилерской сети, проводились пресс-конференции. На местах отмечали, что реформы в сервисно-сбытовой сети происходят стремительно, и их результаты хорошо заметны. Возросла активность дилеров в организации презентационных мероприятий, во внедрении фирменного стиля. В 2005 году, с ростом производства LADA KALINA, кампания по продвижению новой модели и бренда LADA в целом станет еще масштабнее. Сегодня и внешний вид многих дилерских центров, и интерьер соответствуют требованиям фирменного стиля. Магазины по продаже сувенирно-полиграфической продукции и аксессуаров к автомобилям, а также наружная реклама — наличие всего этого уже предусмотрено дилерскими соглашениями. Необходимые имиджевые товары дилеры могут заказать по новым каталогам 2005 года.

Что касается других рекламно-имиджевых мероприятий, то в 2004 году АВТОВАЗ организовал собственный корпоративный автопробег »Дальневосточный маршрут-2004» и принял участие в ряде мероприятий, проведенных другими структурами и средствами массовой информации. Техника АВТОВАЗа отлично показала себя в пробегах, которые организовали журнал »За рулем» и Авторадио.

Некоторые дилеры, например, в Краснодарском крае, в Северо-западном регионе, самостоятельно проводят автопробеги по своим территориям. Со стороны АВТОВАЗа им оказывается методическая поддержка. В 2005 году региональных пробегах будут участвовать автомобили LADA KALINA.

Автопробег на Дальний Восток, организованный непосредственно АВТОВАЗом, имел целью продвижение торговой марки LADA и поддержание имиджа сервисно-сбытовой сети. В последние 2-3 года внимание к вазовской продукции повысилось: люди видят, что наши автомобили значительно продвинулись по оснащенности и качеству. Ниша для автомобилей LADA на дальневосточном рынке существует.

Группа «АВТОВАЗ» является частью бизнес-подразделения Dacia-LADA в структуре Renault Group. Компания производит автомобили по полному производственному циклу и комплектующие для 2-х брендов: LADA и Renault. Производственные мощности АВТОВАЗа расположены в Тольятти – АО «АВТОВАЗ», а также в Ижевске – ООО «LADA Ижевск».

Продукция марки LADA представлена в сегментах В, B+, SUV и LCV и состоит из 5 семейств моделей: Vesta, XRAY, Largus, Granta и NIVA. Бренд лидирует на российском автомобильном рынке с долей более 20% и представлен в 12 странах. LADA имеет самую большую официальную дилерскую сеть в России – 300 дилерских центров.

АПЕЛЬСИН — официальный дилер LADA в Нижнекамске

АВТОВАЗ: 35 ЛЕТ НАУЧНО-ТЕХНИЧЕСКОМУ ЦЕНТРУ

4 сентября исполняется 35 лет с момента выхода правительственного постановления о создании на АВТОВАЗе отраслевого научно-технического центра. Комплекс конструкторских служб и лабораторий, многие из которых уникальны в масштабах страны, успешно работает и сегодня – и является основой службы инжиниринга АВТОВАЗа.Служба инжиниринга АВТОВАЗа – это не только комплекс лабораторий, но и сложившийся высокопрофессиональный коллектив, способный решать сложные задачи. Потенциал и компетенции НТЦ АВТОВАЗа высоко ценится в рамках Renault Group. Именно поэтому принято решение, что АВТОВАЗ и его инженеры внесут значительный вклад в план Renaulution – новую стратегию развития Renault Group. LADA планирует усилить свой продуктовый план пятью новыми моделями до 2025 года, включая новое семейство автомобилей B-сегмента и полностью новое поколение Niva. При этом будет использована высококонкурентная по стоимости и гибкая платформа Альянса CMF-B, которую планируется в значительной степени локализовать. Одновременно с проектированием новых автомобилей проводится модернизация выпускаемых моделей: внедряются новые системы безопасности и комфорта, в частности, это сервисы подключенных автомобилей.Реализация новых проектов потребует усиление инженерного потенциала АВТОВАЗа. Для развития компетенций службы инжиниринга и реализации среднесрочного плана обновления модельного ряда LADA, Компания укрепляет кооперацию с ВУЗами как в Самарской области, так и за ее пределами, популяризирует автомобильную индустрию в молодежной студенческой среде. Сегодня генеральные договоры о сотрудничестве заключены с университетами Тольятти, Самары, Томска, Санкт-Петербурга и Москвы. АВТОВАЗ продолжает набор как выпускников вузов, так и высококвалифицированных специалистов: с 2017 года на завод устроилось работать более тысячи молодых сотрудников из разных регионов России.НТЦ: историяКонструкторская служба АВТОВАЗа начала формироваться еще в конце 1960-х гг, в период запуска автозавода и освоения первой модели, ВАЗ-2101 – модернизация лицензионного автомобиля проходила с участием вазовских инженеров. С тех пор были реализованы и другие значимые для страны проекты, среди которых – развитие «классического» заднеприводного семейства, разработка автомобиля «Нива», переднеприводного семейства «Самара». Проведена работа над концептуальными проектами, в частности, над автомобилями на альтернативных источниках энергии – эти и многие другие проекты сегодня демонстрируются в корпоративном музее АВТОВАЗа в Тольятти.В 1986 году служба главного конструктора АВТОВАЗа начала трансформацию в отраслевой научно-технический центр – сохранив ключевые компетенции, подразделение получило новые возможности и материально-техническую базу. Проект НТЦ создавали специалисты, которым впоследствии предстояло здесь работать. Многие объекты (аэродинамическая труба, аэроклиматический комплекс, комплекс электромагнитной совместимости, камера по исследованию шумов) были созданы с использованием передового мирового опыта.В концепции НТЦ был заложен мощный потенциал для разработки новых моделей и организации технологической подготовки процессов их производства. Как и все производство АВТОВАЗа, инжиниринговый центр в настоящее время проходит трансформацию в соответствии со стандартами Renault Group.НТЦ: основные лабораторииДля проектирования автомобилей в службе инжиниринга АВТОВАЗа работает комплекс подразделений, где создаются все основные узлы и агрегаты: кузов, двигатель, трансмиссия, подвеска, интерьер, электрооборудование и тд. Все создаваемые концепции проверяются на дорогах и в испытательных лабораториях.Комплекс испытательных автодорог: одним из основных его объектов является скоростная кольцевая профилированная трасса протяженностью 10 километров, имеющая овальную форму и ширину проезжей части 12 метров. Максимальная скорость, на которой могут проводиться испытания, составляет 325 км/ч. Внутри овала расположен комплекс специальных дорог для проверки и настройки управляемости, уровня комфорта, шумов, вибраций. Здесь анализируется поведение автомобиля в летних и зимних условиях, проводятся топливно-скоростные и ресурсные испытания. Часть этих трасс изолирована от воздействия внешней среды, что повышает точность результатов тестов.Аэродинамическая труба, единственная лаборатория такого класса в России, и одна из немногих в мире, позволяет производить испытания автомобилей разных классов, а также других объектов, например, макетов зданий. Вентилятор диаметром в 7,4 метра создает поток воздуха скоростью до 216 км/час. Прижимную или подъемную силы измеряют весы – настолько чувствительные, что, если на автомобиль положить монету, система покажет изменения показателей. В аэродинамическом комплексе результате можно не только произвести необходимые замеры сил и моментов, действующих на объект, но и выработать рекомендации по оптимизации поверхностей.Аэроклиматическая камера позволяет испытывать автомобиль в различных климатических условиях, независимо от времени года. Внутри камеры можно имитировать мороз, жару, тропический ливень, снегопад. Это позволяет оперативно испытывать различные системы автомобиля, например, оценить эффективность работы климатической установки или системы обогрева зеркал.Камера испытаний на электромагнитную совместимость: здесь проверяют и совершенствуют электрооборудование автомобилей. В лаборатории электромагнитной совместимости АВТОВАЗа действует экранированная безэховая камера – одна из самых больших в мире, что позволяет вести исследования в широком диапазоне волн. Стены камеры покрыты пирамидами-абсорберами, которые гасят и звуки, и электромагнитные волны. В лаборатории возможна имитация электромагнитных полей практически от любых существующих источников, от сотовых телефонов, до высоковольтной ЛЭП.Лаборатория виброакустических испытаний представляет собой автономное сооружение: специальный фундамент комплекса изолирует его от возможных шумов и вибраций извне. В испытательных камерах можно тестировать автомобиль в разных режимах движения, при этом стены лаборатории покрыты специальным звукопоглощающим материалом, исключающим возможность появления эха. Все это позволяет с максимальной точностью рассчитывать уровень шума, издаваемого автомобилем, а также шумов внутри него.Лаборатория краш-тестов – это лучший из 2-х комплексов ударных испытаний, имеющихся в России. Здесь можно смоделировать большинство сценариев столкновений, которые случаются в реальной жизни, а также проводить омологационные и сертификационные испытания. В частности, это фронтальный удар о жесткий или деформируемый барьер, удар в автомобиль сбоку и сзади, удар о столб. Высокоточное оборудование, а также интерактивные манекены последнего поколения позволяют получить исчерпывающую информацию о повреждениях самого автомобиля и его пассажиров – это дает возможность проектировать автомобили в соответствии с высокими стандартами безопасности. Помимо испытаний LADA, служба инжиниринга АВТОВАЗа проводит тесты других автомобилей по заказам партнеров, а также испытания автокомпонентов – для отбора комплектующих изделий необходимого качества._______Дополнительная информацияЗа 35 лет в НТЦ были созданы следующие проекты серийных автомобилей: семейство LADA 110 (1995-2007), ВАЗ-2123 (Niva, второе поколение, производство с 2000 года), семейство LADA Kalina (2004-2011), LADA Priora (2007-2018), семейство LADA Granta (производство с 2011 года), LADA Vesta (производство с 2015 года), LADA XRAY (производство с 2015 года).

ООО Юг-Лада-Моторс — дилер LADA в г. Башлыкент

LADA представляет XCODE на тольяттинском автосалоне

На тольяттинском автосалоне MOTOREXPO-2016 LADA представляет 6 концептуальных автомобилей, которые раскрывают потенциальные направления развития модельного ряда. Вместе с концепт-карами в экспозиции LADA участвуют модернизированные серийные модели.Кроме того, на MOTOREXPO-2016 демонстрируется LADA Granta Sport, LADA Largus фургон и две мелкосерийных модификации LADA 4х4 — болотоход »Марш» и автомобиль повышенной проходимости »Рысь». Как и другие специальные версии LADA, эти внедорожники можно приобрести через официальную дилерскую сеть.Одной из новинок автосалона стала перспективная система LADA Connect, которая позволит управлять системами автомобиля с помощью смартфона.Подробная информация обо всех представленных автомобилях и фото доступны по ссылке MOTOREXPOТольяттинский автосалон проходит с 22 по 25 сентября в УСК »Олимп». Традиционно для сотрудников АВТОВАЗа организовано бесплатное посещение автосалона. С 23 по 25 сентября каждый работник, предъявив свой служебный пропуск, сможет прийти на выставку и провести с собой еще одного посетителя. Для детей до 7 лет вход свободный. Время работы выставки с 23 по 25 сентября: с 10.00 до 20.00.Концептуальный LADA XCODE ConceptLADA XCODE Concept — автомобиль, демонстрирующий возможное развитие модельного ряда LADA и новой дизайнерской концепции, в основе которой лежит ИКС-стиль. XCODE Concept выполнен в рамках ДНК дизайна, которая уже успешно реализована в серийных автомобилях Vesta и XRAY.Концепция автомобиля предусматривает ряд перспективных решений, в том числе применение турбомотора и полноприводной трансмиссии, а также телематической платформы LADA Connect, которая позволяет управлять системами автомобиля с помощью смартфона, а в перспективе пользоваться из автомобиля облачными сервисами.Дополнительная информация о LADA XCODE и фото доступны по ссылке: LADA XCODE ConceptКонцептуальные CrossLADA Vesta Cross Concept СеданСедан в роли кроссовера – концептуальное решение, уникальное не только для российского, но и для мирового автомобильного рынка. Рост спроса на кросс-версии, соединенный с традиционной российской приверженностью статусным седанам, может дать старт разработке действительно оригинального автомобиля. Седан LADA Vesta Cross Concept оснащен специальным обвесом, который защищает эмаль кузова на легком бездорожье. Концепция автомобиля предусматривает увеличенный клиренс и более крупные колеса, что повышает внедорожный потенциал седана LADA Vesta.Дополнительная информация о LADA Vesta Cross Concept Седан и фото доступны по ссылке LADA Vesta Cross Concept Sedan.LADA Vesta SW Cross ConceptКонцептуальный универсал, показанный впервые в 2015 году. Это пример развития проекта LADA Vesta и интерпретации нового ИКС-образного стиля LADA в формате вседорожного универсала. Динамичный силуэт универсала сочетается с увеличенным клиренсом и развитым обвесом из неокрашенного пластика. Совместно со штампованными элементами ИКС-стиля на боковинах, внедорожные накладки придают автомобилю спортивный, мускулистый и пропорциональный облик. Примечательно, что на концептуальном универсале применены задние фонари, унифицированные с седаном. Запуск автомобиля в серийное производство запланирован на вторую половину 2017 года.Дополнительная информация о LADA Vesta SW Cross Concept и фото доступны по ссылке LADA Vesta SW Cross ConceptLADA XRAY Cross ConceptОт своего серийного прототипа LADA XRAY Cross Concept отличается вседорожным обвесом. Это накладки на пороги, расширители арок, накладки на бамперы. Аналогичный обвес, защищающий эмаль кузова на легком бездорожье, применяется сегодня на серийных Kalina и Largus в модификации Cross.Дополнительная информация о LADA XRAY Cross Concept и фото доступны по ссылке LADA XRAY Cross ConceptКонцептуальные SportLADA Vesta Sport ConceptLADA Vesta Sport Concept демонстрирует богатый потенциал седана-бестcеллера. Кузов и салон концепта выполнены в гоночном стиле. Автомобиль оснащен подвеской с гоночными настройками — при этом использован опыт участия команд LADA в соревнованиях мирового уровня, в т.ч. в Чемпионате по турингу WTCC. Напомним, что в июне 2016 года заводская команда LADA Sport Rosneft сделала победный дубль на домашнем этапе в России.Дополнительная информация о LADA Vesta Sport Concept и фото доступны по ссылке LADA Vesta Sport ConceptLADA XRAY Sport ConceptКонцептуальный автомобиль иллюстрирует возможное развитие линейки серийных LADA с форсированными моторами и гоночным стилем. Как и у концепта LADA Vesta Sport, двигатель LADA XRAY Sport Concept базируется на серийном 1,8-литровом моторе. Доработка и перенастройка двигателя могут поднять его мощность со штатных 122 л.с. до 145-150 л.с. Подвеска автомобиля была занижена и получила спортивные настройки.Дополнительная информация о LADA XRAY Sport Concept и фото доступны по ссылке LADA XRAY Sport ConceptКонцепты LADA Vesta Sport Concept и LADA XRAY Sport Concept созданы в рамках единой стратегии спорт-версий LADA — в настоящий момент выпускаются аналогично модифицированные Kalina Sport и Granta Sport.Новые модификации серийных LADALADA Vesta CNG TaxiПерспективная модификация LADA Vesta, которая позволяет использовать два вида топлива: сжатый природный газ (метан) и бензин. Работа на сжатом природном газе позволяет снизить затраты на топливо более чем в 3 раза. Это очень важно для корпоративного транспорта и таксопарков – именно поэтому LADA Vesta CNG изготовлена в варианте такси. Метан более экологичен и менее взрывоопасен, чем пропан и бензин. Кроме того, работа на природном газе увеличивает ресурс мотора.Дополнительная информация о LADA Vesta CNG Taxi и фото доступны по ссылке LADA Vesta CNG .LADA Vesta 1.8 ExclusiveМодификация, которая сегодня готовится к производству. Ее отличие — новый силовой агрегат (аналогичный устанавливается на LADA XRAY). 1,8-литровый мотор LADA мощностью 122 л.с. оснащен системой электронной регулировки фаз газораспределения (VVT). Для автомобиля предусмотрена как механическая коробка передач, так и автоматизированная механическая трансмиссия (АМТ) — совместная разработка LADA и немецкой фирмы ZF. АМТ откалибрована таким образом, чтобы приспосабливаться под индивидуальный стиль вождения.Новая модификация Exclusive дополнена такими опциями как кожаная обивка сидений, руля, подсветка салона в ногах пассажира и водителя, хромированные молдинги на дверях и др.Дополнительная информация о LADA Vesta Exclusive и фото доступны по ссылке LADA Vesta ExclusiveОбщая информация по LADA Vesta — по ссылке LADA VestaLADA ConnectLADA Connect – перспективная телематическая платформа, которая позволит управлять системами автомобиля с помощью смартфона. Это уникальная опция для автомобилей доступного и среднего ценовых сегментов. На тольяттинском автосалоне можно ознакомиться с настройками системы и протестировать некоторые из функций LADA Connect: подачу звукового и светового сигнала, получение данных о геолокации, температуре воздуха в салоне и снаружи автомобиля, проверить, закрыты ли двери и багажник автомобиля. Первые LADA Vesta и LADA XRAY с функцией Connect планируется выпустить в 2017 году.Подробная информация о LADA Connect доступна по ссылке LADA Connect .ОАО «АВТОВАЗ» является уникальным предприятием, это крупнейший производитель Альянса Рено-Ниссан в России и один из крупнейших автозаводов в мире. ОАО «АВТОВАЗ» единственный из 46 заводов Альянса, который выпускает по полному циклу автомобили под 4 брендами (LADA, Renault, Nissan и Datsun).Во втором полугодии 2015 года АВТОВАЗ начал производство LADA Vesta и LADA XRAY, которые обеспечат полное обновление бренда LADA и новые перспективы его развития.Сегодня LADA представлена 20 моделями и модификациями в классах В, В+, SUV и LCV.

ООО Парус — дилер LADA в г. Казань

АВТОВАЗ: 35 лет научно-техническому центру

4 сентября исполняется 35 лет с момента выхода правительственного постановления о создании на АВТОВАЗе отраслевого научно-технического центра. Комплекс конструкторских служб и лабораторий, многие из которых уникальны в масштабах страны, успешно работает и сегодня – и является основой службы инжиниринга АВТОВАЗа.Служба инжиниринга АВТОВАЗа – это не только комплекс лабораторий, но и сложившийся высокопрофессиональный коллектив, способный решать сложные задачи. Потенциал и компетенции НТЦ АВТОВАЗа высоко ценится в рамках Renault Group. Именно поэтому принято решение, что АВТОВАЗ и его инженеры внесут значительный вклад в план Renaulution – новую стратегию развития Renault Group. LADA планирует усилить свой продуктовый план пятью новыми моделями до 2025 года, включая новое семейство автомобилей B-сегмента и полностью новое поколение Niva. При этом будет использована высококонкурентная по стоимости и гибкая платформа Альянса CMF-B, которую планируется в значительной степени локализовать. Одновременно с проектированием новых автомобилей проводится модернизация выпускаемых моделей: внедряются новые системы безопасности и комфорта, в частности, это сервисы подключенных автомобилей.Реализация новых проектов потребует усиление инженерного потенциала АВТОВАЗа. Для развития компетенций службы инжиниринга и реализации среднесрочного плана обновления модельного ряда LADA, Компания укрепляет кооперацию с ВУЗами как в Самарской области, так и за ее пределами, популяризирует автомобильную индустрию в молодежной студенческой среде. Сегодня генеральные договоры о сотрудничестве заключены с университетами Тольятти, Самары, Томска, Санкт-Петербурга и Москвы. АВТОВАЗ продолжает набор как выпускников вузов, так и высококвалифицированных специалистов: с 2017 года на завод устроилось работать более тысячи молодых сотрудников из разных регионов России.НТЦ: историяКонструкторская служба АВТОВАЗа начала формироваться еще в конце 1960-х гг, в период запуска автозавода и освоения первой модели, ВАЗ-2101 – модернизация лицензионного автомобиля проходила с участием вазовских инженеров. С тех пор были реализованы и другие значимые для страны проекты, среди которых – развитие «классического» заднеприводного семейства, разработка автомобиля «Нива», переднеприводного семейства «Самара». Проведена работа над концептуальными проектами, в частности, над автомобилями на альтернативных источниках энергии – эти и многие другие проекты сегодня демонстрируются в корпоративном музее АВТОВАЗа в Тольятти.В 1986 году служба главного конструктора АВТОВАЗа начала трансформацию в отраслевой научно-технический центр – сохранив ключевые компетенции, подразделение получило новые возможности и материально-техническую базу. Проект НТЦ создавали специалисты, которым впоследствии предстояло здесь работать. Многие объекты (аэродинамическая труба, аэроклиматический комплекс, комплекс электромагнитной совместимости, камера по исследованию шумов) были созданы с использованием передового мирового опыта.В концепции НТЦ был заложен мощный потенциал для разработки новых моделей и организации технологической подготовки процессов их производства. Как и все производство АВТОВАЗа, инжиниринговый центр в настоящее время проходит трансформацию в соответствии со стандартами Renault Group.НТЦ: основные лабораторииДля проектирования автомобилей в службе инжиниринга АВТОВАЗа работает комплекс подразделений, где создаются все основные узлы и агрегаты: кузов, двигатель, трансмиссия, подвеска, интерьер, электрооборудование и тд. Все создаваемые концепции проверяются на дорогах и в испытательных лабораториях.Комплекс испытательных автодорог: одним из основных его объектов является скоростная кольцевая профилированная трасса протяженностью 10 километров, имеющая овальную форму и ширину проезжей части 12 метров. Максимальная скорость, на которой могут проводиться испытания, составляет 325 км/ч. Внутри овала расположен комплекс специальных дорог для проверки и настройки управляемости, уровня комфорта, шумов, вибраций. Здесь анализируется поведение автомобиля в летних и зимних условиях, проводятся топливно-скоростные и ресурсные испытания. Часть этих трасс изолирована от воздействия внешней среды, что повышает точность результатов тестов.Аэродинамическая труба, единственная лаборатория такого класса в России, и одна из немногих в мире, позволяет производить испытания автомобилей разных классов, а также других объектов, например, макетов зданий. Вентилятор диаметром в 7,4 метра создает поток воздуха скоростью до 216 км/час. Прижимную или подъемную силы измеряют весы – настолько чувствительные, что, если на автомобиль положить монету, система покажет изменения показателей. В аэродинамическом комплексе результате можно не только произвести необходимые замеры сил и моментов, действующих на объект, но и выработать рекомендации по оптимизации поверхностей.Аэроклиматическая камера позволяет испытывать автомобиль в различных климатических условиях, независимо от времени года. Внутри камеры можно имитировать мороз, жару, тропический ливень, снегопад. Это позволяет оперативно испытывать различные системы автомобиля, например, оценить эффективность работы климатической установки или системы обогрева зеркал.Камера испытаний на электромагнитную совместимость: здесь проверяют и совершенствуют электрооборудование автомобилей. В лаборатории электромагнитной совместимости АВТОВАЗа действует экранированная безэховая камера – одна из самых больших в мире, что позволяет вести исследования в широком диапазоне волн. Стены камеры покрыты пирамидами-абсорберами, которые гасят и звуки, и электромагнитные волны. В лаборатории возможна имитация электромагнитных полей практически от любых существующих источников, от сотовых телефонов, до высоковольтной ЛЭП.Лаборатория виброакустических испытаний представляет собой автономное сооружение: специальный фундамент комплекса изолирует его от возможных шумов и вибраций извне. В испытательных камерах можно тестировать автомобиль в разных режимах движения, при этом стены лаборатории покрыты специальным звукопоглощающим материалом, исключающим возможность появления эха. Все это позволяет с максимальной точностью рассчитывать уровень шума, издаваемого автомобилем, а также шумов внутри него.Лаборатория краш-тестов – это лучший из 2-х комплексов ударных испытаний, имеющихся в России. Здесь можно смоделировать большинство сценариев столкновений, которые случаются в реальной жизни, а также проводить омологационные и сертификационные испытания. В частности, это фронтальный удар о жесткий или деформируемый барьер, удар в автомобиль сбоку и сзади, удар о столб. Высокоточное оборудование, а также интерактивные манекены последнего поколения позволяют получить исчерпывающую информацию о повреждениях самого автомобиля и его пассажиров – это дает возможность проектировать автомобили в соответствии с высокими стандартами безопасности. Помимо испытаний LADA, служба инжиниринга АВТОВАЗа проводит тесты других автомобилей по заказам партнеров, а также испытания автокомпонентов – для отбора комплектующих изделий необходимого качества._______Дополнительная информацияЗа 35 лет в НТЦ были созданы следующие проекты серийных автомобилей: семейство LADA 110 (1995-2007), ВАЗ-2123 (Niva, второе поколение, производство с 2000 года), семейство LADA Kalina (2004-2011), LADA Priora (2007-2018), семейство LADA Granta (производство с 2011 года), LADA Vesta (производство с 2015 года), LADA XRAY (производство с 2015 года).

Революция на АвтоВАЗе: новые «Лады» станут клонами иномарок 07.02.2021

АвтоВАЗ, который мы по привычке считаем отечественным производителем, на самом деле уже давно стал частью мирового автопрома. Сегодня тольяттинский автогигант выпускает не только иномарки (Renault Logan и Sandero, а ранее — Nissan и Datsun), но и комплектующие, которые поставляются на зарубежные заводы Renault. Более того, некоторые модели Lada — универсал Largus и хэтчбек Xray — созданы на иностранной платформе и, по сути, представляют собой перелицованные версии Dacia Logan MPV и Sandero. И вот теперь в развитии российского предприятия наступает новый этап.

В структуре Группы Renault, куда входит и АвтоВАЗ, Lada объединена с румынской Dacia в одно бизнес-подразделение, что призвано укрепить производственные синергии между брендами за счет использования высококонкурентной по стоимости и гибкой платформы CMF-B в сочетании с высоким уровнем локализации. АвтоВАЗ и Dacia вместе будут выпускать ежегодно более 1 млн автомобилей на базе CMF-B, перейдя к 2025 году с четырех платформ на одну и сократив количество типов кузовов с 18-ти до 11-ти.

По словам генерального директора сети автосалонов Fresh Auto Дениса Мигаля, на сегодняшний день автомобили Lada выпускаются на четырех платформах: B0, Granta, Vesta и 4×4, что значительно увеличивает нагрузку на производство и повышает его стоимость. Переход на единую платформу CMF-B и уменьшение типов кузова до 11 вариаций значительно сократит издержки и позволит расширить объемы выпуска. Однако это негативно отразится на деятельности АвтоВАЗа, так как фактически сотрудникам отечественного предприятия останется только адаптация автомобилей к российским условиям.

— Потеряв свое оригинальное шасси, автомобили Lada станут практически копиями других моделей концерна Renault, кроме того, сравняются с иномарками по цене. Разумеется, это не прибавит им конкурентоспособности и, как следствие, объема продаж. Более того, с унификацией платформы Россия теряет свои позиции в легковом автопроме, иными словами, попросту лишается их. А страна, у которой нет собственного автомобильного инжиниринга и производства автомобилей, сильно теряет имидж среди мировых игроков, — сетует Денис Мигаль.

Показательно, что новый стратегический план АвтоВАЗа предполагает отказ от производства Lada Vesta, которая является наиболее современной и, судя по всему, последней разработкой отечественного автогиганта. Впрочем, флагманскую модель еще ждет рестайлинг в 2022 году, однако до смены поколений «Веста» уже не доживет. Кроме того, АвтоВАЗ отказался от разработки фургона под условным названием Lada Van, который, как предполагалось ранее, станет перелицованной версией Renault Dokker. Последний, кстати, не так давно покинул российский рынок, поскольку особого спроса в нашей стране так и не снискал. К тому же новый фургон от Lada мог создавать лишнюю конкуренцию «Ларгусу», а это для АвтоВАЗа было бы не к чему.

Что же тольяттинский автогигант предложит взамен? К 2025 году на рынке появятся четыре новых модели Lada, включая совершенно новое поколение внедорожника Niva в 2024 году, а также новый автомобиль сегмента С-SUV в 2025 году. Уже известно, что новая Niva будет выпускаться в двух версиях — с компактной и удлиненной колесной базой. Внедорожник сохранит полный привод и получит рекордный дорожный просвет в 240 мм, а под его капотом в качестве альтернативы вазовскому 1,8-литровому мотору мощностью 122 л.с. будет предложен 150-сильный турбодвигатель объемом 1,3 л, которым сегодня оснащаются Renault Arkana и новый Kaptur. При этом производство нынешнего поколения Lada Niva планируется продолжать вплоть до 2026 года. А вот новым среднеразмерным кроссовером от Lada вполне может стать перелицованный Dacia Bigster, концепт которого был недавно представлен. По сравнению с новым Duster это более крупный автомобиль длиной 4,6 м, при этом не исключено, что он получит семиместный салон.

Ближайшим же новинками АвтоВАЗа станут две модели В-класса — их выход запланирован на 2023 год. По неофициальным данным, речь идет о новом поколении Lada Granta в кузовах «седан» и «универсал», которое разработано на базе третьей генерации Logan/Sandero. Хэтчбека и лифтбека у новой «Гранты» не будет, чтобы не возникало конкуренции с Sandero.

— Смотря на структуру российского рынка, я оцениваю перспективный модельный ряд Lada положительно. АвтоВАЗ не собирается отдавать свой родной сегмент B и также будет сильнее пробиваться в популярный сегмент «паркетников». Сегодня кроссоверы – самый активно растущий на рынке, и расширение модельной гаммы Lada новым городским автомобилем класса C-SUV оправдан, — комментирует консультант компании Simon-Kucher & Partners Иван Кондратенко.

В свою очередь, Денис Мигаль считает совершенно непонятным решение автоконцерна Renault отказаться от современной и популярной модели Lada Vesta и сделать акцент на производстве кроссоверов, которым будет нелегко конкурировать с теми же брендами из Китая.

Стоит отметить, что недавно на АвтоВАЗе сменился шеф-дизайнер марки Lada — им стал Жан-Филипп Салар, который последние пять лет отвечал за разработку дизайна всей линейки Dacia (Duster, новый Sandero, новый Logan, включая Arkana для России). В связи с этим можно ожидать, что новые модели Lada уйдут от фирменного «Икс-дизайна», разработанного его предшественником Стивом Маттином. По крайней мере, об этом красноречиво говорит свежий эскиз новой Niva, которая заметно отличается от представленного в 2018 году концепта Lada 4×4 Vision. В новом варианте перспективный внедорожник лишился фирменных выштамповок на боковинах и Х-образной решетки радиатора, скорее напоминая Renault Arkana.

Как считает старший аналитик ИАЦ «Альпари» Анна Бодрова, потребительское мнение явно указывает на то, что разработанный ранее «Икс-дизайн» очень удачен и с позиции современности моделей, и с точки зрения продаваемости автомобилей, поэтому менять его и «подгонять» под форматы Dacia вряд ли разумно. Кроме того, это потребует дополнительных расходов, которые сейчас совсем не кстати Группе Renault.

— Очень сомнительна и идея унификации Lada с Dacia — рынку не нужен конвейер безликих и совершенно одинаковых автомобилей эконом-класса, спроса на них будет очень мало, учитывая емкость потребительского рынка в России. В этом свете было бы более продуктивно, если бы Lada оставалась как минимум сегодняшней, — рассуждает Анна Бодрова.

Действительно, учитывая, что на платформе CMF-B построены седан Dacia Logan и хэтчбек Sandero нового поколения, которые в нашей стране появятся под брендом Renault, сильная схожесть моделей Lada и Renault может привести к внутреннему «каннибализму». Известно, что до 2025 года компания Renault планирует представить в России пять новинок, в том числе модели, разработанные на платформе CMF-B. Однако даже в случае усиления внутренней конкуренции АвтоВАЗ вряд ли утратит лидерство на российском рынке, предлагая наиболее доступные автомобили.

По мнению ведущего эксперта УК «Финам Менеджмент» Дмитрия Баранова, учитывая, что марки, принадлежащие Renault, сохранят свою самостоятельность, они будут отличаться друг от друга, несмотря на то, что их модели планируется производить на единой платформе. Внешний и внутренний облик автомобилей этих марок будет разным, чтобы дать возможность выбора потребителям, чтобы они меньше конкурировали друг с другом. Скорее всего, будут отличаться и технические характеристики машин, и их цена.

— О том, что АвтоВАЗ вот-вот перестанет быть лидером отечественного автомобильного рынка, говорят уже много лет, однако этого не происходит, вряд ли это произойдет и когда компания перейдет к выпуску автомобилей на новой платформе. Модели Lada все равно будут узнаваемы и продолжат пользоваться спросом среди потребителей. Компания уже давно не является тем производителем, которым была много десятилетий назад, она изменилась. Скорее всего, АвтоВАЗ сохранит ведущие позиции в отечественной автомобильной промышленности в ближайшие годы, а сотрудничество с Renault укрепит его положение и на мировом рынке, — резюмирует Дмитрий Баранов.

АвтоВАЗ в 2021 году выпустит четыре новые модели Lada

В 2021 году АвтоВАЗ планирует вывести на рынок четыре новинки. По данным портала pokatim.ru, ими станут: новая Lada Granta, спорт-универсал Lada Vesta SW Sport, модернизированные Vesta и Largus.

актуальная LADA Granta

Так, по информации источника LADA Granta нового поколения выйдет в III–IV квартале 2021 года. АвтоВАЗ начал разработку этой модели ещё в 2017 году. Недавно в интернет просочилась информация, что Granta нового поколения построят на платформе CMF-B-LS, а по габаритам она будет больше актуальной модели. Также стало известно, что 3D-макет внешности будущей новинки уже существует, а в разработке проекта принимают участие в том числе инженеры из Румынии и Франции.

независимый рендер рестайлинговой Lada Vesta от mail.ru

Также в следующем году покажут рестайлинговую LADA Vesta FL, более точные сроки не уточняются. Первая информация о предстоящем рестайлинге флагманской модели LADA

появилась весной 2020 года. Так, стало известно, что Vesta FL порадует новыми бамперами, капотом, крыльями и видоизменённой задней частью кузова. При этом появится светодиодная оптика.

прототип LADA Vesta SW Sport во время дорожных испытаний

Кроме того, в 2021 году должны представить LADA Vesta SW Sport. Прототип этой модели уже не раз попадал в объектив шпионских фотокамер во время прохождения дорожных испытаний. АвтоВАЗ планировал наладить сборку новинки по 1–2 штук в неделю весной 2020 года, однако из-за пандемии коронавирусной инфекции сроки пришлось скорректировать. Теперь же выход спортивного автомобиля запланирован на 2021 год.

прототип LADA Largus FL во время дорожный испытаний

Наконец, последняя и, наверное, самая близкая по срокам новинка — это LADA Largus FL. Модель должна дебютировать в первом квартале следующего года. Автомобиль будет выполнен в фирменном Х-стиле марки LADA, но при этом останется в том же ценовом сегменте. Из изменений внешности стоит ожидать новые бамперы, крышку капота, крылья и фары. Задняя часть

LADA Largus FL останется без изменений.

АвтоВАЗ — новости и информация о компании

Решение Федеральной службы по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор) от 27 ноября 2020 г. ЭЛ № ФС 77-79546

Учредитель: АО «Бизнес Ньюс Медиа»

И.о. главного редактора: Казьмина Ирина Сергеевна

Рекламно-информационное приложение к газете «Ведомости». Зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор) за номером ПИ № ФС 77 – 77720 от 17 января 2020 г.

Любое использование материалов допускается только при соблюдении правил перепечатки и при наличии гиперссылки на vedomosti.ru

Новости, аналитика, прогнозы и другие материалы, представленные на данном сайте, не являются офертой или рекомендацией к покупке или продаже каких-либо активов.

Сайт использует IP адреса, cookie и данные геолокации Пользователей сайта, условия использования содержатся в Политике по защите персональных данных

Все права защищены © АО Бизнес Ньюс Медиа, 1999—2021

Любое использование материалов допускается только при соблюдении правил перепечатки и при наличии гиперссылки на vedomosti.ru

Новости, аналитика, прогнозы и другие материалы, представленные на данном сайте, не являются офертой или рекомендацией к покупке или продаже каких-либо активов.

Все права защищены © АО Бизнес Ньюс Медиа, 1999—2021

Решение Федеральной службы по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор) от 27 ноября 2020 г. ЭЛ № ФС 77-79546

Учредитель: АО «Бизнес Ньюс Медиа»

И.о. главного редактора: Казьмина Ирина Сергеевна

Рекламно-информационное приложение к газете «Ведомости». Зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор) за номером ПИ № ФС 77 – 77720 от 17 января 2020 г.

Сайт использует IP адреса, cookie и данные геолокации Пользователей сайта, условия использования содержатся в Политике по защите персональных данных

доноров и акцепторов: новые события во FRET | Сентябрь 2009 г.


Перенос энергии резонанса Фёрстера, или FRET, внес свой вклад в развитие множества приложений. Измерение передачи энергии между донорными и акцепторными красителями, прикрепленными к двум концам молекулы или к двум разным молекулам, сближенным, позволяет исследователям исследовать ряд биологических процессов, включая взаимодействия белок-белок и белок-ДНК, связывание лиганд-рецептор и конформационные изменения белка в ответ на биологический стимул.Это также позволяет им исследовать пространственные отношения в биологических структурах и макромолекулах, отслеживая расстояние между двумя сайтами, меченными флуорофором.

FRET-микроскопия оказалась популярным средством характеристики молекулярных взаимодействий в живых организмах. Кроме того, эта способность к межмолекулярному зондированию облегчает выполнение множества биоаналитических и биосенсорных приложений.


Исследователи сообщили о методе FRET, в котором используются многослойные наночастицы ядро-оболочка для использования явления, известного как усиленная металлом флуоресценция.Здесь показано схематическое изображение усиленного металлом FRET в наночастицах. Серебряное ядро ​​окружено концентрическими слоями молекул флуорофора, а расстояние между ними точно регулируется путем добавления спейсерной оболочки из диоксида кремния контролируемой толщины. Взаимодействие ядра с молекулами флуорофора увеличивает расстояние, на котором происходит FRET, и значительно усиливается интенсивность флуоресценции.

Разработка техники продолжается. В последние годы FRET извлек выгоду из множества новых компонентов и методологий.Улучшения стали возможны, сказал Сапна К. Део, доцент кафедры биоаналитической химии Университета Индианы и Университета Пердью в Индианаполисе, благодаря доступности недорогих мощных лазеров и детекторов, таких как лавинные фотодиоды и фотонные умножители, благодаря развитию флуоресцентной микроскопии. а также за счет разработки лучших фильтров, лучшего программного обеспечения для анализа данных и лучших камер.

По ее словам, использование новых доноров и акцепторов добавило дополнительных преимуществ в его разработку.Обычные флуорофоры, используемые с FRET, включая органические красители, флуоресцентные белки, хемилюминесцентные субстраты и флуоресцентные полимеры, часто имеют ограниченные возможности. Их узкие окна возбуждения и широкие излучения могут привести к спектральному перекрытию между донором и акцептором, например, что может вызвать головную боль, особенно при мониторинге взаимодействий между двумя или более парами донор-акцептор с мультиплексированным FRET. Другие проблемы — ограниченная фотостабильность и возможность фотообесцвечивания и фотодеградации.Исследователи изучили несколько альтернатив, чтобы обойти эти проблемы. В последние годы появились металлические наночастицы и биолюминесценция для улучшения FRET. Каждый из них предлагает уникальный набор преимуществ по сравнению с обычными флуорофорами и, таким образом, может улучшить методику для широкого спектра приложений.

Флюоресценция, усиленная металлами
В Квебеке исследователи добились улучшения FRET с помощью многослойных наночастиц ядро-оболочка, чтобы воспользоваться преимуществом явления, известного как флуоресценция, усиленная металлами.Размещение донорно-акцепторных пар вокруг металлических наночастиц или рядом с ними приводит к взаимодействию между локальным электрическим полем от источника возбуждения, электронами в металле и электрическим диполем, индуцированным в молекулах красителя, увеличивая силу донорно-акцепторных взаимодействий и, таким образом, улучшая Эффективность FRET.

Дени Будро, профессор аналитической химии и член Центра оптики, фотоники и лазеров Университета Лаваля в Квебеке, понял, что эффективность этого подхода сильно зависит от разделения металла и флуорофора, и поэтому исследователи мог максимально увеличить его, получая точный контроль над этим расстоянием.С этой целью в статье Nano Letters, опубликованной в Интернете 15 июля, он и другие сотрудники его лаборатории — докторант Матье Лессар-Вигер при поддержке аспирантов Максима Риу и Люка Рейнвилля — сообщили об исследовании, в котором они изготовили наночастицы типа ядро-оболочка. и химически привитые молекулы флуорофора в концентрических оболочках из диоксида кремния, чтобы они могли произвольно регулировать расстояние между флуорофором и металлом для оптимизации усиления FRET.

Эти новые люминесцентные наночастицы имеют два важных преимущества, сказал Будро.Во-первых, они приводят к значительному увеличению интенсивности флуоресценции. Исследователи сообщили о пятнадцатикратном увеличении количества частиц, используемых в исследовании Nano Letters, и ожидают еще большего увеличения при использовании более тонких разделительных оболочек в своей конструкции. Что еще более важно, использование наночастиц привело к значительному увеличению FRET.

Будро и его коллеги рассчитали, что эффективность передачи энергии между донором и акцептором составляет 56 процентов, в отличие от эффективности только 12 процентов для наночастиц, у которых металлическая сердцевина была вытравлена.Кроме того, они отметили, что расстояние Ферстера — диапазон, при котором эффективность передачи энергии составляет 50 процентов — было на 30 процентов выше, чем опубликованное для системы флуоресцеин-эозин.

Это увеличение расстояния Ферстера позволяет рекомендовать наночастицы для различных применений в визуализационной микроскопии и биодатчиках, пояснил Будро; например, путем конъюгирования их с биомолекулами и использования в качестве донорно-акцепторных пар дальнего действия.

Исследователи продолжают разрабатывать наночастицы, ориентируясь на эти и другие приложения, включая сверхчувствительное обнаружение ДНК.Они также планируют адаптировать их к мультиплексной передаче сигналов, варьируя их красители и относительные концентрации, а также настраивая сигнатуры излучения.

Биолюминесцентный резонансный перенос энергии
Биолюминесцентный резонансный перенос энергии, или BRET, представляет собой еще один важный шаг вперед в этой области. Этот метод, в котором используются биолюминесцентный донор и флуоресцентный акцептор, преодолевает многие препятствия, связанные с методами на основе FRET. Во-первых, поскольку он не требует внешнего источника возбуждения, как последние методы, он менее дорог и обеспечивает повышенную эффективность для приложений in vivo.Кроме того, он не имеет тех же проблем, что и FRET, с фотообесцвечиванием и одновременным возбуждением донорных и акцепторных флуорофоров и, как следствие, предлагает значительно сниженный фоновый шум. Наконец, он более совместим с светочувствительными тканями, чем методы на основе FRET.


Ученые описали метод биолюминесцентного резонансного переноса энергии, в котором люцифераза Renilla используется в качестве биолюминесцентного донора, а квантовые точки — в качестве акцепторов. В описанной системе используются два зонда: один, конъюгированный с люциферазой Renilla и комплементарный целевой последовательности (зонд Rluc на этом рисунке), другой, конъюгированный с квантовой точкой и гомологичный целевой последовательности (целевой зонд).Когда нуклеиновая кислота-мишень отсутствует, два зонда гибридизуются, приближая люциферазу и квантовую точку друг к другу и, таким образом, производя сигнал BRET.

Лаборатория Део занимается разработкой основанных на BRET методов количественного определения микроРНК. По ее словам, микроРНК играют важную роль в регуляции генов и, таким образом, привлекают внимание как клинически как биомаркеры заболеваний, так и в фундаментальных биомедицинских исследованиях. Исследователи в лаборатории разработали методику на основе BRET, в которой люцифераза Renilla используется в качестве биолюминесцентного донора и квантовые точки в качестве акцепторов, и они описали ее использование для обнаружения ДНК.Сообщаемая система BRET использует два линейных олигонуклеотидных зонда. Первый, конъюгированный с люциферазой Renilla, комплементарен целевой последовательности. Другой, конъюгированный с квантовой точкой, гомологичен целевой последовательности. Два зонда гибридизуются, когда нуклеиновая кислота-мишень отсутствует, сближая люциферазу и квантовую точку и создавая сигнал BRET.

Однако, когда целевая нуклеиновая кислота присутствует, она конкурирует с зондом люциферазы за гибридизацию зонда квантовой точки.Это приводит к снижению сигнала BRET и увеличению эмиссии люциферазы, что позволяет исследователям измерять нуклеиновую кислоту.

Для количественного определения ДНК исследователи построили калибровочную кривую соотношения BRET в зависимости от целевой концентрации. Они рассчитали отношение BRET как интенсивность биолюминесценции при 485 нм, деленную на интенсивность биолюминесценции при 705 нм. Основываясь на полученном соотношении, они количественно определили количество ДНК-мишени по уравнению калибровочной кривой.

Исследователи продолжают развивать методику и работают над мультиплексным обнаружением нуклеиновых кислот-мишеней в фазе раствора. Это может быть достигнуто с помощью нескольких спектрально различных квантовых точек. Из-за их перекрывающихся спектров поглощения несколько квантовых точек можно возбуждать одновременно с помощью одного источника, такого как люцифераза Renilla.

«Таким образом, — сказал Део, — используя люциферазу Renilla в качестве доноров BRET и несколько квантовых точек в качестве акцепторов BRET, можно добиться мультиплексного обнаружения.Последовательности ДНК олигонуклеотидных зондов необходимо изменить только для специфической гибридизации с их соответствующими мишенями ».

См. Также: Дополнительные веб-сайты


Разработка индикаторов на основе FRET для визуализации гомофильного транс-взаимодействия кластеризованного протокадгерина

  • 1.

    Кохмура, Н. и др. Разнообразие, выявленное новым семейством кадгеринов, экспрессируемых в нейронах синаптического комплекса Neuron 20 , 1137–1151.https://doi.org/10.1016/s0896-6273(00)80495-x (1998).

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 2.

    Wu, Q. & Maniatis, T. Поразительная организация большого семейства генов адгезии человеческих нейронных кадгерин-подобных клеток. Ячейка

    97 , 779–790. https://doi.org/10.1016/s0092-8674(00)80789-8 (1999).

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 3.

    Esumi, S. et al. Моноаллельная, но комбинаторная экспрессия вариабельных экзонов кластера генов протокадгерина-α в отдельных нейронах. Nat. Genet. 37 , 171–176. https://doi.org/10.1038/ng1500 (2005).

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 4.

    Kaneko, R. et al. Аллельная генная регуляция кластеров Pcdh-α и Pcdh-γ , включающая как моноаллельную, так и двуаллельную экспрессию в отдельных клетках Пуркинье. J. Biol. Chem. 281 , 30551–30560. https://doi.org/10.1074/jbc.M605677200 (2006).

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 5.

    Hirano, K. et al. Разнообразие одиночных нейронов, генерируемое кластером протокадгерина-β в центральной и периферической нервной системе мышей. Перед. Мол. Neurosci. 5 , 90. https://doi.org/10.3389/fnmol.2012.00090 (2012).

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 6.

    Schreiner, D. & Weiner, J. A. Комбинаторное гомофильное взаимодействие между мультимерами гамма-протокадгерина значительно увеличивает молекулярное разнообразие клеточной адгезии. Proc. Natl. Акад. Sci. USA 107 , 14893–14898. https://doi.org/10.1073/pnas.1004526107 (2010).

    ADS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 7.

    Thu, C. A. et al. Одноклеточная идентичность, порожденная комбинаторными гомофильными взаимодействиями между протоколами α, β и γ. Ячейка 158 , 1045–1059. https://doi.org/10.1016/j.cell.2014.07.012 (2014).

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 8.

    Рубинштейн, Р., Гудман, К. М., Маниатис, Т., Шапиро, Л. и Хониг, Б. Структурное происхождение кластерного протокадгерин-опосредованного нейронного штрих-кодирования. Семин. Cell Dev. Биол. 69 , 140–150. https://doi.org/10.1016/j.semcdb.2017.07.023 (2017).

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 9.

    Mountoufaris, G., Canzio, D., Nwakeze, C. L., Chen, W. V. & Maniatis, T. Написание, чтение и перевод кластерного кода распознавания поверхности клеток протокадгерина для сборки нейронной цепи. Annu. Rev. Cell Dev. Биол. 34 , 471–493. https://doi.org/10.1146/annurev-cellbio-100616-060701 (2018).

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 10.

    Панчо А., Аэртс Т., Мицогианнис М. Д. и Сюнтьенс Е. Протокадгерины на перекрестке сигнальных путей. Перед. Мол. Neurosci. 13 , 117. https://doi.org/10.3389/fnmol.2020.00117 (2020).

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 11.

    Лефевр, Дж. Л., Костадинов, Д., Чен, В. В., Маниатис, Т. и Санес, Дж. Р. Протокадгерины опосредуют дендритное самопроизвольное избегание в нервной системе млекопитающих. Природа 488 , 517–521. https://doi.org/10.1038/nature11305 (2012).

    ADS CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 12.

    Костадинов Д. и Санес Дж. Р. Протокадгерин-зависимое самопроизвольное избегание дендритов регулирует нейронные связи и функцию контуров. Элиф 4 , e08964. https://doi.org/10.7554/eLife.08964 (2015).

    Артикул PubMed Central Google Scholar

  • 13.

    Ing-Esteves, S. et al. Комбинаторные эффекты альфа- и гамма-протокадгеринов на выживаемость нейронов и самопроизвольное избегание дендритов. J. Neurosci. 38 , 2713–2729. https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.3035-17.2018 (2018).

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 14.

    Hasegawa, S. et al. Семейство протокадгеринов-α участвует в слиянии аксонов обонятельных сенсорных нейронов в клубочки обонятельной луковицы у мышей. Мол. Клетка. Neurosci. 38 , 66–79. https://doi.org/10.1016/j.mcn.2008.01.016 (2008).

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 15.

    Mountoufaris, G. et al. Разнообразие Multicluster Pcdh необходимо для сборки обонятельной нейронной цепи мыши. Наука 356 , 411–414. https://doi.org/10.1126/science.aai8801 (2017).

    ADS CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 16.

    Katori, S. et al. Семейство протокадгеринов-α необходимо для серотонинергических проекций, чтобы должным образом иннервировать целевые области мозга. J. Neurosci. 29 , 9137–9147. https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.5478-08.2009 (2009 г.).

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 17.

    Katori, S. et al. Protocadherin-αC2 необходим для диффузных проекций серотонинергических аксонов. Sci. Реп. 7 , 15908. https://doi.org/10.1038/s41598-017-16120-y (2017).

    ADS CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 18.

    Chen, W. V. et al. PcdhαC2 необходим для облицовки аксонов и сборки серотонинергических цепей у мышей. Наука 356 , 406–411. https://doi.org/10.1126/science.aal3231 (2017).

    ADS CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 19.

    Гарретт А.М., Шрейнер Д., Лобас М.А. и Вайнер Дж. А. γ-Протокадгерины контролируют образование кортикальных дендритов, регулируя активность сигнального пути FAK / PKC / MARCKS. Нейрон 74 , 269–276. https://doi.org/10.1016/j.neuron.2012.01.028 (2012).

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 20.

    Suo, L., Lu, H., Ying, G., Capecchi, M. R. & Wu, Q. Кластеры протокадгеринов и киназа клеточной адгезии регулируют сложность дендритов через Rho GTPase. J. Mol. Cell Biol. 4 , 362–376. https://doi.org/10.1093/jmcb/mjs034 (2012 г.).

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 21.

    Молумби, М. Дж., Киллер, А. Б. и Вайнер, Дж. А. Гомофильные межклеточные взаимодействия протокадгерина способствуют усложнению дендритов. Cell Rep. 15 , 1037–1050. https://doi.org/10.1016/j.celrep.2016.03.093 (2016).

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 22.

    Molumby, M. J. et al. γ-Протокадгерины взаимодействуют с нейролигином-1 и негативно регулируют морфогенез дендритного шипа. Cell Rep. 18 , 2702–2714. https://doi.org/10.1016/j.celrep.2017.02.060 (2017).

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 23.

    Steffen, D. M. et al. γ-Протокадгерины физически и функционально взаимодействуют с нейролигином-2, чтобы негативно регулировать плотность тормозных синапсов и необходимы для нормального социального взаимодействия. Мол. Neurobiol. 58 , 2574–2589. https://doi.org/10.1007/s12035-020-02263-z (2021 г.).

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 24.

    Reiss, K. et al. Регулируемое ADAM10-зависимое отщепление эктодомена гамма-протокадгерина C3 модулирует клеточную адгезию. J. Biol. Chem. 281 , 21735–21744. https://doi.org/10.1074/jbc.M602663200 (2006).

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 25.

    Rubinstein, R. et al. Молекулярная логика самопознания нейронов через взаимодействия протокадгериновых доменов. Ячейка 163 , 629–642. https://doi.org/10.1016/j.cell.2015.09.026 (2015).

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 26.

    Goodman, K. M. et al. Структурная основа разнообразного гомофильного распознавания кластеризованными α- и β-протокадгеринами. Нейрон 90 , 709–723. https://doi.org/10.1016/j.neuron.2016.04.004 (2016).

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 27.

    Goodman, K. M. et al. γ-Протокадгерин структурное разнообразие и функциональное значение. Элиф 5 , e20930. https://doi.org/10.7554/eLife.20930 (2016).

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 28.

    Goodman, K. M. et al. Protocadherin cis -димерная архитектура и разнообразие единиц распознавания. Proc. Natl. Акад. Sci. США 114 , E9829 – E9837. https://doi.org/10.1073/pnas.1713449114 (2017).

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 29.

    Ozawa, M. & Kemler, R. Изменение активности клеточной адгезии перванадатом из-за диссоциации α-катенина от комплекса E-кадгерин-катенин. J. Biol. Chem. 273 , 6166–6170. https://doi.org/10.1074/jbc.273.11.6166 (1998).

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 30.

    Страйер, Л. и Хогланд, Р. П. Передача энергии: спектроскопическая линейка. Proc. Natl. Акад. Sci. США 58 , 719–726. https://doi.org/10.1073/pnas.58.2.719 (1967).

    ADS CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 31.

    Greenwald, E.C., Mehta, S. & Zhang, J. Генетически закодированные флуоресцентные биосенсоры освещают пространственно-временную регуляцию сигнальных сетей. Chem. Ред. 118 , 11707–11794. https://doi.org/10.1021/acs.chemrev.8b00333 (2018).

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 32.

    Ким, С. А., Тай, С. Ю., Мок, Л. П., Моссер, Э. А., Шуман, Э. М. Кальций-зависимая динамика взаимодействий кадгерина в межклеточных соединениях. Proc. Natl. Акад. Sci. USA 108 , 9857–9862. https://doi.org/10.1073/pnas.101

    08 (2011 г.).

    ADS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 33.

    Fernàndez-Monreal, M., Kang, S. & Phillips, G.R. Гомофильное взаимодействие и внутриклеточный трафик гамма-протокадгерина контролируются цитоплазматическим доменом в нейронах. Мол. Клетка. Neurosci. 40 , 344–353.https://doi.org/10.1016/j.mcn.2008.12.002 (2009).

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 34.

    Feinberg, E. H. et al. Восстановление GFP через синаптические партнеры (GRASP) определяет клеточные контакты и синапсы в живых нервных системах. Нейрон 57 , 353–363. https://doi.org/10.1016/j.neuron.2007.11.030 (2008).

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 35.

    Kim, J. et al. mGRASP позволяет картировать синаптические связи млекопитающих с помощью световой микроскопии. Nat. Методы 9 , 96–102. https://doi.org/10.1038/nmeth.1784 (2011 г.).

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 36.

    Tsetsenis, T., Boucard, A. A., Araç, D., Brunger, A. T. & Südhof, T. C. Прямая визуализация транс-синаптических взаимодействий нейрексин-нейролигин во время образования синапсов. J. Neurosci. 34 , 15083–15096. https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.0348-14.2014 (2014).

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 37.

    Choi, J. H. et al. Межрегиональные синаптические карты среди клеток инграммы лежат в основе формирования памяти. Наука 360 , 430–435. https://doi.org/10.1126/science.aas9204 (2018).

    ADS CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 38.

    Kinoshita, N. et al. Генетически закодированный флуоресцентный индикатор GRAPHIC очерчивает межклеточные связи. Наука 15 , 28–38. https://doi.org/10.1016/j.isci.2019.04.013 (2019).

    CAS Статья Google Scholar

  • 39.

    Kinoshita, N., Huang, A. J. Y., McHugh, T. J., Miyawaki, A. & Shimogori, T. Diffusible GRAPHIC для визуализации морфологии клеток после специфического межклеточного контакта. Sci. Реп. 10 , 14437. https://doi.org/10.1038/s41598-020-71474-0 (2020).

    ADS CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 40.

    Hasegawa, S. et al. Кластерные протокадгерины необходимы для построения функциональных нейронных цепей. Перед. Мол. Neurosci. 10 , 114. https://doi.org/10.3389/fnmol.2017.00114 (2017).

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 41.

    Fujii, Y. et al. PA tag: универсальная система маркировки белков с использованием антитела со сверхвысокой аффинностью против додекапептида, полученного из подопланина человека. Protein Expr. Purif. 95 , 240–247. https://doi.org/10.1016/j.pep.2014.01.009 (2014).

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 42.

    Shibata, H. et al. Новая роль аннексина A11 в раннем секреторном пути посредством стабилизации белка Sec31A в сайтах выхода эндоплазматического ретикулума (ERES). J. Biol. Chem. 290 , 4981–4993. https://doi.org/10.1074/jbc.M114.5 (2015).

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 43.

    Kanadome, T., Shibata, H., Kuwata, K., Takahara, T. & Maki, M. Кальций-связывающий белок ALG-2 способствует локализации места выхода эндоплазматического ретикулума и полимеризации Trk-слитых ген (TFG) белок. FEBS J. 284 , 56–76. https: // doi.org / 10.1111 / febs.13949 (2017).

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • Основы FRET-микроскопии | Nikon’s MicroscopyU

    Считается, что в живых клетках динамические взаимодействия между белками играют ключевую роль в регулировании многих путей передачи сигналов, а также вносят вклад в широкий спектр других критических процессов. В прошлом подходы классической биохимии к выяснению механизма таких взаимодействий были обычным явлением, но слабые или временные взаимодействия, которые могут происходить в естественной клеточной среде, обычно прозрачны для этих методов.Например, совместная локализация предполагаемых белковых партнеров с использованием иммунофлуоресцентной микроскопии в фиксированных клетках была популярным методом исследования взаимодействий in situ , и на основе этого метода были представлены многочисленные литературные отчеты. Однако, поскольку разрешение флуоресцентного микроскопа в несколько сотен раз меньше размера типичного белка, совместная локализация часто приводит к сомнительным результатам. Прекрасная аналогия состоит в том, что флуоресцентная микроскопия дает информацию, эквивалентную знанию того, что два студента присутствуют в большом лекционном зале.Он не предлагает разрешения, необходимого для определения того, находятся ли студенты в одном классе или, что еще лучше, сидят ли они за соседними партами.

    Рисунок 1 — Фёрстеровский резонансный перенос энергии Диаграмма Яблонски

    Типичные методы флуоресцентной микроскопии основаны на поглощении флуорофором света на одной длине волны (возбуждение) с последующим испусканием вторичной флуоресценции на более длинной длине волны.Длины волн возбуждения и излучения часто отделены друг от друга на десятки и сотни нанометров. Мечение клеточных компонентов, таких как ядра, митохондрии, цитоскелет, аппарат Гольджи и мембраны, специфическими флуорофорами позволяет их локализовать в фиксированных и живых препаратах. Путем одновременного мечения нескольких субклеточных структур отдельными флуорофорами, имеющими отдельные спектры возбуждения и излучения, можно использовать специальные комбинации флуоресцентных фильтров для изучения близости меченых молекул в пределах одной клетки или участка ткани.При использовании этого метода молекулы, которые расположены ближе друг к другу, чем предел оптического разрешения, по-видимому, совпадают (и говорят, что совмещают ). Эта очевидная пространственная близость подразумевает, что молекулярная ассоциация возможна. В большинстве случаев, однако, нормального разрешения флуоресцентного микроскопа с ограничением дифракции недостаточно, чтобы определить, действительно ли имеет место взаимодействие между биомолекулами.

    Измерения совместной локализации в лучшем случае наводят на размышления, а в худшем — вводят в заблуждение, особенно с учетом того, что многие сигнальные пути используют одну и ту же клеточную структуру, как, например, покрытые клатрином ямки, которые используются для интернализации многих рецепторных комплексов.Знание о том, что две молекулы или белки на самом деле являются смежными, а не просто находятся в одном и том же районе, обеспечивает значительно более надежное определение их потенциала для взаимодействия. Проверенная временем методика электронной микроскопии имеет достаточное разрешение для удовлетворения требований высокоточной локализации, но просто не имеет точной методологии маркировки, необходимой для получения надежных результатов. Кроме того, многие методы совместной локализации обычно применяются для использования в фиксированных клетках, что исключает очень желательные динамические измерения, достижимые с помощью анализов в живых клетках.Флуоресцентная визуализация с использованием многоцветных флуоресцентных белков позволяет легко проводить эксперименты с живыми клетками, которые необходимы для анализа переходного взаимодействия, но этот подход страдает из-за относительно низкого пространственного разрешения, ограниченного примерно 200 нанометрами.

    Ограничения в определении пространственной близости белковых молекул можно преодолеть, применив методы микроскопии Фёрстера (или флуоресценции) с резонансным переносом энергии ( FRET ). FRET возникает между двумя правильно расположенными флуорофорами только тогда, когда расстояние между ними составляет от 8 до 10 нанометров или меньше.Таким образом, FRET хорошо подходит для исследования белковых взаимодействий, которые происходят между двумя молекулами, расположенными на расстоянии нескольких нанометров друг от друга. За последние десять лет подходы FRET приобрели популярность из-за роста приложений, требующих генетического нацеливания на определенные белки и пептиды с использованием слияния с зеленым флуоресцентным белком ( GFP ) и его мутантными производными. FRET между двумя спектрально различными флуоресцентными белками (известный как FP-FRET ) широко применяется для двух четко отдельных экспериментальных методик, как обсуждается ниже.Представлено в Рис. 1 — это энергетическая диаграмма Яблонского, иллюстрирующая связанные переходы возбужденного состояния между испусканием донора и поглощением акцептора в FRET. Абсорбционные и эмиссионные переходы представлены прямыми вертикальными стрелками (синими, зелеными и красными), а колебательная релаксация обозначена волнистыми желтыми стрелками. Связанные переходы показаны пунктирными линиями, что указывает на их правильное расположение на диаграмме Яблонского, если они возникли в результате опосредованных фотонами электронных переходов.В присутствии подходящего акцептора донорный флуорофор может передавать энергию возбужденного состояния непосредственно акцептору, не испуская фотон (показано фиолетовой стрелкой на рис. 1 , ). Результирующая флуоресценция , сенсибилизированная эмиссия имеет характеристики, аналогичные спектру эмиссии акцептора.

    Одним из основных препятствий на пути широкого внедрения исследований FRET в живых клетках было отсутствие подходящих методов мечения конкретных внутриклеточных белков соответствующими флуорофорами.Недавняя разработка флуоресцентных белков, обладающих широким спектром спектральных профилей, и возрастающая сложность белковых химер (гибридных, а также биосенсоров) привели к появлению ряда потенциальных пар флуоресцентных белков, которые можно использовать в экспериментах FRET. Применение флуоресцентных белков к FRET включает либо интеграцию выбранной пары в биосенсор (единая генетически кодируемая конструкция), либо проведение межмолекулярных измерений между двумя отдельными белками, каждый из которых слит с другим флуоресцентным белком.Последний подход был использован для визуализации различных белковых взаимодействий, включая олигомеризацию рецепторов и выяснение функций факторов транскрипции. Однако проведение FRET-анализов на независимо экспрессируемых химерных белках намного сложнее из-за изменчивой стехиометрии, которая неизбежно возникает, когда отдельные флуоресцентные объекты экспрессируются в живых клетках. Независимо от сложности, эксперименты подобного рода могут дать информативные результаты, если установлены соответствующие элементы управления и исследование проводится с высокой точностью.

    Флуоресцентные белковые биосенсоры

    Флуоресцентные белковые биосенсоры нашли широкое применение при составлении отчетов о разнообразных внутриклеточных процессах. Благодаря творческому слиянию пар флуоресцентных белков с биополимерами, которые выполняют критические функции, связанные с различными аспектами физиологической передачи сигналов, ученые-исследователи разработали множество новых молекулярных зондов, которые можно использовать для оптической визуализации живых клеток таких важных процессов, как индукция кальциевой волны, цикличность. эффекты посланника нуклеотидов, изменения pH, колебания мембранного потенциала, фосфорилирование и действие внутриклеточной протеазы.Альтернативная, но весьма полезная стратегия конструирования биосенсора включает модификации самой структуры основной цепи флуоресцентного белка, либо для разделения пептида на отдельные единицы, которые объединяются in vivo для получения флуоресценции (метод, названный Bi -Molecular F luorescence C omplementation; BiFC ) или для соединения природных амино- и карбоксиконцев вместе и создания сайта встраивания в молекуле для сенсорного пептида.

    Первым флуоресцентным белковым биосенсором был индикатор кальция под названием cameleon , сконструированный путем смещения белка кальмодулина и кальций-кальмодулин-связывающего домена киназы легкой цепи миозина (домен M13 ) между усиленными синими и зелеными флуоресцентными белками ( EBFP ). и EGFP ). В присутствии возрастающих уровней внутриклеточного кальция домен M13 связывает пептид кальмодулин, вызывая увеличение FRET между флуоресцентными белками.К сожалению, этому датчику мешал очень низкий динамический диапазон (увеличение флуоресценции в 1,6 раза), и его было трудно визуализировать из-за недостаточной яркости и плохой фотостабильности EBFP. Улучшенные версии с использованием той же матрицы включали голубой и желтый варианты ECFP и EYFP для получения более высоких уровней сигнала, и даже лучшие результаты были получены, когда производные YFP ​​(названные camgaroos ) были получены путем вставки кальций-чувствительных пептидов на начало седьмой beta -цепи в основной цепи флуоресцентного белка.Сенсорные пептиды, расположенные в этом необычном положении, довольно хорошо переносятся с точки зрения поддержания высокого уровня флуоресценции. Еще одна стратегия использует преимущества уникальной бочкообразной структуры, характерной для флуоресцентных белков, для изменения конфигурации концов белка путем связывания естественных концов N и C и создания нового стартового кодона в одном из нескольких мест в центральной области строение (обычно в петлях). Эти структурно модифицированные производные, названные циркулярно пермутированными флуоресцентными белками, могут быть слиты с кальмодулином и M13 для получения превосходных биосенсоров кальция.

    Рисунок 2 — Флуоресцентный белковый биосенсор FRET для определения активности протеазы

    За биосенсорами кальция быстро последовали генетические индикаторы pH, фосфорилирования и протеазной активности. Для адаптации флуоресцентных белков в качестве датчиков pH можно использовать два общих подхода. Первый основан на чувствительности флуоресценции EGFP (pKa = 5,9) и EYFP (pKa = 6,5) к кислой среде в сочетании с относительной нечувствительностью других белков, таких как ECFP (pKa = 4.7) или DsRed (pKa = 4,5). Слияние EGFP или EYFP с менее чувствительным флуоресцентным белком создает логометрический зонд, который можно использовать для измерения кислотности внутриклеточных компартментов. Второй подход основан на протонировании нативного (дикого типа) GFP, что приводит к сдвигу бимодальных спектральных профилей нативного белка. Класс зондов под названием pHluorins , производных от wtGFP, демонстрирует сдвиг пика возбуждения с 470 до 410 нанометров при снижении pH.Также были разработаны датчики pH с двойным излучением, у которых есть пики в зеленой и синей областях спектра. Хотя биосенсоры фосфорилирования не могут сообщать об активности киназы в режиме реального времени, они состоят из пептида, содержащего мотив фосфорилирования из конкретной киназы, и связывающего домена для фосфопептида, зажатого между двумя флуоресцентными белками, способными к FRET. Когда биосенсор фосфорилируется киназой, домен связывания фосфопептида связывается с фосфорилированной последовательностью, таким образом вызывая или разрушая FRET.Доказано, что эта простая стратегия позволяет создавать надежные и высокоспецифичные биосенсоры. Как и у многих других биосенсоров, основным недостатком является уменьшенный динамический диапазон.

    Возможно, наиболее широко используемая конструкция биосенсора для скрининга новых или улучшенных пар FRET включает анализ протеазного расщепления (см. , рис. 2, ). Простой мотив состоит из двух флуоресцентных белков, связанных вместе коротким пептидом, который содержит консенсусный сайт расщепления протеазой. Как правило, датчик демонстрирует очень сильную передачу энергии, которая полностью исчезает при расщеплении линкерной последовательности.Поскольку метод обычно имеет высокий уровень динамического диапазона, его можно использовать для скрининга новых голубых и зеленых доноров FRET с желтыми, оранжевыми и красными акцепторами. Самое большое семейство протеазных биосенсоров включает сайт расщепления, чувствительный к одной из протеаз семейства каспаз, что позволяет исследовать сенсор во время индукции апоптоза. За последние несколько лет появилось большое количество новых биосенсоров, использующих как сенсибилизированные флуоресцентные белки, так и пары FRET. Несмотря на сохраняющиеся ограничения динамического диапазона датчиков FRET, использующих производные ECFP и EYFP, эта стратегия получила широкое распространение, вероятно, из-за простоты ратиометрических измерений и легкости конструкции датчика.Без сомнения, появятся новые стратегии с использованием более совершенных комбинаций флуоресцентных белков, которые служат для увеличения динамического диапазона и других свойств этого очень полезного класса зондов.

    Основные принципы FRET

    Фундаментальный механизм FRET включает в себя донорный флуорофор в возбужденном электронном состоянии, который может передавать свою энергию возбуждения ближайшему акцепторному флуорофору (или хромофору) безызлучательным образом через диполь-дипольные взаимодействия на больших расстояниях.Теория, поддерживающая передачу энергии, основана на концепции рассмотрения возбужденного флуорофора как колеблющегося диполя, который может подвергаться обмену энергией со вторым диполем, имеющим аналогичную резонансную частоту. В этом отношении резонансная передача энергии аналогична поведению связанных генераторов, таких как пара камертонов, колеблющихся на той же частоте, или радиоантенна. Напротив, радиационная передача энергии требует испускания и повторного поглощения фотона и зависит от физических размеров и оптических свойств образца, а также от геометрии контейнера и путей волнового фронта.В отличие от радиационных механизмов, резонансный перенос энергии может дать значительный объем структурной информации о донорно-акцепторной паре.

    Резонансная передача энергии нечувствительна к окружающей оболочке растворителя флуорофора и, таким образом, дает молекулярную информацию, уникальную по сравнению с той, которая выявляется с помощью зависящих от растворителя событий, таких как гашение флуоресценции, реакции возбужденного состояния, релаксация растворителя или измерения анизотропии. Основное влияние растворителя на флуорофоры, участвующие в резонансной передаче энергии, — это влияние на спектральные свойства донора и акцептора.Безызлучательный перенос энергии происходит на гораздо больших расстояниях, чем короткодействующие эффекты растворителя, и диэлектрическая природа компонентов (растворителя и макромолекулы хозяина), расположенных между задействованными флуорофорами, очень мало влияет на эффективность резонансной передачи энергии, которая зависит в первую очередь от расстояние между донорным и акцепторным флуорофором.

    Рисунок 3 — Переменные Фёрстера расстояние и коэффициент ориентации в FRET

    Феномен FRET не опосредован испусканием фотонов и, более того, даже не требует, чтобы акцепторный хромофор был флуоресцентным.Однако в большинстве приложений и донор, и акцептор являются флуоресцентными, и возникновение передачи энергии проявляется в тушении донорной флуоресценции и сокращении времени жизни флуоресценции, сопровождаемом также увеличением эмиссии флуоресценции акцептора. Теория резонансного переноса энергии была первоначально разработана Теодором Фёрстером и недавно была названа его именем в честь его вклада. Теория Фёрстера показывает, что эффективность FRET ( E ) изменяется как обратная шестая степень расстояния между двумя молекулами (обозначается r ):

    Формула 1 — Эффективность FRET

    E FRET = 1 / [1 + (r / R 0 ) 6 ]

    , где R (0) — характеристическое расстояние, при котором эффективность FRET составляет 50 процентов, которое можно рассчитать для любой пары флуоресцентных молекул (эта переменная также называется радиусом Фёрстера и более подробно обсуждается ниже).Эффективность FRET теоретической пары флуорофоров (усиленные голубые и желтые флуоресцентные белки) графически продемонстрирована на рис. 3 (а) . Из-за обратной зависимости шестой степени от расстояния между двумя молекулами ( r ) кривая имеет очень резкий спад. Для расстояний меньше R (0) эффективность FRET близка к максимальной, тогда как для расстояний больше R (0) эффективность быстро приближается к нулю. Полезный диапазон для измерения FRET обозначен красной заштрихованной областью на рис. 3 (a) с пределами 0.5 и 1,5 x R (0) . FRET можно эффективно использовать в качестве молекулярной линейки для расстояний, близких к R (0) , и действительно FRET был адаптирован для таких целей в структурной биологии с использованием прецизионных спектроскопических подходов. Однако для большинства приложений в клеточной биологии доступные отношения сигнал / шум ограничивают эксперименты FRET более двоичным считыванием. Фактически, измерение часто может различать только с высоким FRET и с низким FRET или просто между наличием и отсутствием FRET.

    Как обсуждалось ранее, R (0) можно легко вычислить для любой пары флуоресцентных молекул. Значение R (0) в водном (или буферном) растворе определяется довольно простым уравнением с хорошо установленными входными параметрами:

    Формула 2 — R (0)

    R 0 = [2,8 x 10 17 × Κ 2 × Q D × J (λ)] 1/6 нм

    , где Κ (2) или в квадрате каппа представляет коэффициент ориентации между двумя флуорофорными диполями (см. Рисунок 3 (b) для сводки углов, используемых для расчета коэффициента ориентации), Q (D) — квантовый выход донора, Ε (A) — максимальный коэффициент экстинкции акцептора в обратных молях на сантиметр, а J (λ) — интеграл спектрального перекрытия (см. {4} dλ $$

    Хотя математика может показаться сложной, большинство параметров являются константами, которые легко найти в литературе.Два наиболее важных члена, которые обычно требуют дальнейшего объяснения, — это Κ (2) и J (λ) , интеграл перекрытия. Переменная угла ориентации ( Κ (2) ) просто указывает, что связь FRET зависит от угла между двумя флуорофорами во многом так же, как положение радиоантенны может влиять на ее прием. Если донор и акцептор выровнены параллельно друг другу, эффективность FRET будет выше, чем если бы они были ориентированы перпендикулярно.Эта степень совмещения определяет Κ (2) . Хотя Κ (2) может изменяться от нуля до 4, обычно предполагается, что оно равно 2/3, что является средним значением, проинтегрированным по всем возможным углам. Почти для любой реалистичной ситуации Κ (2) близко к 2/3, и обычно исследователь ничего не может сделать, чтобы отрегулировать это значение (хотя некоторые из них жестко прикрепили флуоресцентные белки к интересующим их целевым белкам, что может привести к драматическим эффектам).Интеграл перекрытия, J (λ) , представляет собой область перекрытия между двумя спектрами, как показано на Рис. 4 . Другими параметрами, которые могут влиять на FRET, являются квантовый выход донора и коэффициент экстинкции акцептора. Таким образом, чтобы максимизировать сигнал FRET, исследователь должен выбрать донор с наивысшим квантовым выходом, наиболее поглощающий акцептор и флуорофоры, имеющие значительное перекрытие в своих спектральных профилях. Эта теория неоднократно подтверждалась экспериментом, и нет никаких других механизмов для максимизации FRET для невыровненных флуоресцентных зондов.

    Рисунок 4 — Интеграл перекрытия спектров возбуждения и излучения

    Следует отметить, что каждый из рассмотренных выше параметров влияет на расчет радиуса Ферстера только в шестой степени. Таким образом, удвоение квантового выхода донора приводит к изменению R (0) только на 12,5%. Поскольку почти все флуорофоры, используемые в экспериментах по визуализации FRET, имеют высокие квантовые выходы (более 0,5) и коэффициенты экстинкции (более 50000), диапазон возможных значений радиуса Ферстера ограничен между 4 и 6 нанометрами, а большинство пар FRET имеют средний значение R (0) ~ 5 нм.Учитывая, что эффективность FRET сильно зависит от расстояния, разделяющего пару FRET, а также от относительной ориентации флуорофоров, FRET можно использовать для обнаружения изменений белок-белковых взаимодействий, возникающих в результате изменений аффинности между двумя белками или изменений в подтверждение их привязки. Стоит повторить, что для большинства приложений визуализации FRET в клеточной биологии эксперименты обычно различают только два состояния (FRET и отсутствие FRET), и необходима дополнительная информация, чтобы помочь в молекулярной интерпретации наблюдаемых изменений FRET.

    Факторы, влияющие на измерения FRET

    На практике широкий спектр проблем может усложнить и / или поставить под угрозу измерения FRET, что в конечном итоге приведет к неоднозначным или бессмысленным результатам. Одна из основных проблем заключается в том, что донорные и акцепторные флуорофоры могут иметь существенно разные уровни яркости при совместном отображении. Хотя теоретически это несоответствие не должно быть проблемой, однако на практике, поскольку большинство инструментов могут измерять только ограниченный динамический диапазон, визуализация с помощью двойного флуорофора может привести к тому, что один канал будет насыщенным (для более яркого флуорофора), в то время как другой канал будет преобладать систематическим. шум (для диммерного флуорофора).Таким образом, по возможности лучше использовать донор и акцептор сопоставимой яркости.

    Еще одним фактором, который может ограничить обнаружение FRET, является стехиометрия донор-акцептор, которая находится вне диапазона от 10: 1 до 1:10. Этот фактор может быть серьезным ограничением в измерениях FRET белок-белковых взаимодействий, в которых один партнер может иметь избыточную концентрацию. Основная проблема — измерение небольшого уровня FRET на фоне флуоресцентных меток, которые не проходят FRET.В связи с тем, что на самом деле нет ничего, что можно было бы сделать для улучшения этой ситуации, множество возможных экспериментов по межбелковому взаимодействию, попадающих в эту категорию, просто не подходят для исследования методами FRET. Для описанных выше флуоресцентных белковых биосенсоров, которые сконструированы только с одним донором и акцептором, стехиометрия фиксирована и гарантированно составляет 1: 1; таким образом, эта проблема никогда не возникает, и уровень сигнала остается постоянным, независимо от концентрации биосенсора.

    Наличие сквозного прохождения (также называемого перекрестными помехами и кроссовером ) и перекрестное возбуждение между спектрально перекрывающимися флуорофорами также являются важными проблемами, которые могут затруднить исследования FRET (см. Рисунок 5, ). В некоторых случаях акцептор может быть непосредственно возбужден светом в диапазоне длин волн, выбранном для возбуждения донора ( Рисунок 5 (a) ). Кроме того, флуоресценция от донора может просачиваться в канал обнаружения для флуоресценции акцептора, особенно когда спектральные профили излучения донора и акцептора демонстрируют значительное перекрытие ( Рисунок 5 (b) ).Поскольку эти два источника перекрестных помех возникают из-за фотофизики органических флуорофоров и наверняка будут присутствовать для любой пары FRET, их необходимо учитывать при измерении FRET. Выбор флуорофоров, которые хорошо разделены спектрально, является отличным механизмом для уменьшения перекрестных помех. Однако в большинстве случаев увеличенное спектральное разделение также уменьшает интеграл перекрытия ( J (λ) ), что на практике обычно приводит к снижению способности обнаруживать сигнал FRET.

    Наконец, уровень сигнала FRET может быть уменьшен, если два флуорофора не выровнены должным образом (например, имея значение Κ (2) приблизительно равное нулю) или если они просто не расположены в пределах радиуса Фёрстера. (более 6 нанометров). Например, если два меченых белка взаимодействуют, но флуоресцентные метки расположены на противоположных сторонах комплекса, то может не быть обнаруживаемого сигнала FRET, даже если интересующие белки связаны.В общей практике этот тип ложноотрицательных довольно распространен, особенно с флуоресцентными белками-партнерами FRET. Часто требуется несколько стратегий мечения, прежде чем будет обнаружен достаточный и надежный сигнал FRET. Однако каждую из описанных выше проблем можно смягчить (или частично) путем осознанного выбора пары флуорофоров, которая будет использоваться до создания векторных конструкций или проведения экспериментов по синтетическому мечению.

    Рисунок 5 — Спектральное просвечивание (перекрестные помехи) в парах CFP-YFP FRET

    Представлено в Рис. 5 — это перекрытие спектральных профилей возбуждения и испускания ECFP и mVenus, в настоящее время одной из наиболее предпочтительных пар флуоресцентных белков для исследований FRET.Эти два белка демонстрируют значительное перекрытие как в спектрах возбуждения (, фиг. 5 (а), ), так и в спектрах излучения (, фиг. 5 (b), ). Прямое возбуждение акцептора FRET (mVenus; красная кривая) может быть значительным в зависимости от длины волны, используемой для возбуждения донора (ECFP; голубая кривая или mCerulean; синяя кривая) из-за более высокого коэффициента экстинкции желтого белка по сравнению с голубые белки. Это перекрытие особенно проблематично, когда ECFP используется в качестве донора и может быть частично компенсировано использованием вариантов CFP с высокими коэффициентами экстинкции, таких как mCerulean.Обратите внимание, что кривые возбуждения на рис. 5 (a) нанесены в масштабе, чтобы отразить различия в коэффициенте экстинкции между желтым и голубым белками. Возбуждение на 458 нм создает гораздо более высокий уровень перекрестных помех возбуждения в мВенусе, чем при возбуждении на 405 или 440 нм. Широкий спектр излучения флуоресценции ECFP ( Рисунок 5 (b) ) демонстрирует значительное перекрытие интенсивности во всей области излучения mVenus.

    Методы FRET в приложениях клеточной биологии

    Исследователи, использующие флуоресцентные белковые биосенсоры или пытающиеся сопоставить стехиометрию флуоресцентных зондов, слитых с отдельными взаимодействующими мишенями, должны использовать как можно больше различных методов анализа FRET, чтобы установить методологию для данного эксперимента.Такие усилия оправданы, потому что каждая из пар флуоресцентных белков FRET демонстрирует определенную патологию, которая усложняет ее использование, требуя четкого понимания параметров оптической микроскопии, применяемых для измерения относительно небольших разностей сигналов, возникающих в большинстве анализов FRET. После того, как система и возможные результаты будут хорошо установлены, для текущих процедур можно использовать простейшие подходы. Список методов, разработанных для изображения FRET, довольно обширен.В целом, все существующие стратегии измерения FRET могут быть применены к экспериментам с флуоресцентными белками, но, исходя из практических соображений, пять общих подходов оказались особенно полезными:

    • Сенсибилизированная эмиссия — Двухканальная визуализация с использованием алгоритма, который корректирует перекрестные помехи возбуждения и эмиссии
    • Фотообесцвечивание акцептора — Также известный как декушение донора , этот метод измеряет повышенную эмиссию донора при фотообесцвечивании акцептора
    • Флуоресцентная микроскопия времени жизни (FLIM) — Измерение времени жизни донора флуоресцентного белка (или другого флуорофора)
    • Спектральная визуализация — Возбуждение на одной или двух длинах волн и измерение полных спектральных профилей донора и акцептора
    • Флуоресцентная поляризационная визуализация — Измеряйте поляризацию параллельно и перпендикулярно возбуждению с высоким отношением сигнал / шум

    Каждый из перечисленных выше подходов FRET имеет свои сильные и слабые стороны.Например, с одной стороны, двухканальная визуализация — самый простой метод, но требует наиболее сложного набора элементов управления. С другой стороны, FLIM может дать однозначное измерение эффективности FRET, а инструменты доступны для интеграции в конфокальную систему Nikon A1 HD25 / A1R HD25.

    Чувствительное излучение

    Также обычно называемый изображением с двухцветным соотношением цветов с элементами управления, сенсибилизированное излучение, возможно, является самым простым методом визуализации FRET. Донорный флуорофор возбуждается определенной длиной волны (в широкоугольном или конфокальном микроскопе), и сигнал собирается с использованием фильтров излучения, выбранных для флуоресценции донора и флуоресценции акцептора.При (нереальном) отсутствии перекрестных помех между возбуждением и флуоресценцией двух флуорофоров, сенсибилизированное излучение было бы идеальным методом. Однако перекрестные помехи между флуоресцентными белками представляют собой серьезную проблему, и обычно требуются обширные контрольные эксперименты, чтобы установить наличие или отсутствие FRET. Таким образом, при таком подходе сложно получить количественно точные данные FRET. Сенсибилизированное излучение относительно просто настроить на широкоугольном флуоресцентном микроскопе, доступном во многих лабораториях, но необходимые контрольные эксперименты требуют значительной обработки изображений для вычитания компонентов перекрестных помех, что значительно увеличивает уровень шума и неопределенность измерений.

    Для сенсибилизированной эмиссионной FRET-визуализации были разработаны различные корректирующие подходы. Основная концепция включает использование различных комбинаций фильтров с несколькими образцами, которые содержат: только донор, только акцептор и предполагаемый образец FRET как с донором, так и с акцептором. Значения излучения из этих выборок позволяют исследователю определить величину ожидаемых перекрестных помех как в каналах возбуждения, так и в каналах излучения и вычесть их из измерения FRET.Теоретически этот подход работает хорошо, но, к сожалению, потребность в обработке изображений увеличивает уровень шума во всех изображениях. Таким образом, если сигнал FRET слабый, тогда может быть трудно измерить FRET с использованием этого подхода.

    Рисунок 6 — Фотообесцвечивание сенсибилизированного излучения и акцептора FRET

    Несмотря на упомянутые выше трудности, сенсибилизированные измерения излучения могут быть полезны для быстрых динамических экспериментов, в которых сигналы FRET велики из-за возможности одновременного получения обоих изображений.Сенсибилизированное излучение является особенно привлекательным методом при исследовании флуоресцентных белковых биосенсоров, где динамический диапазон FRET велик, а стехиометрия донора и акцептора фиксирована в соотношении 1: 1. Хорошим примером является биосенсор протеазы, показанный на Рис. 2 . Эта химера была сконструирована так, чтобы иметь высокую эффективность FRET, которая снижается практически до нуля, когда пептидный линкер ферментативно расщепляется. Результатом является большое и легко поддающееся измерению изменение FRET, которое демонстрирует специфическую протеазную активность в данный момент времени и в определенной области внутри живой клетки.

    Акцепторное фотообесцвечивание

    Несмотря на то, что оно ограничено только одним измерением, фотообесцвечивание акцептора (или уменьшение густоты донора) также является простым методом, который часто дает отличные результаты. Основная концепция использует тот факт, что флуоресценция донора гасится во время FRET, потому что часть энергии флуоресценции донора передается акцептору. Фотообесцвечивание акцепторного флуорофора необратимо устраняет эффект тушения и увеличивает уровень флуоресценции донора.Если FRET возникает между флуорофорами, флуоресценция донора должна увеличиваться при удалении акцептора. В общем, важно убедиться, что фотообесцвечивание акцептора не ухудшает флуоресценцию донора и чтобы акцептор фотообесцвечивался примерно до 10 процентов от своего первоначального значения. Оба эти ограничения легко выполняются с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа, но также могут быть выполнены с помощью широкоугольных микроскопов или микроскопов с вращающимся диском, оснащенных специальной системой освещения.

    Преимущество акцепторного фотообесцвечивания состоит в том, что он очень простой, количественный и выполняется с использованием только одного образца. Эффективность FRET может быть рассчитана путем вычитания интенсивности донора в присутствии акцептора из его интенсивности после фотообесцвечивания акцептора, а затем нормирования этого значения на интенсивность донора после отбеливания. Основным недостатком является то, что фотообесцвечивание акцептора является деструктивным и может использоваться только один раз на ячейку, что ограничивает его применение теми экспериментами, которые не связаны с динамическими измерениями.Кроме того, фотообесцвечивание — относительно медленный процесс, который часто занимает несколько минут или дольше. Тем не менее, почти всегда целесообразно выполнять измерение фотообесцвечивания акцептора в конце эксперимента, независимо от того, какие методы используются для анализа FRET.

    Представлено в Рис. 6 представляют собой примеры FRET-анализа сенсибилизированного излучения и фотообесцвечивания акцептора с использованием визуализации живых клеток. На Фигуре 6 (a) показана эпителиальная клетка карциномы шейки матки человека (линия HeLa), экспрессирующая биосенсор верблюда, состоящий из mCerulean и mVenus, слитых вместе с промежуточным кальций-чувствительным пептидом, содержащим кальмодулин и домен M13 (описанный выше).Перед добавлением агента, индуцирующего кальций (иономицин), возбуждение клетки с помощью 440-нанометрового освещения вызывает голубую флуоресценцию, указывающую на отсутствие FRET между голубым и желтым флуоресцентными белками ( Рисунок 6 (a) ). После добавления иономицина временная двухцветная визуализация (сенсибилизированная эмиссия) регистрирует кальциевую волну, пересекающую цитоплазму, когда биосенсор реагирует увеличением уровня FRET между флуоресцентными белками ( Рисунки 6 (b) и 6 (c) ) ; FRET — желто-красный псевдоцвет).Клетка почек африканской зеленой мартышки (линия COS-7) в фигуре , фиг.6 (d) — (f), была помечена синтетическими цианиновыми красителями, Cy3 ( фигура 6 (d), ; зеленый) и Cy5 ( фигура 6). (e) ; красный), конъюгированный с B-субъединицей холерного токсина и нацелен на плазматическую мембрану. Внутри мембраны непосредственная близость двух красителей обеспечивает высокий уровень FRET. Фотообесцвечивание Cy5 в выбранной области клетки (белый прямоугольник на рис. 6 (e) ) увеличивает расщепление донора (усиление зеленой флуоресценции на рис. 6 (f) ) в соответствующей области при просмотре флуоресценции в донорском канале Только.

    Флуоресцентная микроскопия для визуализации на протяжении всей жизни (FLIM)

    Измерения срока службы на сегодняшний день являются наиболее строгим методом определения FRET; кроме того, они также менее подвержены артефактам перекрестных помех из-за того, что отслеживается только флуоресценция донора. Все флуоресцентные молекулы демонстрируют экспоненциальное затухание своей флуоресценции в наносекундном масштабе времени, и скорость этого затухания чувствительна к переменным окружающей среде, которые гасят флуоресценцию. Таким образом, основная концепция FLIM отчасти связана с концепцией фотообесцвечивания акцепторов.Флуоресценция донора гасится взаимодействием FRET, и степень гашения может быть определена путем измерения уменьшения времени затухания флуоресценции донора в присутствии FRET. Таким образом, FLIM дает однозначное значение эффективности FRET. Среди преимуществ комбинированных измерений FLIM-FRET — их нечувствительность к артефактам прямого акцепторного возбуждения, а также тот факт, что флуоресцентные доноры могут быть связаны с акцепторами, которые сами не являются флуоресцентными. Оба эти аспекта служат для увеличения числа полезных пар флуоресцентных белков FRET, доступных исследователям.

    Рисунок 7 — Приложения FLIM и спектральной визуализации в FRET-микроскопии

    FLIM имеет несколько ограничений, которые не позволяют ему быть доминирующим методом в визуализации FRET. В первую очередь, измерения в области наносекундного срока службы являются сложными, а оборудование дорогостоящим в получении и обслуживании. Кроме того, этот тип сложного оборудования не является широко доступным. Кроме того, FLIM обычно относится к более медленным методологиям построения изображений, потенциально требующим нескольких минут для получения каждого изображения, что ограничивает его полезность во многих экспериментах с FRET.Эти ограничения могут быть сняты в будущем по мере разработки производителями более удобных и быстрых коммерческих систем «под ключ». Другим существенным недостатком является то, что время жизни флуоресцентных белков в живых клетках часто показывает многоэкспоненциальное затухание, что требует более всестороннего анализа данных для количественных анализов FRET. Более того, локальные факторы окружающей среды, такие как автофлуоресценция или изменение pH, также могут сократить измеряемое время жизни флуоресценции, что приведет к артефактам.Таким образом, следует проявлять большую осторожность при интерпретации данных FLIM-FRET в живых клетках.

    Спектральная визуализация

    Метод спектральной визуализации представляет собой разновидность метода обнаружения сенсибилизированного излучения FRET, но вместо сбора данных через два отдельных канала, весь спектр излучения, содержащий как донорную, так и акцепторную флуоресценцию, собирается при возбуждении донора. Запись всего спектра — типичный подход, используемый для спектроскопических экспериментов, но это относительно недавнее дополнение к инструментальной палитре широкопольной и конфокальной микроскопии.Концепция основана на предпосылке, что сбор всего спектра флуоресценции позволяет разделить перекрывающиеся спектры, используя не только пики излучения, но и различные формы спектральных хвостов. Собирая спектр как от донорного, так и от акцепторного флуорофора, можно определить относительные уровни донорной и акцепторной флуоресценции.

    Метод построения спектральных изображений требует специального оборудования, но превосходные системы доступны для многих коммерческих конфокальных микроскопов и могут быть добавлены к обычным флуоресцентным микроскопам по умеренной цене.Проведение количественного анализа уровня перекрестных помех из-за прямого возбуждения акцептора или использования двух длин волн возбуждения в конфокальной микроскопии позволяет точно определить количество FRET. Принципиальным недостатком этого подхода является пониженное отношение сигнал / шум, связанное с получением полного спектра, а не с его сбором по двум каналам с помощью системы на основе фильтров. Однако по мере того, как разрабатываются и устанавливаются все больше коммерческих систем, применение спектральной визуализации в анализах FRET расширяется.В ближайшем будущем вполне возможно, что спектральная визуализация станет одним из основных методов проведения экспериментов по визуализации FRET.

    Проиллюстрировано в Рис. 7 (a) — это изменения в спаде времени жизни донора (флуоресцентный белок mCerulean) псевдо-FRET биосенсора, состоящего из флуоресцентных белков mCerulean и mVenus, слитых вместе с линкером из 10 аминокислот. Синяя кривая спада показывает время жизни, наблюдаемое в клетках, экспрессирующих только mCerulean, тогда как красная кривая спада представляет время жизни mCerulean, полученное, когда клетки экспрессируют конкатенированные белки.Обратите внимание на уменьшение времени жизни mCerulean, когда белок участвует в резонансной передаче энергии. Область между кривыми представляет собой энергию, которая передается через FRET от mCerulean (донор) к mVenus (акцептор) в паре FRET. Профиль излучения от 450 до 650 нанометров mCerulean-mVenus в том же псевдобиосенсоре при возбуждении на 405 нанометрах в живых клетках изображен красной кривой на Рис. 7 (b) . Передача энергии от mCerulean к mVenus приводит к значительному пику излучения при 529 нанометрах (максимум излучения mVenus) с гораздо меньшим значением (примерно 25 процентов) при длине волны 475 нанометров, максимальной длине волны излучения mCerulean.После фотообесцвечивания mVenus с помощью 514-нанометрового лазера и повторения спектрального сканирования профиль излучения смещается в сторону более низких длин волн и очень напоминает спектр mCerulean в отсутствие партнера FRET. Разница в интенсивности на 475 и 529 нанометрах этих спектральных профилей связана с эффективностью FRET между связанными белками.

    Построение изображений поляризационной анизотропии

    Измерение поляризации флуоресценции дает особые преимущества для высококонтрастной дискриминации флуоресцентного белка FRET.Эта концепция основана на том факте, что при возбуждении поляризованным светом выбирается популяция флуоресцентных молекул, векторы поглощения которых выровнены параллельно вектору поляризации возбуждающего света. Сразу после возбуждения большая часть флуоресцентного излучения будет оставаться поляризованным параллельно возбуждению, так что флуоресценцию можно считать анизотропной с точки зрения поляризации. Анизотропия исчезнет, ​​если молекулы будут вращаться в течение наносекундного времени жизни флуоресценции.Однако, поскольку флуоресцентные белки имеют большие размеры и медленно вращаются, их флуоресценция не деполяризуется в значительной степени во время измерения. Если FRET возникает между двумя флуоресцентными белками, которые слегка смещены, тогда излучение поляризованной флуоресценции будет появляться под другим углом (от вектора возбуждения), что имитирует вращение флуоресцентного белка.

    Рисунок 8 — Получение изображений FRET с поляризационной анизотропией

    Основным достоинством этого подхода является простота измерения поляризации флуоресценции, параллельной и перпендикулярной вектору возбуждения, с высоким отношением сигнал / шум.Поскольку данные о поляризационной анизотропии могут быть получены быстро и с минимальными требованиями к обработке изображений, этот метод хорошо подходит для приложений при просмотре контента с высоким содержанием. Однако следует избегать прямого возбуждения акцептора, поскольку оно может уменьшить донорный сигнал и уменьшить отношение сигнал / шум измерения. Кроме того, хотя этот метод превосходно распознает наличие и отсутствие FRET, он не подходит для различения сильного и слабого FRET.Наконец, поляризация может ухудшаться в объективах с высокой числовой апертурой, поэтому эксперименты с поляризованным FRET следует ограничивать получением изображений с помощью объективов с числовой апертурой 1,0 или меньше.

    Представлено в Рис. 8 представляет собой графическую иллюстрацию поляризационной анизотропии с использованием флуоресцентных белков в качестве модельной системы. Когда случайно ориентированная популяция флуоресцентных белков ( Рисунок 8 (a) ) возбуждается линейно поляризованным светом (голубая волна), предпочтительно возбуждаются только те молекулы, дипольный вектор поглощения которых ориентирован параллельно азимуту поляризации.Эмиссию правильно ориентированных флуоресцентных белков можно наблюдать как сигнал с помощью анализатора, который также параллелен вектору поляризации возбуждающего света (зеленая волна). Результирующая анизотропия, которая является индикатором степени ориентации, может быть определена путем измерения и сравнения интенсивности излучения с помощью вертикально и горизонтально ориентированных анализаторов. Уровень сигнала анизотропии будет уменьшаться, если флуоресцентный белок вращается в масштабе времени эксперимента ( Рисунок 8 (b) ) или если он передает энергию возбуждения, обусловленную FRET, соседнему белку ( Рисунок 8 (c) ), имеющему разная ориентация.Как описано выше, из-за того факта, что резонансная передача энергии может происходить намного быстрее, чем вращение молекул для больших флуоресцентных белковых молекул, деполяризацию из-за FRET можно легко отличить от потери анизотропии, которая происходит во время вращения.

    Рекомендации по использованию флуоресцентных белков в FRET

    Выбор подходящих зондов для исследования FRET в живых клетках ограничен. Синтетические флуорофоры, идеально подходящие для исследований резонансного переноса энергии в фиксированных клетках, трудно вводить и воздействовать на живые клетки.Точно так же квантовые точки можно использовать для маркировки компонентов мембраны для исследования явлений на внешней стороне клетки, но они тоже не могут проникнуть через мембрану и, следовательно, мало используются во внутриклеточных компартментах, таких как ядро, митохондрии или эндоплазматические клетки. сеточка. Генетически кодируемые флуоресцентные белки в настоящее время представляют собой лучших кандидатов для визуализации FRET в живых клетках с высоким разрешением, о чем свидетельствует объем литературы, публикуемой в этой области ежегодно.Однако многие типичные артефакты, которые встречаются при измерении FRET с помощью синтетических флуорофоров и квантовых точек, особенно остро проявляются при применении к флуоресцентным белкам. Например, в отличие от 30-40 нанометров ширины полосы спектральных профилей излучения в синтетических материалах, профили флуоресцентных белков колеблются от примерно 60 до 100 нанометров, что часто приводит к значительному перекрытию при попытке разделить донорную и акцепторную флуоресценцию. Широкий спектр флуоресцентных белков также ограничивает количество зондов, которые можно использовать вместе в FRET и других типах экспериментов по визуализации.Кроме того, флуоресцентные белки демонстрируют широкий диапазон уровней яркости. Например, один из самых популярных белков-доноров, ECFP, имеет в пять раз меньшую яркость, чем его обычный желтый акцепторный партнер EYFP.

    Хромофор флуоресцентного белка окружает полипептид из 220+ аминокислот, намотанный в трехмерную цилиндрическую структуру размером примерно 2,4 на 4,2 нанометра (называемый бета -ствол или бета -кан ) и состоящий из полипептида с обширной водородной связью бета -листов, которые окружают и защищают центральную альфа -спираль, содержащую хромофор (см. фиг.9, ).Концы цилиндра закрыты полеспиральными пептидными участками, которые служат для блокирования проникновения ионов и небольших молекул. Внутренняя часть белка настолько плотно упакована боковыми цепями аминокислот и молекулами воды, что остается мало места для диффузии кислорода, ионов или других вторгающихся небольших молекул, которым удается пройти через концы цилиндра. Эти благоприятные структурные параметры, которые частично отвечают за эластичную фотостабильность и отличные характеристики флуоресцентных белков, также способствуют снижению эффективности FRET.Большой размер цилиндра эффективно защищает соседние хромофоры флуоресцентного белка с пептидными остатками (до предельного расстояния близкого приближения от 2 до 3 нанометров; обозначено красной линией на , рис. 9, ), что приводит к снижению максимальной эффективности FRET до примерно 40 процентов от теоретического значения. Тем не менее, многочисленные преимущества использования флуоресцентных белков для FRET-визуализации живых клеток намного перевешивают затраты.

    Рисунок 9 — Архитектурные особенности флуоресцентного белка

    Высокая степень перекрытия спектральной полосы пропускания и проблемы с размером, которые возникают с флуоресцентными белками, усугубляются их склонностью к олигомеризации.Почти все обнаруженные к настоящему времени флуоресцентные белки демонстрируют, по крайней мере, ограниченную степень четвертичной структуры, о чем свидетельствует слабая тенденция нативного зеленого флуоресцентного белка Aequorea victoria и его производных к димеризации при иммобилизации в высоких концентрациях. Эта тенденция также подтверждается мотивом строгой тетрамеризации природных желтых, оранжевых и красных флуоресцентных белков, выделенных у рифовых кораллов и анемонов. Олигомеризация может быть значительной проблемой для многих приложений в клеточной биологии, особенно в тех случаях, когда флуоресцентный белок сливается с белком-хозяином, который нацелен в конкретное субклеточное место.После экспрессии образование димеров и олигомеров более высокого порядка, индуцированное флуоресцентной белковой частью химеры, может вызывать атипичную локализацию, нарушать нормальную функцию, мешать сигнальным каскадам или ограничивать агрегацию продукта слияния внутри конкретной органеллы или цитоплазмы. Этот эффект особенно заметен, когда флуоресцентный белок сливается с партнерами, которые сами участвуют в образовании природного олигомера. Продукты слияния с белками, которые образуют только слабые димеры (фактически, большинство вариантов Aequorea victoria ) могут не проявлять агрегацию или неправильное нацеливание при условии, что локализованная концентрация остается низкой.Однако, когда слабодимерные флуоресцентные белки нацелены на определенные клеточные компартменты, такие как плазматическая мембрана, локализованная концентрация белка в некоторых случаях может стать достаточно высокой, чтобы допустить димеризацию. Это может вызывать особую озабоченность при проведении межмолекулярных экспериментов FRET, которые могут дать сложные наборы данных, которые иногда могут быть скомпрометированы артефактами димеризации. С другой стороны, естественная слабая димеризация белков Aequorea в некоторых случаях может быть использована для увеличения сигнала FRET в биосенсорах, которые в противном случае демонстрировали бы ограниченный динамический диапазон.

    Токсичность — это проблема, которая возникает из-за чрезмерных концентраций синтетических флуорофоров и чрезмерной экспрессии или агрегации плохо локализованных флуоресцентных белков. Кроме того, здоровье и долговечность оптимально меченных клеток млекопитающих в камерах для получения изображений микроскопа также может пострадать от ряда других вредных факторов. Прежде всего, это вызванное светом повреждение (фототоксичность), которое возникает при многократном воздействии на флуоресцентно меченые клетки света от лазеров и высокоинтенсивных дуговых разрядных ламп.В возбужденном состоянии флуоресцентные молекулы имеют тенденцию реагировать с молекулярным кислородом с образованием свободных радикалов, которые могут повредить субклеточные компоненты и поставить под угрозу всю клетку. Флуоресцентные белки из-за того, что их флуорофоры скрыты глубоко внутри защитной полипептидной оболочки, обычно не фототоксичны для клеток. При разработке экспериментов FRET следует выбирать комбинации флуоресцентных белков, которые демонстрируют максимально длинные волны возбуждения, чтобы минимизировать повреждение клеток коротковолновым освещением, особенно в долгосрочных экспериментах по визуализации.Таким образом, вместо создания продуктов слияния и биосенсоров с синими или голубыми флуоресцентными белками (возбуждаемыми ультрафиолетовым и синим светом соответственно), варианты, излучающие в желтой, оранжевой и красной областях спектра, были бы гораздо более идеальными.

    Исследователи должны позаботиться о проведении необходимых контрольных экспериментов при использовании новых флуоресцентных белковых биосенсоров и клеточных линий, чтобы гарантировать, что артефакты цитотоксичности и фототоксичности не затеняют результаты FRET или другие важные биологические явления.В некоторых случаях липофильные реагенты вызывают вредные эффекты, которые можно спутать с токсичностью флуоресцентных белков во время визуализации клеточных линий после временных трансфекций. Олигомерные флуоресцентные белки (обсуждаемые выше) рифовых кораллов имеют гораздо большую тенденцию к образованию агрегатов (в сочетании с плохой субклеточной локализацией), чем мономерные белки медуз, но неправильно свернутые продукты слияния могут возникать с любым вариантом. Недавно сообщалось о флуоресцентном белке, способном генерировать активные формы кислорода ( ROS, ) при освещении зеленым светом, как об эффективном средстве для инактивации специфических белков с помощью хромофорной инактивации света ( CALI ).Этот генетически закодированный фотосенсибилизатор, получивший соответствующее название KillerRed , способен убивать как бактерии, так и эукариотические клетки при освещении в микроскоп. Предыдущие исследования фототоксичности EGFP показали, что даже благодаря тому, что хромофор способен генерировать синглетный кислород, флуоресцентный белок относительно неэффективен в качестве фотосенсибилизатора. Однако продолжительное освещение клеток, экспрессирующих EGFP и его варианты, может привести к физиологическим изменениям и, в конечном итоге, к гибели клеток, что является определенным сигналом потенциальной фототоксичности в долгосрочных экспериментах по визуализации.

    В экспериментах с живыми клетками флуоресцентные белки очень полезны для расширенной визуализации из-за их более низкой скорости фотообесцвечивания по сравнению с синтетическими флуорофорами. Хотя существует высокая степень некоррелированной вариабельности между флуоресцентными белками с точки зрения фотостабильности, большинство вариантов можно использовать для краткосрочной визуализации (от 1 до 25 снимков), в то время как некоторые из более фотостабильных белков можно использовать в покадровых последовательностях, которые охватывают периоды продолжительностью 24 часа и более (в которых собираются от сотен до тысяч изображений).Однако долговременная стабильность любого конкретного белка должна быть исследована для каждого сценария освещения (широкопольного, конфокального, многофотонного, качающегося поля и т. Д.), Потому что различия в фотостабильности часто наблюдаются с одним и тем же белком, когда освещение создается дугой. -разрядная лампа в сравнении с лазерной системой. Таким образом, с точки зрения фотостабильности выбор флуоресцентных белков продиктован многочисленными параметрами, включая условия освещения, систему экспрессии и эффективность установки визуализации.

    Потенциальный флуоресцентный белок FRET Partners

    За последние несколько лет было разработано и доработано большое количество новых вариантов флуоресцентных белков, чтобы иметь профили излучения, охватывающие 200-нанометровый диапазон (от примерно 450 до 650 нанометров), тем самым заполняя множество пробелов, чтобы предоставить потенциально полезных партнеров FRET. в каждом цветовом классе. Недавние достижения в разработке белков в синей (от 440 до 470 нанометров) и голубой (от 470 до 500 нанометров) спектральных областях позволили получить несколько новых зондов, которые могут быть полезны для визуализации и исследований FRET.Три группы инженерии белков сообщили об улучшенных вариантах флуоресцентного белка синей Aequorea, которые обладают значительно более высокой яркостью и фотостабильностью по сравнению с EBFP. Названные Azurite , SBFP2 (сильно усиленный синий FP) и EBFP2 (см. таблицу 1 ), эти белки дают первую реальную надежду на успешную долгосрочную визуализацию живых клеток в синей спектральной области, и все они могут применяться в сочетании с EGFP и производными в биосенсорах FRET.Самый яркий и самый фотостабильный из новых синих репортеров, EBFP2, демонстрирует типичное GFP-подобное поведение в слияниях и был продемонстрирован как отличный донор FRET для белков в зеленом спектральном классе. Все синие флуоресцентные белки можно легко визуализировать в флуоресцентном микроскопе с использованием стандартных наборов фильтров DAPI или запатентованных наборов BFP, доступных от производителей послепродажного обслуживания.

    Флуоресцентные белки в голубой области спектра широко применялись в качестве доноров FRET в паре с белками, излучающими желтый, и преобладали варианты исходного Aequorea ECFP до появления мономерного репортера бирюзового цвета, известного как мТФП1 .Флуоресцентный белок бирюзового цвета проявляет более высокую яркость и кислотную стабильность по сравнению с CFP Aequorea и является гораздо более фотостабильным. Высокий квантовый выход эмиссии mTFP1 (см. , таблица 1, ) обеспечивает отличную альтернативу циановым производным, mECFP и mCerulean, в качестве донора FRET в сочетании с желтыми или оранжевыми флуоресцентными белками. Дополнительные исследования позволили получить полезные белки в голубом спектральном классе. Среди недавно представленных улучшенных голубых флуоресцентных белков, CyPet и улучшенный голубой вариант, названный Cerulean , наиболее перспективны в качестве кандидатов на использование тегов слияния, биосенсоров FRET и многоцветной визуализации.Церулеан как минимум в 2 раза ярче, чем ECFP, и в исследованиях FRET было продемонстрировано, что он значительно увеличивает контраст, а также отношение сигнал / шум в сочетании с флуоресцентными белками, излучающими желтый цвет, такими как Венера (см. Ниже). Вариант CFP, названный CyPet (от аббревиатуры: Cy — флуоресцентный белок P для передачи e nergy t ), был получен с помощью уникальной стратегии, использующей сортировку клеток с активацией флуоресценции ( FACS ) для оптимизации голубого цвета. и желтая пара для FRET.CyPet примерно вдвое слабее EGFP и на две трети ярче Cerulean, но при 37 градусах Цельсия экспрессирует относительно плохо. Однако CyPet имеет более смещенный в синий цвет и более узкий пик флуоресценции, чем CFP, что значительно увеличивает его потенциал для многоцветной визуализации.

    Введение полезных мутаций сворачивания в мономерные варианты ECFP привело к производству новых вариантов с повышенной яркостью, эффективностью сворачивания, растворимостью и характеристиками FRET.Названные супер CFP ( SCFP ), новые репортеры значительно ярче, чем родительский белок, когда они экспрессируются в бактериях, и почти в два раза ярче в клетках млекопитающих. Эти высокопроизводительные зонды должны быть полезны как для рутинных тегов слияния, так и для создания новых биосенсоров CFP-YFP FRET, демонстрирующих высокий динамический диапазон. Другой новый мономерный циановый репортер, TagCFP , был получен из GFP-подобного белка медузы Aequorea macrodactyla .Конкретные подробности о белке недоступны в литературе, но он коммерчески доступен в виде векторов для клонирования млекопитающих и слияния от Evrogen. Сообщается, что TagCFP ярче, чем ECFP и Cerulean, но имеет аналогичную кислотостойкость. Другой белок, выделяющий циан, Midoriishi-Cyan (сокращенно MiCy ) был первоначально разработан в качестве донора в новой комбинации FRET с мономерным Kusabira Orange ( mKO ; см. Таблица 1 ) для создания биосенсора. с высоким спектральным перекрытием (расстояние Фёрстера 5.3). Этот белок имеет самые длинные профили длины волны поглощения и излучения (472 и 495 нанометров соответственно), о которых сообщалось для любого зонда в голубой области спектра. Высокий молярный коэффициент экстинкции и квантовый выход, демонстрируемые MiCy, придают белку такую ​​же яркость, что и Cerulean.

    Таблица 1 — Свойства выбранных пар флуоресцентных белков FRET 36 36 36 36 36 35 м
    Белковая пара Максимум возбуждения донора
    (нм)
    Максимум эмиссии акцептора
    (нм)
    Квантовый выход донора Коэффициент молярной экстинкции акцептора Яркость Фёрстера 1 1 911 911 911 911
    EBFP2-mEGFP 383 507 0.56 57,500 4,8 1: 2
    ECFP-EYFP 440 527 0,40 83,400 4,9 Venus
    Venus
    528 0,62 92,200 5,4 1: 2
    MiCy-mKO 472 559 0,90 51,600
    492 528 0.85 92,200 5,1 1: 1
    CyPet-YPet 477 530 0,51 104 000 5,1 9 104 000 5,1 1: 4,5
    1: 4,5
    610 0.60 72,000 5,1 2,5: 1
    Venus-mCherry 528 610 0,57 72000 72,000 72000 528 581 0.57 138,000 5,9 1: 2
    Venus-mPlum 528 649 0,57 41,000 5,2 35 13: 1 91

    На сегодняшний день лучшим выбором для визуализации живых клеток репортеров FRET в классе зеленого цвета (от 500 до 525 нанометров) является производное GFP Emerald , которое имеет свойства, аналогичные его родительскому EGFP. Emerald содержит мутации F64L и S65T , представленные в EGFP, но вариант также имеет четыре дополнительных точечных мутации, которые улучшают сворачивание, экспрессию при 37 градусах Цельсия и яркость.Недавно было создано новое дополнение к зеленой спектральной области — суперпапка GFP , которая ярче и устойчивее к кислотам, чем EGFP или Emerald, и имеет аналогичную фотостабильность. Следовательно, вариант суперпапки должен быть отличным кандидатом для слияния с белками млекопитающих и создания биосенсоров FRET, особенно тех, которые демонстрируют проблемы сворачивания со стандартными производными GFP. Другой ярко флуоресцентный репортер, который может быть хорошим кандидатом FRET, называется Azami Green и был выделен из каменистого коралла Galaxeidae и продемонстрировал быстрое созревание во время экспрессии в линиях клеток млекопитающих.Кроме того, сообщалось о двух ярких мономерных репортерах GFP, полученных посредством сайт-направленного и случайного мутагенеза в сочетании со скринингом библиотек в голубых белках. Произведенный от кораллов рода Clavularia , mWasabi является потенциальным альтернативным партнером FRET, излучающим зеленый цвет, для синих флуоресцентных белков из-за незначительного поглощения при 400 нанометрах и ниже, где часто возбуждаются синие варианты. Новый зеленый репортер коммерчески доступен (Allele Biotechnology) и должен быть особенно полезен для двухцветной визуализации в сочетании с белками с длинным стоксовым сдвигом (такими как T-Sapphire ), а также с тегом локализации в слияниях с целевыми белками.Производное TagCFP, названное TagGFP , представляет собой яркий и мономерный зеленый вариант, имеющий максимум поглощения при 482 нанометрах и излучение при 505 нанометрах. TagGFP, который лишь немного ярче EGFP, доступен в виде векторов клонирования и тегов слияния от Evrogen, но не был полностью охарактеризован в литературных отчетах.

    Желтые флуоресцентные белки (от 525 до 555 нанометров) являются одними из самых универсальных генетически закодированных зондов, которые когда-либо были разработаны, и должны предоставить кандидатов, действующих как доноры, так и акцепторы в парах FRET.Варианты, известные как Citrine и Venus , в настоящее время являются наиболее полезными белками в этом спектральном классе (см. , Таблица 1 ), но ни один из них не является коммерчески доступным. Другой вариант, названный в честь камня Topaz , доступен от Invitrogen и был полезен при локализации тегов слияния, внутриклеточной передаче сигналов и исследованиях FRET. Новый член коммерческой серии белков-репортеров локализации Evrogen «Tag», TagYFP , представляет собой производное мономерной медузы ( Aequorea macrodactyla ), которое немного менее яркое, чем EYFP, но на порядок более фотостабильно.Как и его партнеры, TagYFP (пик излучения при 524 нанометрах) не был охарактеризован в литературе, но может быть приобретен как векторы для клонирования млекопитающих или теги слияния.

    Во время того же исследования сортировки клеток с активацией флуоресценции, которое привело к генерации CyPet (обсуждалось выше), был также получен эволюционно оптимизированный комплементарный акцептор FRET, названный YPet . Названный в честь его мастерства в FRET ( Y F P для e nergy t ransfer), YPet является самым ярким желтым вариантом, когда-либо разработанным, и демонстрирует разумную фотостабильность.Устойчивость к кислой среде, обеспечиваемая YPet, превосходит Venus и другие производные YFP, что увеличивает применимость этого зонда в комбинациях биосенсоров, нацеленных на кислые органеллы. Однако, хотя оптимизированная комбинация CyPet-YPet должна быть предпочтительной отправной точкой в ​​разработке новых биосенсоров FRET, остается серьезное сомнение относительно происхождения повышенной производительности YPet, которая, вероятно, связана просто с усиленной димеризацией с его совместно эволюционировавшими. партнер, CyPet.Аналогичным образом, пригодность CyPet и YPet в тегах слияния для экспериментов по локализации, анализа бимолекулярной комплементации и других приложений еще не установлена. Оба белка существуют в растворе в виде слабых димеров, но предположительно могут быть преобразованы в истинные мономеры с использованием мутации A206K, которая так хорошо сработала с другими вариантами Aequorea (хотя это, по-видимому, разрушает их преимущества в FRET).

    Оранжевые флуоресцентные белки, все из которых были выделены из видов коралловых рифов, потенциально могут быть полезны в различных сценариях визуализации FRET.Возможно, наиболее универсальным из них является мономерный Kusabira Orange, белок, первоначально полученный в виде тетрамера из грибного коралла Fungia concinna (известного на японском языке как Kusabira-Ishi ). Мономерная версия Kusabira Orange (сокращенно mKO) была создана путем внесения более 20 мутаций посредством сайт-направленного и случайного мутагенеза. Мономер (коммерчески доступный от MBL International) демонстрирует спектральные свойства, аналогичные тетрамеру, и имеет значение яркости, аналогичное EGFP, но немного более чувствительно к кислой среде, чем его родительский компонент.Однако фотостабильность этого репортера является одной из лучших среди всех белков во всех спектральных классах, что делает mKO отличным выбором для долгосрочных экспериментов по визуализации. Кроме того, спектральный профиль излучения достаточно хорошо отделен от голубых флуоресцентных белков, чтобы повысить эффективность FRET в биосенсорах, включающих mKO, и зонд полезен в многоцветных исследованиях с комбинацией голубых, зеленых, желтых и красных зондов.

    Рисунок 10 — Спаривание флуоресцентного белка FRET с дальним красным акцептором

    Показано на рисунке 10 (), — это спектральные профили ECFP (, рисунок 10 (a), ), EGFP (, рисунок 10 (b), ), EYFP (, рисунок 10 (c), ) и mOrange (, рисунок 10). (d) ), каждый из которых действует как донор FRET для mPlum, акцептора флуоресцентного белка, излучающего дальний красный цвет.Когда спектральные профили излучения доноров смещаются в сторону более длинных волн (от голубого к оранжевому), спектральное перекрытие (закрашенная серая область) и рассчитанное расстояние Ферстера ( R (0) ) соответственно увеличивается. Точно так же перекрестные помехи возбуждения и излучения (области, заштрихованные красным и синим цветом соответственно) также увеличиваются по мере уменьшения расстояния между длинами волн между пиками излучения донора и акцептора. Обратите внимание, что ECFP и mPlum демонстрируют лишь ограниченную степень перекрытия в спектрах возбуждения и практически не перекрываются в спектрах излучения.Напротив, когда mOrange сочетается с mPlum, возникает высокий уровень перекрестных помех как возбуждения, так и излучения. Поскольку цветовая палитра флуоресцентных белков продолжает расширяться, широкий спектр новых пар FRET должен стать легко доступным для исследователей.

    Производное mRFP1 , mOrange , немного ярче, чем mKO, но имеет менее 10% фотостабильности, что серьезно затрудняет его применение в экспериментах, требующих повторного получения изображений.Тем не менее, mOrange остается одним из самых ярких белков в оранжевом спектральном классе и по-прежнему является отличным выбором там, где интенсивность более важна, чем долговременная фотостабильность. Кроме того, в сочетании с T-сапфиром, излучающим зеленый цвет, mOrange является подходящей альтернативой белкам CFP-YFP в качестве пары FRET для создания более длинноволновых биосенсоров и может быть соединен с белками в других спектральных областях для многоцветных исследований. Теперь доступна улучшенная версия mOrange (под названием mOrange2 ) с резко увеличенной фотостабильностью.Яркий новый мономерный белок оранжевого цвета, названный TagRFP , был недавно представлен в качестве кандидата на локализацию и исследования FRET и может оказаться эффективным в большом количестве биосенсорных конструкций. Самый яркий флуоресцентный белок в любом спектральном классе — это тандемная версия димера Tomato (dTomato), производного апельсина, который был одним из исходных белков Fruit . Белок томата содержит первые и последние семь аминокислот из GFP на N — и C — концах, чтобы повысить толерантность к гибридным белкам и уменьшить возможные артефакты в локализации, а также повысить возможность его использования. в биосенсорах FRET.Тандемно-димерная версия (фактически мономер) была создана путем слияния двух копий dTomato «голова к хвосту» с линкером из 23 аминокислот. Благодаря наличию двойных хромофоров полученный tdTomato очень яркий и обладает исключительной фотостабильностью. Основным недостатком использования этого белка является больший размер (вдвое больше мономерного белка), что может мешать упаковке слитого белка в некоторых биополимерах.

    Поиск идеального флуоресцентного белка, излучающего красный цвет, долгое время был целью визуализации живых клеток и целых животных с использованием биосенсоров FRET и слияния, в первую очередь из-за потребности в датчиках в этой спектральной области в экспериментах с многоцветной визуализацией, а также того факта, что что более длинные волны возбуждения вызывают меньшую фототоксичность и могут проникать глубже в биологические ткани.На сегодняшний день сообщается о широком спектре потенциально полезных красных зондов (излучение от 590 до 650 нанометров), многие из которых все еще страдают определенной степенью обязательной четвертичной структуры, обусловленной их разновидностями происхождения. В отличие от белков медуз, большинство природных и генетически модифицированных вариантов белков коралловых рифов созревают очень эффективно при 37 градусах Цельсия. Обширные усилия по исследованию мутагенеза, включая недавно внедренную методологию, были успешно применены в поисках вариантов флуоресцентных белков желтого, оранжевого, красного и дальнего красного цвета, которые еще больше снижают склонность этих потенциально эффективных биологических зондов к самоассоциации, одновременно вызывая выбросы. максимумы в сторону более длинных волн.В результате были улучшены мономерные белки с повышенными коэффициентами экстинкции, квантовыми выходами и фотостабильностью, хотя ни один вариант еще не был оптимизирован по всем критериям.

    Красный mFruit белков, mApple , mCherry и mStrawberry (пики излучения на 592, 610 и 596 нанометрах соответственно), имеют уровни яркости от 50 до 110 процентов EGFP, но mpple и mCherry гораздо более фотостабильны, чем mStrawberry, и являются лучшим выбором для замены mRFP1 в долгосрочных экспериментах по визуализации.Дальнейшее расширение спектрального класса белков mFruit за счет итеративной соматической гипермутации привело к появлению двух новых флуоресцентных белков с максимумами длины волны излучения 625 и 649 нанометров, представляющих первые настоящие дально-красные зонды, созданные генной инженерией. Наиболее потенциально полезный зонд в этой паре был назван mPlum , который имеет довольно ограниченное значение яркости (10 процентов от EGFP), но отличную фотостабильность. Этот мономерный зонд должен быть полезен в сочетании с вариантами, излучающими в голубых, зеленых, желтых и оранжевых областях, для экспериментов с многоцветной визуализацией, а также в качестве биосенсора FRET-партнера с зелеными и желтыми белками, такими как изумруд и цитрин (см. , рисунок 10, ). .Несколько дополнительных красных флуоресцентных белков, показывающих различную степень перспективности, были выделены из организмов рифовых кораллов. Применение сайт-специфического и случайного мутагенеза к вариантам TurboRFP с последующим скринингом мутаций, проявляющих дальнюю красную флуоресценцию, привело к димерному белку, названному Katushka (максимум излучения 635 нанометров). Хотя яркость «Катушки» составляет всего две трети от EGFP, она демонстрирует самые высокие уровни яркости среди всех флуоресцентных белков в спектральном окне, охватывающем от 650 до 800 нанометров, области, которая важна для визуализации глубоких тканей.Введение четырех основных мутаций катушки в TagRFP привело к получению мономерного белка дальнего красного цвета, названного mKate , который имеет сходные спектральные характеристики. Сообщается, что фотостабильность mKate является исключительной, и белок демонстрирует яркость, аналогичную яркости mCherry, что делает его отличным кандидатом для локализации и экспериментов FRET в дальней красной части спектра.

    Несмотря на значительные успехи в расширении флуоресцентной цветовой палитры на оранжевую, красную и дальнюю красную области спектра, голубой и желтый производные Aequorea остаются наиболее полезным сценарием сочетания для разработки полезных биосенсоров.Это непредвиденное несоответствие происходит из-за того, что большинство белков, полученных из оранжевого и красного коралла, демонстрируют относительно широкий спектральный профиль поглощения, имеющий длинный хвост возбуждения, который простирается в фиолетовую и голубую области, таким образом вызывая прямое акцепторное возбуждение. Другой фактор, который может иметь значение, — это относительная скорость созревания слитых флуоресцентных белков-партнеров. В большинстве случаев варианты, полученные из белков Aequorea , созревают гораздо быстрее, чем варианты, полученные из рифовых кораллов, поэтому возможно, что незрелые акцепторы вносят вклад в слабую сенсибилизированную эмиссию, проявляемую многими белками, полученными из кораллов.Кроме того, широкие спектры адсорбции оранжевого и красного белков в сочетании со сниженными квантовыми выходами мономерных версий, вероятно, затрудняют их использование в FRET. Будущий успех экспериментального дизайна флуоресцентного белка FRET будет сосредоточен, среди прочего, на согласовании скоростей созревания парных белков.

    Выводы

    Хотя эксперименты FRET, основанные на вездесущем семействе флуоресцентных белков, предлагают огромный потенциал для выявления молекулярной динамики в живых клеточных системах, идеальной пары FRET пока нет.Оптимизированные версии CFP и YFP по-прежнему представляют собой наиболее эффективную пару для общего использования, хотя лучшие комбинации могут появиться на горизонте. Точно так же не существует совершенной техники для измерения FRET, хотя все описанные выше подходы имеют сильные стороны, которые можно использовать в зависимости от конкретной исследуемой экспериментальной ситуации. По мере того, как становятся доступными более оптимизированные флуоресцентные белки, включая ярко-красные варианты, которые могут быть подходящими в качестве акцепторов для доноров GFP или YFP, FRET, использующий флуоресцентные белки, должен стать еще более полезным для исследований межбелкового взаимодействия в живых клетках.Как обсуждалось, широкие спектры поглощения текущей палитры красных флуоресцентных белков, в дополнение к более низким квантовым выходам мономерных версий, затрудняют использование этих кандидатов в FRET. Тем не менее, быстрые темпы усовершенствования флуоресцентных белков вселяют оптимизм в отношении того, что такие белки будут доступны в ближайшем будущем, и помогут произвести дальнейшую революцию в этом новом подходе к выяснению внутриклеточных биохимических механизмов.

    Fanned-Fret®, Мультимасштабные гитары, бас-гитары, изготовленные на заказ

    Компания Novax Guitars® была официально основана в 1989 году, когда Ральф Новак получил награду U.Патент № 4,852,450 на «Гриф с множеством масштабов». Хотя дата основана на выдаче патента, семена этой революционной технологии и концепции Fanned-Fret® были посеяны много лет назад.

    В начале 1970-х годов Ральф Новак ремонтировал и настраивал (тогда они не назывались «гитарными техниками» …) гитары и басы, работая через LoBue / Guitar Lab, We Buy Guitars и Alex Music, все они располагались в западной 48-й улице. Связь уличных музыкальных инструментов в центре Манхэттена.

    Нью-Йорк был «центром» для многих профессиональных артистов, которые приезжали в турне — это был период «просвещения» для Новака. Работа с проницательными и хорошо осведомленными профессиональными музыкантами дала Новаку понять, что у традиционного дизайна гитар есть недостатки.

    После переезда в Калифорнию в 1978 году Новак несколько лет работал через Subway Guitars в Беркли, прежде чем открыть собственный магазин в Эмеривилле, а затем и в Сан-Леандро. Именно здесь была задумана, разработана и запатентована многомасштабная концепция.

    Эта концепция возникла из наблюдения, что, хотя инструменты с разными стилями корпуса и звукоснимателями будут демонстрировать очевидные различия в тоне, была согласованность в реакции струн различных инструментов.

    Инструменты с более короткой шкалой (многие гитары Gibson с твердым корпусом и малочисленные фендеры) имели «теплый» тон с «мутным» басовым откликом. Инструменты с более длинной шкалой (например, многие гитары Fender и арки с более длинной шкалой Gibson) имели более яркий тон, а басы были более «похожими на пианино».Кроме того, по сравнению со старыми гитарами Kay с еще большей длиной шкалы 26,25 дюйма разница в тембре струн, обусловленная длиной струны, была поразительной.

    Новак искал способ объединить теплые, сладкие высокие частоты более коротких инструментов с богатыми, похожими на фортепьяно басами длинных инструментов. Так зародился Fanned-Frets.

    Одним из удивительных эффектов концепции Fanned-Fret было то, насколько «настроены» прототипы инструментов. Дальнейшая доработка и развитие в течение следующих десяти лет с упором на точную интонацию и вклад многих игроков привели к нынешнему варианту исполнения, сделавшему Novax Guitars популярным во всем мире.Артисты с разборчивым вкусом и требовательными музыкальными стилями, естественно, тяготели к концепции Fanned-Fret из-за легкости игры, точной интонации и расширенного диапазона настройки, которые предлагают Fanned-Frets.

    Благодаря многолетнему опыту в ремонте и настройке струнных инструментов, а также награде Industrial Design Excellence Award, Novax Guitars находится в авангарде гитарных инноваций и эволюции.

    На «начальном уровне» инструменты Novax включают «невидимые» функции, такие как сверхточная интонация и удобство игры, а также более очевидные усовершенствования конструкции, такие как однострунные мосты, которые минимизируют перекрестные помехи между струнами.

    Индивидуально настроенные звукосниматели, уникальные и универсальные схемы и потрясающая древесина — все это вместе создает уникальный и вдохновляющий игровой опыт.

    Другие компании копируют наши дизайны и пытаются реализовать концепцию Fanned-Fret — на первый взгляд они могут выглядеть одинаково, но есть ощутимая разница. Никто не имеет большего опыта работы с многомасштабными инструментами, чем Novax, создатели Fanned-Fret.

    Ральф Новак недавно отказался от активного производства нестандартных инструментов из-за ухудшения зрения.Он предлагает свои услуги по дизайну и консультации другим компаниям, заинтересованным в производстве инструментов Fanned-Fret.

    С тех пор, как патент перешел в общественное достояние, многомасштабная концепция была принята несколькими крупными компаниями. Эти «копийные» инструменты не обладают той точной интонацией и играбельностью, которые были достигнуты за более чем 25-летнюю работу с многомасштабной концепцией.

    Чтобы быть уверенным, что вы получаете все преимущества этой захватывающей технологии, обратите внимание на символ зарегистрированного товарного знака (®), сопровождающий товарный знак Fanned-Fret.Остерегайтесь компаний, которые предлагают инструменты «Fanned-Fret», на которых нет символа «зарегистрированный»!

    лидеров обеспокоены задержками на объекте — The Daily Reporter

    К настоящему времени предполагалось завершить строительство кольцевой развязки на County Roads 300S и 500W. Местные власти больше не уверены, когда начнутся работы. (Кристи Дир | Daily Reporter)

    NEW PALESTINE — Ярко-оранжевый строительный знак на County Road 500W сообщает, что дорога будет закрыта в понедельник, август, или в любое время после него.2.

    Это дата, когда должно было быть завершено строительство первой кольцевой развязки в южной части графства — на пересечении дорог графства 500W и 300S. Вместо этого основная часть проекта еще не началась, хотя знак указывает на то, что окончательное строительство кольцевой развязки неизбежно.

    «Просто трудно сказать, что произойдет и когда начнется реальное строительство», — сказал управляющий города Новой Палестины Джим Робинсон.

    Первоначально график проекта предусматривал начало строительства в начале мая с переносом инженерных сетей; 60-дневное закрытие начнется вскоре после этого.Задержки по проекту стоимостью 1,14 миллиона долларов произошли почти сразу после того, как местные власти объявили, что круговое движение будет завершено до начала 2021 учебного года, который начался на прошлой неделе.

    Городские власти были разочарованы недостаточной работой AT&T, которая не завершила перемещение инфраструктуры, чтобы можно было начать строительство на кольцевой развязке. Городские власти говорят, что не удивятся, если дороги не закроют до конца августа, а это значит, что проект может быть завершен только в конце октября или начале ноября.

    AT&T — единственная организация, которая не завершила свою работу, сказала член совета Энджи Фарноу.

    Еще на прошлой неделе она писала электронные письма официальным лицам AT&T. Сообщения возвращались с примечаниями о том, что представителей не было в офисе и они не могли отвечать в течение нескольких дней.

    «Мы звонили, писали письма, пытались сделать все, что в наших силах, чтобы заставить их выполнить свою часть работы», — сказал Фарнов.

    Теперь, сказал Робинсон, он обеспокоен главным подрядчиком, Rieth-Riley Construction Co., может столкнуться с проблемами, потому что у него есть другие проекты, намеченные на новые временные рамки, что может отодвинуть проект на несколько месяцев.

    Робинсон отметил, что работа, которую должна выполнить AT&T, связана с рабочей силой, а не с материалами, что привело к задержкам во многих строительных проектах по всему штату.

    «Это действительно расстраивает, когда все, что им нужно сделать, — это нанять рабочих», — сказал Робинсон.

    Президент совета

    Билл Нимьер отметил, что городские власти несколько месяцев назад провели совещание по планированию, и представители AT&T были единственными, кто на нем не присутствовал.

    «Всей этой задержки можно было избежать», — сказал Нимье. «Все это очень обидно, потому что в этом есть эффект домино, потому что их задержка, все задерживает».

    Перекресток всегда был опасным местом: отчеты об авариях показывают в среднем до пяти столкновений на нем в год, в том числе одно, которое привело к гибели 15-летнего подростка из Гринфилда в 2015 году.

    Городские и уездные власти были в восторге, когда планы строительства кольцевой развязки, над которыми велась работа в течение нескольких лет, стали реальностью.Министерство транспорта штата Индиана согласилось профинансировать 80% проекта, а округ и Новая Палестина оплатили остальное.

    Теперь лидеры разочарованы из-за задержки. Также они продолжают беспокоиться о безопасности перекрестка.

    «Мы хотим, чтобы этот проект был завершен как можно скорее для безопасности всех», — сказал Фарнов.

    Между тем городские власти заказали дерн и флагшток для кольцевой дороги. У них также есть планы спросить студентов-искусствоведов в средней школе Новой Палестины, не хотят ли они создать какую-нибудь художественную структуру, которая будет стоять в центре круга.Когда будут добавлены последние штрихи, еще неизвестно.

    Робинсон пошутил, что сейчас он будет в восторге, если круговая развязка закончится к зиме.

    «Мы хотим поставить елку посередине», — сказал Робинсон со смехом.

    домов престарелых недовольны требованием Трампа провести испытания

    Департамент здравоохранения

    Мэриленда заявил, что он пересматривает новое федеральное руководство и «обеспечит соответствие политики штата новым руководящим принципам», — сказал пресс-секретарь.Государство должно получить больше информации «в ближайшие недели».

    «Это действительно сбивает с толку», — сказал ДеМатто, который выразил озабоченность по поводу того, что получение результатов из коммерческих лабораторий может занять разное время.

    Представители здравоохранения Нью-Гэмпшира продолжают рекомендовать использовать тесты на антигены только для тестирования людей с симптомами. Вместо этого в штате действует система, которая оплачивает лабораторные тесты для персонала дома престарелых каждые 7-10 дней с быстрой сменой времени.

    «Это может измениться, но именно здесь мы находимся сегодня», — сказала Элизабет Талбот, эпидемиолог штата, на веб-семинаре с представителями штата и дома престарелых на прошлой неделе, вскоре после того, как администрация Трампа обновила отраслевые рекомендации.

    Администрация Трампа обещает дополнительную помощь. По словам Хека, некоторые из 150-миллионных 15-минутных экспресс-тестов, которые США недавно закупили у Abbott Laboratories, будут отправлены в дома престарелых в соответствии с более строгими требованиями к тестированию, но администрация еще не уточнила, сколько и когда эти поставки будут отправлены. начинать.Эти конкретные тесты не требуют дополнительного оборудования и размером с кредитную карту.

    Между тем в домах престарелых возникли проблемы с повторным заполнением заказов на экспресс-тесты. В прошлом месяце администрация Трампа задействовала Закон о оборонном производстве, чтобы гарантировать, что производители экспресс-тестов Becton Dickinson и Quidel уделяют приоритетное внимание выполнению заказа федерального правительства для домов престарелых над другими клиентами. Компания BD, которая проводит большинство тестов, сообщила, что распоряжение правительства временно не позволяет им выполнять заказы для домов престарелых и других клиентов.

    В результате, «в настоящее время мы не можем предоставить нашим дистрибьюторам какие-либо тесты для« пополнения запасов »домов престарелых, которые уже получили государственное финансирование», — сказал представитель компании. BD ожидает, что сможет начать пополнять запасы заказов в течение нескольких недель.

    Президент и главный исполнительный директор

    Quidel Дуг Брайант сказал, что у ее дистрибьюторов достаточно тестов, чтобы пополнить запасы домов престарелых, которые заказывают больше тестов.

    Хек, представитель HHS, признал, что в некоторых домах престарелых могут возникнуть задержки в получении дополнительных материалов для тестирования, но «мы считаем, что это будет редко.Она отметила, что дома престарелых будут иметь приоритет перед другими покупателями.

    Федеральное правительство направило от 150 до более 900 тестов на месте в дома престарелых в зависимости от их размера, но это зависит от учреждений, которые должны закупить дополнительные тесты.

    Последние новости политики и политики в области здравоохранения.

    Глава Lutheran Life Villages, которая управляет тремя домами престарелых в Индиане, сказал, что его первый вопрос после прохождения тестов от федерального правительства на этой неделе заключался в том, как получить больше.

    Президент и генеральный директор компании Алекс Кифер сказал, что связался с поставщиками и отраслевыми группами. Но пока что «лучшее, что у нас есть прямо сейчас, — это поставки могут быть доступны где-то в конце сентября, может быть, в октябре», — сказал он.

    В одном из домов компании, учреждении на 84 койки, от федерального правительства было проведено 210 тестов, которых едва хватило на то, чтобы один раз проверить 180 сотрудников и лиц, осуществляющих основной уход. Согласно новым правилам тестирования Трампа, учреждение в округе Аллен, где показатель положительных результатов тестирования равен 7.5%, как ожидается, будут проверять этих рабочих один раз в неделю.

    Кифер, как и другие представители отрасли, выразили обеспокоенность по поводу того, что до сих пор нет четких указаний о том, как предприятия должны сообщать о своих отрицательных результатах испытаний. Он сказал, что лаборатории сообщают о результатах тестирования на Covid-19 в учреждении, и теперь, с тестами на антигены, они будут проводиться на дому.

    Некоторые официальные лица домов престарелых заявили, что условия тестирования начинают улучшаться после нескольких месяцев просьб со стороны отрасли.И, в конечном итоге, некоторые предпочитают, чтобы федеральное правительство настаивало на дополнительных тестах сейчас, чем месяцами ждать, чтобы доработать нюансы.

    Несмотря на то, что это вызвало путаницу, усилия федерального правительства по обеспечению лабораторий оборудованием для тестирования являются «шагом в правильном направлении», — сказал один из источников в домах престарелых, пожелавший остаться неназванным, чтобы дать откровенную оценку.

    Дэвид Лим внес вклад в этот отчет.

    Основанный на активности ратиометрический датчик FRET выявляет обусловленные онкогеном изменения в лабильных пулах меди, вызванные измененным метаболизмом глутатиона

    Медь является необходимым для жизни окислительно-восстановительно-активным питательным веществом (1), выступая в качестве мощного каталитического и / или структурного кофактора в белках для основных процессов, таких как транспорт кислорода, дыхание и метаболизм, рост и дифференциация клеток, а также передача сигналов (2–6).В дополнение к прочно связанным пулам меди, скрытым в активных центрах металлопротеинов, новые данные предполагают наличие лабильных пулов меди, которые относительно слабо связаны низкомолекулярными лигандами (7). Лабильные пулы меди вносят вклад в растущее число динамических сигнальных путей переходных металлов (8), включая нейронную коммуникацию (9⇓ – 11), обоняние (12, 13), липолиз (6), циклы покоя-активности (14) и киназные пути. участвует в передаче сигналов и онкогенезе (5, 15). Действительно, нарушение регуляции меди может привести к аберрантным явлениям окислительного и нитрозативного стресса, которые сопровождают заболевания, включая рак (5, 16), сердечно-сосудистые расстройства, нейродегенеративные болезни Альцгеймера, Паркинсона и Хантингтона (3, 17), диабет и ожирение, а также генетические болезни Менкеса и Вильсона. расстройства (18⇓⇓ – 21).

    Дихотомия сигнал / стресс для меди мотивирует разработку новых химических инструментов, помогающих расшифровать более широкий вклад меди в физиологию и патологию. В этом контексте флуоресцентные (6, 10, 11, 14, 22–38), биолюминесцентные (39) и магнитно-резонансные датчики (40–42) для визуализации лабильных медных пулов со специфичностью металла и степени окисления, особенно при использовании вместе с дополнительными методами измерения общего содержания металлов (22, 43, 44), включая масс-спектрометрию с индуктивно связанной плазмой с лазерной абляцией (LA-ICP-MS) (45 – 47), наномасштабная вторичная ионная масс-спектрометрия (38, 48) и рентгеновская флуоресцентная микроскопия (10, 49, 50) могут обеспечить согласованную картину гомеостаза металлов для данной биологической модели.Таким образом, химическое ограничение в разработке флуоресцентных зондов состоит в том, что подавляющее большинство индикаторов меди на сегодняшний день реагируют только на изменения интенсивности флуоресценции в одном цвете, что может усложнить количественные измерения пулов меди и / или сравнение уровней меди в разных цветах. биологические образцы из-за возможных изменений в захвате зонда наряду с помехами, возникающими из-за независящих от меди явлений, таких как неоднородность толщины образца и интенсивности света (51, 52).Чтобы решить эту проблему, логометрические зонды, которые используют спектральные изменения возбуждения / излучения на 2 или более длинах волн, могут в принципе обеспечить внутреннюю самокалибровку для неоднородной нагрузки зонда и ограничить интерференцию между различными образцами (53⇓⇓⇓ – 57). Однако большинство ратиометрических флуоресцентных индикаторов меди, о которых сообщалось на сегодняшний день, в значительной степени ограничены отсутствием специфичности степени окисления и / или снижением общей интенсивности флуоресценции при обнаружении меди (31–37).

    Теперь мы представляем разработку, синтез и биологические применения логометрического флуоресцентного индикатора меди первого поколения, зонда-1 с резонансным переносом энергии флуоресценции (FRET) (FCP-1).Этот сенсорный зонд, основанный на активности, использует хемоселективное Cu (I) -зависимое окислительное расщепление C-O трис [(2-пиридил) метил] аминовой (ТРА) (28, 58, 59) единицы, связывающей единицы донора флуоресцеина и акцептора родамина. (Схема 1). Высокая металлоспецифичность и степень окисления FCP-1 для Cu (I), наряду с его двухцветным ратиометрическим ответом FRET, позволяет использовать его для мониторинга динамических изменений в лабильных пулах Cu (I) в живых клетках. Благодаря самокалибровке, обеспечиваемой его ратиометрическим ответом, FCP-1 был способен надежно обнаруживать снижение эндогенных уровней лабильной Cu (I) в эмбриональных фибробластах мыши (MEF), лишенных высокоаффинного переносчика меди Ctr1 ( Ctr1). — / — ) относительно сородичей дикого типа.Дальнейшие эксперименты выявили колебания лабильных уровней Cu (I), но не общих уровней меди, при окислительно-восстановительном стрессе, вызванном генетическими изменениями путей биосинтеза глутатиона. Интересно, что дефицит лабильных пулов Cu (I) был обнаружен при введении онкогенных BRAF V600E или KRAS G12D , связывающих лабильную дисрегуляцию меди с онкоген-зависимым окислительно-восстановительным статусом. Способность FCP-1 контролировать лабильные пулы Cu (I) с помощью логометрического ответа обеспечивает отправную точку для дальнейших исследований окислительно-восстановительного вклада в передачу сигналов переходных металлов.

    Результаты и обсуждение

    Дизайн, синтез и характеристика FCP-1.

    Вдохновленный биоинорганическими модельными соединениями TPA, которые демонстрируют Cu (I) -зависимую химию окислительного расщепления (28, 58, 59), наша конструкция FCP-1 на схеме 1 соединяет донор флуоресцеина FRET и акцептор родамина FRET с медь-чувствительным TPA. компоновщик. Изменения в лабильных уровнях Cu (I) могут модулировать внутримолекулярную эффективность FRET и приводить к разной интенсивности флуоресценции донора и акцептора на 2 разных длинах волн, которые могут быть самокалиброваны ратиометрическим способом.При более низких уровнях Cu (I) зонд остается нетронутым с более высоким FRET и доминирующей эмиссией родамина, с более высокими уровнями Cu (I), ведущими к медьзависимому окислительному расщеплению линкера TPA и более низкому FRET и эмиссии с преобладанием флуоресцеина.

    Синтез FCP-1 начинается с получения метилового эфира флуоресцеина, функционализированного 2-бромметилпиридином ( 2 ), и родамина, функционализированного пиколиламином ( 5 ; Схема 2). Соединение 2 было синтезировано в 2 стадии из ранее описанного метилового эфира флуоресцеина путем нуклеофильного замещения на 6- (бромметил) -2-пиридинметанол и последующего бромирования метилового спирта.Параллельно получали нозил-защищенный пиколиламин ( 3 ) путем монозамещения бис (хлорметил) пиридина из 4-нитро- N — (2-пиридинилметил) бензолсульфонамид и затем вводили в реакцию с родамином, функционализированным пиперазинилом (Pz-родамином). позволить себе 4 . Затем с нозильной группы 4 снимают защиту тиофенолом и K 2 CO 3 с получением 5 . Имея в руках ключевые элементы 2 и 5 , мотив TPA может быть сгенерирован путем нуклеофильного замещения 2-бромметильной группы на 2 пиколиламином на 5 в основных условиях, что дает конечный ратиометрический зонд FCP-1 который был охарактеризован с помощью ЯМР 1 H и 13 C { 1 H}, МС высокого разрешения и МС с жидкостной хроматографией (ЖХ-МС; SI Приложение , рис.S1). Зонд на основе интенсивности Cu (I) FL-TPA был приготовлен в качестве контрольного соединения с тем же триггером восприятия на основе активности, зависящим от Cu (I), и флюоресцеиновым каркасом, но без ратиометрического ответа (схема 2).

    Схема 2.

    Синтез FCP-1 и контрольного зонда FL-TPA.

    Реакционная способность и селективность FCP-1 по отношению к меди.

    Известно, что внутриклеточная среда восстанавливается и содержит высокие концентрации биомолекул, что приводит к скоплению макромолекул (60, 61).Таким образом, чтобы имитировать аспекты этих свойств in vitro, мы оценили FCP-1 в буфере PBS, содержащем глутатион (2 мМ) и полиэтиленгликоль (PEG) -400 (40%, об. / Об.). FCP-1 показал максимумы поглощения при 465, 493 и 552 нм с молярными коэффициентами экстинкции 20 000, 22 100 и 40 000 M -1 см -1 , соответственно ( SI Приложение , Рис. S2). Первые 2 максимума поглощения соответствовали поглощению флуоресцеиновой составляющей, поскольку аналогичные максимумы поглощения при 460 и 489 нм были обнаружены в спектрах поглощения FL-TPA ( SI Приложение , рис.S2) и сообщил о моноклеточном метиловом эфире флуоресцеина (62, 63), в то время как самое низкое поглощение энергии при 552 нм происходило от части родамина ( SI Приложение , рис. S2). При фотовозбуждении при 458 нм было обнаружено, что FCP-1 испускает при 526 и 576 нм (фиг. 1 A ), что соответствует сигнатурам флуоресцеина и родамина соответственно. Примечательно, что строительный блок Pz-родамин показывает только слабое поглощение при 458 нм ( SI Приложение , рис. S2). Вместе со значительным вкладом низкоэнергетической флуоресценции от возбуждения от 450 до 500 нм, что находится в области поглощения FL-TPA ( SI Приложение , рис.S3), данные подтверждают наличие FRET от донора флуоресцеина к акцептору родамина. При использовании FL-TPA в качестве эталонного соединения-донора FRET ( SI Приложение , рис. S4) с предположением, что тушение флуоресценции донора происходит только из процесса FRET, эффективность FRET в кассете FCP-1 оценивается в 84%. .

    Рис. 1.

    Фотофизические свойства и селективность Cu (I) FCP-1 в водных буферных растворах. ( A ) Изменения скорректированных спектров излучения FCP-1 (5 мкМ) в водном буферном растворе.( Вставка ) Изменения ратиометрического излучения FCP-1, F 526 / F 576 , с Cu (I) (10 мкМ) с течением времени. ( B ) Скорректированные спектры излучения FCP-1, измеренные при различных концентрациях. ( C ) Никаких значительных изменений в соотношении выбросов F 526 / F 576 при различных концентрациях FCP-1 не наблюдается. ( D ) Изменения в F 526 / F 576 Отношение FCP-1 (5 мкМ) к различным биологически значимым ионам металлов, а также к кобальт (II) -содержащему витамину B 12 .Черные столбцы представляют собой логометрический отклик излучения, наблюдаемый при добавлении конкурирующих ионов металлов (1 мМ для Na + , K + , Mg 2+ и Ca 2+ и 10 мкМ для всех остальных d- блокируют ионы металлов, а также витамин B 12 ) через 15 мин. Красные столбцы представляют собой логометрическую реакцию эмиссии при последующем добавлении 10 мкМ Cu (I) через 15 мин. Обозначения: 1, Na + ; 2, К + ; 3, Mg 2+ ; 4, Ca 2+ ; 5, Mn 2+ ; 6, Fe 2+ ; 7, 10 мкМ Co 2+ ; 8, 1 мкМ Co 2+ ; 9, витамин B 12 ; 10, Ni 2+ ; 11, Cu + ; 12, Zn 2+ .( E ) Спектры излучения и ( F ) F 526 / F 576 Коэффициент излучения (черный) FCP-1 (5 мкМ) или FCP-1 с добавлением (красного) Cu (II) (10 мкМ), (синий) Cu (II) (10 мкМ) + GSH (2 мМ) или (голубой) Cu (I) (10 мкМ) + GSH (2 мМ) через 15 мин. Все спектры снимали в водном буфере (PBS с 2 мМ GSH и 40 об.% PEG-400) с λ ex = 458 нм.

    При добавлении Cu (I) FCP-1 показал увеличение эмиссии флуоресцеина при 526 нм с течением времени с одновременным падением флуоресценции родамина при 576 нм (рис.1 А ). Анализ ЖХ-МС подтверждает образование фрагментов метилового эфира флуоресцеина ( P1 ) и родамин-TPA ( P2 ) при добавлении Cu (I) к раствору FCP-1 ( SI Приложение , Рис. S5) и аэробные условия необходимы для запуска спектральных изменений эмиссии ( SI Приложение , рис. S6), согласующихся с Cu (I) -опосредованным окислительным расщеплением связи C-O бензилового эфира на линкере TPA FCP-1. Это расщепление C – O приводит к отделению донора флуоресцеина от акцептора родамина и, следовательно, приводит к снижению внутримолекулярной эффективности FRET с ратиометрическим изменением спектра излучения (рис.1 А ). Логометрическое изменение флуоресценции FCP-1 при 526 и 576 нм ( F 526 / F 576 ) было быстрым и достигало насыщения после . 30 мин в присутствии 2-кратного избытка Cu (I) (10 мкМ). Примечательно, что соотношение FCP-1 F 526 / F 576 показало линейную реакцию доза-ответ при добавлении Cu (I) от 0,01 до 1 мкМ ( SI Приложение , рис. S7 A ), подчеркивая способность FCP-1 определять уровни Cu (I) в этом диапазоне по логометрическому изменению флуоресценции.FCP-1 показал высокую чувствительность к Cu (I), о чем свидетельствуют обнаруживаемые спектральные изменения излучения при 10 нМ Cu (I) ( SI Приложение , рис. S7 B ) и предел обнаружения 16,7 нМ на основе метод 3σ из 5 независимых экспериментов (64, 65). Что еще более интересно, базальный коэффициент эмиссии FCP-1 F 526 / F 576 не показал значительных изменений при различных концентрациях зонда (от 0,5 до 20 мкМ; рис. 1 B и C ) .Эта внутренняя самокалибровка является преимуществом, поскольку было обнаружено, что FCP-1 менее флуоресцирует при более высоких концентрациях, предположительно из-за самотушения, которое является распространенной проблемой, обнаруживаемой во флуорофорах ( SI Приложение , рис. S8) (66) . В самом деле, незначительные изменения в ратиометрической эмиссии FCP-1 указывают на то, что FRET происходит в основном по внутримолекулярному механизму, а независимая от концентрации ратиометрическая флуоресценция FCP-1 дополнительно подчеркивает его потенциал в сравнительной визуализации лабильных пулов Cu (I) в биологических образцах с помощью предотвращение возможных осложнений, возникающих из-за различий в захвате зонда, толщине образца и интенсивности света.

    Логометрическое изменение флуоресценции FCP-1 было селективным в отношении Cu (I) по сравнению с другими биологически значимыми ионами металлов, за исключением свободного Co (II) при 10 мкМ, который незначительно изменял флуоресценцию FCP-1 (рис. 1 D ). Примечательно, что эта концентрация экзогенного Co (II) намного выше, чем физиологически значимые уровни лабильного Co (II), поскольку известно, что этот ион металла прочно связан с белками. Действительно, FCP-1 не показал значительных изменений в ратиометрическом сигнале в присутствии 10 мкМ кобаламина (витамин B 12 ) (67), который является преобладающей формой Co (II) в системах млекопитающих, что позволяет предположить, что вмешательство в обнаружение содержания Cu (I) с помощью FCP-1 из Co (II) в биологических образцах должно быть незначительным.Конкурентные эксперименты также показали способность FCP-1 обнаруживать Cu (I) в растворах, содержащих другие биологически релевантные ионы металлов (рис. 1 D ). В дополнение к проявлению селективности по металлу, ратиометрический отклик FCP-1 является специфическим для степени окисления для Cu (I), поскольку зонд не реагирует ратиометрически на Cu (II) (рис. 1 E и F ). В качестве дополнительной поддержки этой селективности по степени окисления совместимость FCP-1 с Cu (II) и избытком глутатиона, который легко восстанавливает Cu (II) до Cu (I), приводит к спектрам излучения и F 526 / Отношение F 576 , которое идентично полученному при обработке FCP-1 Cu (I) и избытком глутатиона (рис.1 E и F ). Эта специфичность состояния окисления важна для приложений FCP-1 для визуализации динамических изменений внутриклеточных лабильных пулов Cu (I) в условиях окислительно-восстановительного стресса и онкогенной трансформации, которые мы опишем позже.

    Наконец, FCP-1 не реагирует на Ag (I), который является близким аналогом Cu (I), но не обладает сильной кислородзависимой окислительно-восстановительной активностью ( SI Приложение , рис. S9). Ввиду низкой растворимости Ag (I) в присутствии хлорид-и других галогенид-ионов, буферный раствор NaH 2 PO 4 (50 мМ, pH 7.4) вместо раствора PBS в этих сериях экспериментов. Действительно, в присутствии Ag (I) не наблюдалось значительного изменения соотношения F 526 / F 576 , тогда как Cu (I) вызывал увеличение патента F 526 / F. 576 соотношение FCP-1 в том же буферном растворе ( SI Приложение , рис. S9). Эти данные предполагают, что наблюдаемые ратиометрические изменения флуоресценции FCP-1 при добавлении Cu (I) объясняются окислительно-восстановительной активностью Cu (I).Кроме того, было обнаружено, что присутствие восстанавливающих агентов имеет решающее значение для запуска логометрических изменений флуоресценции FCP-1, опосредованных Cu (I) ( SI Приложение , рис. S10), и действительно, аналогичные изменения флуоресценции наблюдались также при использовании аскорбата. вместо 2 мМ глутатиона (GSH) в качестве восстановителя ( SI Приложение , рис. S11). Вместе с наблюдаемым увеличением уровней GSSG (окисленной формы GSH) с сопутствующим падением уровней GSH (восстановленной формы) при добавлении Cu (I) к смеси растворов FCP-1 и GSH ( SI Приложение , Инжир.S5 A ), эти данные подтверждают роль восстанавливающих агентов в «рециркуляции» редокс-активных частиц Cu (I) для связывания с рецептором TPA и запуска последующего основанного на активности расщепления связи C-O бензилового эфира на компоновщик. Это расщепление связи происходит в основном по окислительному механизму, поскольку при добавлении Cu (I) в анаэробных условиях не наблюдается значительных изменений спектра излучения ( SI Приложение , рис. S6). Образование метилового эфира флуоресцеина и фрагментов родамин-TPA ( SI Приложение , рис.S5) приводит к снижению внутримолекулярной эффективности FRET и увеличению отношения F 526 / F 576 .

    FCP-1 может отображать лабильные пулы Cu (I) в живых клетках.

    Учитывая избирательную и чувствительную реакцию FCP-1 на металл и состояние окисления на Cu (I), мы попытались применить этот зонд для логометрической флуоресцентной визуализации лабильных пулов Cu (I) в живых клетках. С этой целью клетки HEK 293T подвергали воздействию различных доз CuCl 2 (от 25 до 300 мкМ), тщательно промывали для удаления избытка меди из среды, а затем инкубировали с FCP-1 (5 мкМ) в течение 45 минут и визуализировали. .Клетки с добавкой меди показали статистически значимое дозозависимое увеличение соотношения F зеленый / F оранжевый по сравнению с клетками контроля носителя (фиг. 2 B ). Напротив, клетки HEK 293T с дефицитом меди, полученные обработкой непроницаемым для мембран хелатором меди, батокупроинсульфонатом (BCS; 100 мкМ), промытые и впоследствии инкубированные с FCP-1 (5 мкМ), показали статистически значимое снижение F зеленый / F оранжевый Соотношение по сравнению с контрольными клетками (рис.2 C и D ). Наблюдаемое увеличение и уменьшение лабильных уровней Cu (I) при добавлении меди (CuCl 2 ) и лечении истощения запасов меди (BCS), соответственно, как измерено с помощью визуализации FCP-1, было подтверждено дополнительными измерениями общих уровней меди с помощью ИСП-МС. демонстрируя ожидаемые увеличения и уменьшения общего пула меди (рис. 2 E ). Контрольные эксперименты показали, что клетки оставались жизнеспособными, на что указывало ядерное окрашивание ( SI Приложение , фиг.S12 и S13). Эти данные устанавливают, что FCP-1 способен визуализировать как увеличение, так и уменьшение лабильных пулов Cu (I) в живых клетках с помощью логометрического считывания флуоресценции.

    Рис. 2.

    Ратиометрическая флуоресцентная визуализация лабильных уровней Cu (I) в живых клетках с использованием FCP-1. ( A ) Изображения конфокальной флуоресцентной микроскопии клеток HEK 293T, предварительно обработанных контрольным растворителем-носителем или различными концентрациями CuCl 2 в полной среде в течение 18 часов. Затем клетки промывали PBS, инкубировали с FCP-1 (5 мкМ) в DPBS в течение 45 минут, а затем визуализировали.( B ) Средние ратиометрические коэффициенты излучения клеток, представленные как F зеленый / F оранжевый , как определено в экспериментах по визуализации в A , выполненных в трех экземплярах. ( C ) Изображения конфокальной флуоресцентной микроскопии клеток HEK 293T, предварительно обработанных контрольным растворителем-носителем или BCS (100 мкМ) в полной среде в течение 18 часов. Затем клетки промывали PBS, инкубировали с FCP-1 (5 мкМ) в DPBS в течение 45 минут, а затем визуализировали. ( D ) Средние коэффициенты излучения клеток FCP-1, F зеленый / F оранжевый , как определено в экспериментах в C , проведенных в трех экземплярах. A и C отображаются в псевдоцвете и относятся к базовому контролю для этого эксперимента и независимо друг от друга. λ ex = 458 нм. ( E ) Измерение ICP-MS для определения общих клеточных уровней 63 Cu в клетках HEK 293T при добавлении и истощении меди по сравнению с контролем (с нормализацией различного количества клеток по общему клеточному уровню 31 P). Планки погрешностей обозначают стандартное вычисление (SD; n = 3).* P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001, **** P <0,0001 и ***** P <0,00001.

    FCP-1 может отслеживать различия в уровнях лабильного Cu (I) в генетической клеточной модели неправильной регуляции меди.

    Установив, что FCP-1 чувствителен к эндогенным пулам лабильной Cu (I) в базовых условиях и может реагировать на изменения лабильных пулов Cu (I) при фармакологическом добавлении и / или истощении меди, мы попытались изучить применение FCP-1 для визуализации изменений в эндогенных лабильных пулах Cu (I) посредством генетических манипуляций.С этой целью мы выполнили сравнительную визуализацию FCP-1 в клетках эмбриональных фибробластов мыши, которые являются либо Cu-избыточными ( Ctr1 + / + MEF), либо Cu-дефицитными ( Ctr1 — / — MEFs) через нокаут высокоаффинного переносчика меди CTR1 (68⇓ – 70). Как и ожидалось, Ctr1 + / + MEF, инкубированные с FCP-1, показали более высокие отношения F зеленый / F оранжевый по сравнению с Ctr1 906 — / — 905 MEF ( P <0.01; 3 A и B ), что указывает на то, что FCP-1 может точно определять относительное снижение эндогенных уровней лабильной Cu (I) в клетках, дефицитных по поглощению меди.

    Рис. 3.

    FCP-1 позволяет проводить сравнительную визуализацию уровней лабильных Cu (I) в живых клетках с измененными уровнями экспрессии высокоаффинного белка захвата меди CTR1. ( A ) Изображения конфокальной флуоресцентной микроскопии Ctr1 + / + MEF и Ctr1 — / — MEF, обработанных контролем растворителя, CuCl 2 (100 или 300 мкМ) или BCS (500 мкМ) в полной среде в течение 8 ч, промывали полной средой и PBS, инкубировали с FCP-1 (5 мкМ) в DPBS в течение 45 мин, а затем отображали с λ ex = 458 нм.( B ) Средние коэффициенты излучения клеток FCP-1, F зеленый / F оранжевый , как определено из экспериментов, проведенных в трех повторностях. ( C ) Изображения конфокальной флуоресцентной микроскопии Ctr1 + / + MEF и Ctr1 — / — MEF, инкубированных с FL-TPA (5 мкМ) в DPBS в течение 45 мин. Затем клетки получали изображение с λ ex = 488 нм. ( D ) Средняя интенсивность клеточной флуоресценции FL-TPA, F FL-TPA , определенная из экспериментов, проведенных в трех повторностях с λ ex = 488 нм.Планки погрешностей обозначают SD ( n = 3). * P <0,05, ** P <0,01 и **** P <0,0001.

    Для дальнейшей проверки способности FCP-1 контролировать дифференциальные уровни лабильного Cu (I) в клетках, Ctr1 + / + MEF, инкубированные с различными концентрациями CuCl 2 , показали дозозависимое увеличение в FCP-1 F зеленый / F оранжевый соотношение. Напротив, в Ctr1 — / — MEF, инкубированных с CuCl 2 и затем визуализированных с FCP-1 ( Инжир.3 A и B ). Тем временем жизнеспособность клеток поддерживалась, что подтверждено ядерным красителем DRAQ5 ( SI, приложение , фиг. S14 и S15). Разница в ответе ратиометрической флуоресценции FCP-1 на добавление экзогенной меди между MEF дикого типа и MEF с нокаутом по Ctr1 согласуется с неэффективным поглощением меди, а не с изменениями оттока меди, как обработка Ctr1 — / — МЭФ с мембранно-непроницаемым хелатором меди BCS привели к снижению отношения F зеленый / F оранжевый , аналогично тому, что наблюдается в Ctr1 + / + MEF (рис.3 A и B ). Дополнительные измерения ICP-MS подтверждают, что общие базальные уровни меди в MEF Ctr1 — / — ниже, чем Ctr1 + / + MEF ( SI Приложение , рис. S16). Важно отметить, что логометрический ответ FCP-1 является ключом к его способности различать базальный и пониженный уровни лабильной Cu (I). Действительно, контрольный зонд FL-TPA, который демонстрирует флуоресцентный ответ «включается» без ратиометрической самокалибровки, не смог различить различия в базальных лабильных уровнях Cu (I) в Ctr1 + / + MEF. и Ctr1 — / — MEF (рис.3 C и D ), при этом обнаруживая изменения в лабильной меди с добавлением экзогенной меди ( SI Приложение , рис. S17). Этот результат может быть объяснен потенциальными различиями в загрузке зонда в 2 клеточные линии MEF, что дополнительно подчеркивает самокалибрующуюся природу ратиометрического зонда FCP-1 как критическую особенность для точного определения уровней аналита в различных, изменчивых биологических образцах. Наконец, мы проверили, может ли FCP-1 нарушить лабильные пулы Cu, измеряя уровни белка CCS в MEF, обработанных FCP-1 или BCS, последний в качестве положительного контроля для снижения клеточного содержания Cu и повышения стабильности белка CCS.Действительно, уровни белка CCS не изменились в клетках, обработанных концентрацией FCP-1, достаточной для визуализации клеточных лабильных пулов Cu, в то время как обработка BCS увеличивала CCS, как и ожидалось ( SI Приложение , рис. S18), подтверждая, что FCP-1, сам по себе не изменяет клеточные уровни Cu в этих условиях. Данные демонстрируют, что FCP-1 может контролировать базальные уровни эндогенно лабильного Cu (I) и истощение таких пулов в ответ на снижение клеточного поглощения меди с помощью генетических или фармакологических средств.

    FCP-1 определяет динамическое изменение лабильного Cu (I) по сравнению с общим пулом меди в живых клетках при окислительно-восстановительном стрессе.

    Принимая во внимание специфичность степени окисления FCP-1 по отношению к Cu (I), мы исследовали влияние окислительно-восстановительного статуса клеток на лабильные пулы Cu (I), которое остается недостаточно изученным. Во-первых, мы подтвердили способность FCP-1 обнаруживать изменения в уровнях лабильного Cu (I) в клетках HeLa с помощью CuCl 2 и лечения BCS (рис. 4 A ). Затем мы наблюдали за эффектом добавления аскорбата, который является мощным восстанавливающим агентом, на внутриклеточные лабильные пулы Cu (I).Интересно, что мы наблюдали статистически значимое увеличение соотношения FCP-1 F зеленый / F оранжевый , что свидетельствует об увеличении лабильных уровней Cu (I) в клетках, обработанных аскорбатом, по сравнению с контрольными клетками (рис. 4 В ) (31). Поскольку сопутствующие измерения ICP-MS не показали изменений общего уровня меди в клетках, обработанных аскорбатом, по сравнению с контрольными носителями (рис. 4 C ), увеличение F зеленый / F оранжевый может быть объясняется повышением лабильных уровней Cu (I).Несколько потенциальных факторов могут способствовать этому наблюдению в ответ на этот экзогенный восстановитель, включая сдвиг в глобальном или локальном окислительно-восстановительном балансе Cu (I) / Cu (II), снижение клеточной или субклеточной способности буферизовать Cu (I) и / или перемещение / рекомпарментализация лабильных пулов Cu (I).

    Рис. 4.

    FCP-1 выявляет изменения в лабильном уровне Cu (I), но не в общем уровне меди в живых клетках при окислительно-восстановительном стрессе. Изображения конфокальной флуоресцентной микроскопии клеток HeLa, предварительно обработанных контрольным растворителем ( A ), CuCl 2 (200 или 300 мкМ) или BCS (100 мкМ) в полной среде в течение 18 ч или контрольным растворителем ( B ), аскорбатом (1 мМ) или BSO (1 мМ) в полной среде в течение 4 часов.Затем клетки промывали PBS, инкубировали с FCP-1 (5 мкМ) в DPBS в течение 45 мин и отображали с λ ex = 458 нм. Гистограммы показывают среднюю ратиометрическую эмиссию FCP-1 клеток, F зеленый / F оранжевый , определенную из экспериментов, проведенных в трех повторностях. ( C ) Общие клеточные уровни 63 Cu определяли с помощью экспериментов ICP-MS (с нормализацией различных количеств клеток по общему клеточному уровню 31 P).Планки погрешностей обозначают SD ( n = 3). * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001 и **** P <0,0001, и не показывают изменений ни при обработке аскорбатом, ни при обработке BSO.

    Имея эти результаты в руках, мы затем попытались использовать FCP-1 для изучения потенциальных связей между поддержанием лабильных пулов Cu (I) и эндогенными центральными окислительно-восстановительными медиаторами в клетке. В этом контексте глутатион (GSH) является повсеместно встречающимся в природе антиоксидантом и ключевой небольшой молекулой для поддержания правильного окислительно-восстановительного статуса клетки (71).Определяющая скорость стадия биосинтеза GSH включает глутамат-цистеинлигазу (GCL), которая может ингибироваться бутионинсульфоксимином (BSO) (72). Интересно, что мы наблюдали, что соотношение FCP-1 F зеленый / F оранжевый было выше в обработанных BSO клетках HeLa по сравнению с контрольными клетками (фиг.4 B ), что указывает на увеличение лабильных Уровни Cu (I) при блокировании синтеза GSH. Более того, общие уровни внутриклеточной меди существенно не различались между клетками, предварительно обработанными BSO, и контрольными клетками, как показано с помощью ICP-MS (рис.4 C ), показывая, что динамические изменения происходят в лабильном пуле Cu (I), а не в общем увеличении или уменьшении общего пула меди. В целом, мы предостерегаем от чрезмерной интерпретации этих данных как подтверждающих простую и прямую модель комплексообразования Cu (I) -глутатион, поскольку, хотя было обнаружено, что водные растворы FCP-1 и Cu (I) показывают более высокие значения F 526 / F 576 соотношения при более низких концентрациях GSH in vitro ( SI Приложение , рис. S19), переменные значения константы диссоциации и стехиометрия медь-лиганд, полученные в различных буферных условиях, предполагают более сложное взаимодействие между металлами и путями окислительно-восстановительного гомеостаза (7 , 22, 73).Действительно, GSH является не только восстанавливающим агентом, но также сообщалось о взаимодействии с металло-шаперонами, такими как ATOX1, или белками, буферизующими / поглощающими металлы, такими как металлотионеин, с образованием комплексов, которые могут прочно связывать медь (73–76). Следовательно, наблюдаемое повышение уровней лабильного Cu (I) в результате дефицита GSH может действовать через более сложные, непрямые механизмы, область, которая требует дальнейшего изучения.

    Для дальнейшего изучения корреляций между лабильными пулами Cu (I) и измененным метаболизмом GSH мы подготовили для исследования 2 клеточные линии MEF, где одна линия демонстрирует более низкие уровни общего GSH за счет стабильного генетического нокдауна эндогенного Gclc (каталитическая субъединица фермент, ограничивающий скорость GCL в синтезе GSH), а другая линия демонстрирует более низкие уровни GSH и более низкое отношение восстановленного GSH к окисленному (GSH / GSSG) за счет нокдауна глутатионредуктазы ( Gsr ; НАДФН-зависимый фермент, который расщепляет дисульфидной связи на 2 окисленных молекулах GSH) (71, 77).Как и ожидалось, опосредованный короткой шпилькой РНК (shRNA) нокдаун эндогенного Gclc (рис. 5, A и B ) значительно снижал уровни общего GSH в той же степени, что и MEF, обработанные BSO, что сильно ингибирует ферментативную функцию GCLC. , по сравнению с нецелевым контролем скремблирования ( Scr ) MEF (фиг. 5 C ). Важно отметить, что не наблюдается значительного изменения соотношения GSH / GSSG в этих нокдаун-клетках Gclc , несмотря на более низкие общие уровни GSH (рис.5 D ). Напротив, генетический нокдаун Gsr с помощью shRNA значительно снизил как общий уровень GSH, так и соотношение GSH / GSSG, тогда как обработка ингибитором GSR кармустином (бис-хлорэтилнитрозомочевиной, BCNU) только значительно снизила соотношение GSH / GSSH (рис. C – F ), что указывает на колебания внутриклеточного окислительно-восстановительного баланса в сторону более окислительной среды при отсутствии способности регенерировать GSH из GSSG.

    Рис. 5. Визуализация

    FCP-1 показывает увеличение или истощение пулов лабильных Cu (I), вызванное генетическими изменениями в общем глутатионе (GSH) или соотношении восстановленного / окисленного глутатиона (GSH / GSSG).( A ) Нормализованная экспрессия qPCR мРНК Gclc и ( B ) иммуноблот-определение GCLC или ACTIN в MEF, стабильно экспрессирующих ненаправленную контрольную shРНК ( Scr ) и Gclc shRNA. ( C и D ) Количественная оценка общего клеточного глутатиона (GSH, микромолярный) или отношения GSH к GSSG (GSH / GSSG) ± SEM из MEF, стабильно экспрессирующих Scr , Gclc shRNA, Gsr shRNA , или Scr , обработанные 1 мМ BSO, или 0.1 мМ BCNU. Уровни GSH и GSH / GSSG определяли с использованием набора GSH / GSSG-Glo Assay, и результаты сравнивали с использованием однофакторного дисперсионного анализа с последующим тестом множественного сравнения Даннета ( n ≥ 11). ( E ) Экспрессия qPCR мРНК Gsr и ( F ) иммуноблот-определение GSR или ACTIN в MEF, стабильно экспрессирующих Scr и Gsr shRNA. ( G ) Типичные конфокальные флуоресцентные изображения MEF, стабильно экспрессирующих Scr , Gclc shRNA или Gsr shRNA, инкубированных с FCP-1.( H ) Количественная оценка нормированной средней флуоресценции FCP-1 ( F зеленый / F оранжевый ) ± SEM. Данные взяты из анализа 98 отдельных клеток. ( I ) Предложенная модель изменений ферментов биосинтеза глутатиона и окислительно-восстановительного стресса на биодоступность лабильных пулов Cu (I). ( J ) Общие уровни Cu (части на миллион, ppm), обнаруженные с помощью ICP-MS из MEF, стабильно экспрессирующих Scr , Gclc shRNA или Gsr shRNA на вес образца ± SEM ( n = 6) .Результаты сравнивали с использованием однофакторного дисперсионного анализа с последующим многократным сравнением Даннета. * P <0,05, ** P <0,01 и **** P <0,0001; нс, статистически не значимо.

    После подтверждения успешной манипуляции либо уровнями GSH, либо соотношением GSH / GSSG, FCP-1 применяли для исследования относительных уровней лабильной Cu (I) в этой панели генетически определенных клеточных линий. Нокдаун клетки Gclc показали более высокое соотношение FCP-1 F зеленый / F оранжевый по сравнению с клетками Scr , в то время как более низкое FCP-1 F зеленый / F оранжевый соотношение наблюдалось в клетках с нокдауном Gsr по сравнению с контролем (рис.5 G и H ). Поскольку нокдаун Gclc ингибирует фермент, участвующий в определяющей скорости стадии биосинтеза GSH, и имитирует фармакологическое лечение BSO (рис. 4 B ), мы приписываем наблюдаемое увеличение F зеленый / F оранжевый коэффициент к снижению общего уровня GSH. Минимальное изменение соотношения GSH / GSSG в этой линии клеток с нокдауном Gclc предполагает, что общее окислительно-восстановительное состояние клетки не затронуто, и вместо этого указывает на снижение уровней лабильных систем Cu (I) -буферирования (рис.5 I ). Включены потенциальные аддукты GSH-металло-шаперон или GSH-металлотионеин, оба из которых могут влиять на слабосвязанные пулы Cu (I) по сравнению с прочно связанными. С другой стороны, клетки с нокдауном Gsr показали более низкое соотношение GSH / GSSG (рис. 5 D ), что отражает более общую окислительную внутриклеточную среду и может привести к сдвигу в динамическом балансе Cu (I / II ) пулов, что приводит к снижению уровней лабильных Cu (I) (рис. 5 I ). Хотя общие уровни GSH также снижаются в клетках с нокдауном Gsr , что может в некоторой степени увеличивать биодоступность лабильной Cu (I), статистически значимое снижение FCP-1 F зеленый / F оранжевый соотношение относительно контроля указывает на общий лабильный дефицит Cu (I) и предполагает, что окислительно-восстановительный вклад большего количества GSSG по сравнению с GSH является доминирующим фактором.Поскольку механизм определения активности FCP-1 основан на кислородзависимой окислительно-восстановительной реакции с Cu (I), мы провели дополнительную серию контрольных экспериментов, используя ранее описанный медный флуоресцентный датчик включения, Copper Fluor-4 (CF4). , который действует по прямому обратимому механизму, основанному на связывании Cu (I) (14). CF4 показал повышенную флуоресценцию в линиях клеток с нокаутом Gclc , но уменьшенную флуоресценцию в клетках с нокаутом Gsr , что хорошо согласуется с результатами, полученными с FCP-1 ( SI Приложение , рис.S20), обеспечивая дополнительную поддержку изменений в лабильных пулах Cu (I), вызванных изменениями в статусе GSH и GSH / GSSG. Наконец, в то время как пулы лабильных Cu (I) изменяются в MEF, в которых отсутствуют Gclc или Gsr , никаких изменений общего содержания меди при измерении с помощью ICP-MS не наблюдалось (фиг. 5 J ). Эти эксперименты показывают, что лабильные пулы Cu (I) могут быть увеличены и / или истощены глутатион-зависимым образом в зависимости как от общего уровня GSH, так и от окислительно-восстановительных соотношений GSH / GSSG.

    Онкогенные мутации BRAF

    V600E и KRAS G12 приводят к лабильному дефициту Cu (I) отчасти из-за пониженной экспрессии GSR и пониженной способности регенерировать GSH.

    Отмечая растущие связи между сигнальными путями меди и киназы, участвующими в онкогенезе, мы затем попытались применить идентификацию перекрестного взаимодействия медь-глутатион к онкогенезу. Действительно, быстрое размножение, связанное с онкогенезом, требует, чтобы раковые клетки увеличивали энергетический метаболизм и запускали клеточные механизмы для ответа на онкогенный стресс, чтобы поддерживать неограниченный рост опухоли, выживаемость и терапевтическую резистентность.Например, многие солидные опухоли демонстрируют повышенную продукцию активных форм кислорода (АФК) в ответ на более высокие энергетические потребности и дисфункцию митохондрий. В результате это вызывает антиоксидантную программу по детоксикации от АФК и поддержанию более надежного окислительно-восстановительного баланса (78). Например, MEF, экспрессирующие условные онкогенные аллели KRAS G12D или BRAF V619E , демонстрируют пониженные уровни внутриклеточных ROS с сопутствующим увеличением экспрессии мРНК генов метаболизма глутатиона Gclc и Gclm (79).Более того, эктопическая экспрессия KRAS G12D увеличивает общий уровень GSH, но снижает соотношение GSH / GSSG. Однако остается недостаточно понятным, изменяют ли онкогенные мутации в BRAF или KRAS внутриклеточные пулы лабильной Cu (I), нарушая внутриклеточный окислительно-восстановительный баланс, особенно через глутатионовые пути.

    Чтобы ответить на этот вопрос, иммортализованные MEF трансформировали с помощью BRAF V600E или KRAS G12D , а уровни внутриклеточной лабильной Cu (I) оценивали с помощью логометрической визуализации FCP-1.Интересно, что мы наблюдали снижение средней ратиометрической флуоресценции клеток как у BRAF V600E , так и у KRAS G12D -трансформированных клеток MEF, как считалось FCP-1 F зеленый / F оранжевый соотношение по сравнению с контрольные конгенеры (рис. 6 A и B ). Эти результаты были фенокопированы в экспериментах по визуализации живых клеток с использованием комплементарного зонда CF4, что позволяет предположить, что свободно связанные пулы внутриклеточной Cu (I) уменьшаются при онкогенной трансформации ( SI Приложение , рис.S21 A и B ). В соответствии с этим мы обнаружили, что стабильность белка CCS, который деградирует зависимым от Cu образом, повышается в клетках, стабильно экспрессирующих эти онкогены, или когда клетки обрабатывают хелатором Cu BCS в качестве положительного контроля, что свидетельствует об истощении лабильных внутриклеточных клеток. Cu бассейны (рис.6 C ). Чтобы определить, отражается ли наблюдаемый лабильный дефицит Cu (I), обнаруженный с помощью визуализации живых клеток FCP-1 и CF4, на изменениях общих клеточных уровней Cu, ICP-MS выполняли для контроля, BRAF V600E — или KRAS . G12D -экспрессирующие MEF, и эти клетки показали неизменные уровни общей Cu (рис.6 D ), подтверждая, что выборочно изменяется лабильный пул Cu (I), а не общий пул Cu. Кроме того, уровни транскрипта Ctr1 как в клетках BRAF V600E , так и в клетках KRAS G12D остаются аналогичными контрольным клеткам, что позволяет предположить, что наблюдаемое снижение лабильных уровней Cu (I) не связано с изменениями в импорте Cu в клетки (рис. 6). E ). Хотя уровни транскрипта Atp7a были незначительно ниже как в клетках BRAF V600E , так и в клетках KRAS G12D (рис.6 F ), эти изменения в экспрессии мРНК Atp7a могут отражать клетки, чувствительные к более низким уровням биодоступности Cu (I). В качестве альтернативной гипотезе дифференциальной экспрессии транспортеров Cu CTR1 и ATP7A для снижения уровней лабильного Cu (I) недавние исследования установили, что снижение уровней CTR1 или введение поверхностно доступных мутаций в MEK1, который функционирует ниже онкогенного BRAF V600E , как подход к нарушению связывания Cu уменьшил BRAF V600E -управляемую передачу сигналов и рост опухоли (5, 80).Таким образом, взаимодействие Cu-MEK1 / 2 необходимо для передачи сигналов, управляемых BRAF V600E , и канцерогенеза, а снижение лабильных уровней Cu в MEF, трансформированных BRAF V600E , потенциально может быть вызвано увеличенной доставкой Cu в MEK1 / 2 для поддержки гиперактивации. передача сигналов митоген-активируемой протеинкиназы. Чтобы экспериментально рассмотреть эту возможность, MEF, трансформированные BRAF V600E , были сконструированы для стабильной экспрессии скремблируемой shRNA или Mek1 shRNA с РНК-опосредованной интерференционной устойчивой MEK1 дикого типа или Cu-связывающего мутанта MEK1 (MEK1 CBM ). и ратиометрическую флуоресценцию от FCP-1 в этих клеточных линиях сравнивали с нетрансформированными MEF.Хотя экспрессия BRAF V600E снижала F зеленый / F оранжевый на ∼20%, снижение сохранялось в присутствии как MEK1 дикого типа, так и MEK1 CBM , что свидетельствует о наблюдаемом снижении лабильный пул Cu (I) не зависит от связывания MEK1 / 2 Cu ( SI Приложение , рис. S22).

    Рис. 6.

    Онкогенный BRAF V600E и KRAS G12D приводят к снижению лабильных пулов Cu (I) за счет снижения уровней Gsr и увеличения экспрессии CCS.( A ) Репрезентативная ратиометрическая визуализация живых клеток FCP-1 на MEF, стабильно экспрессирующих ненаправленную контрольную кшРНК ( Scr ), BRAF V600E кДНК или KRAS 12 кДНК KRAS 12 . ( B ) Количественная оценка средней флуоресценции FCP-1 ( F зеленый / F оранжевый ) ± SEM для MEF, стабильно экспрессирующих Scr , BRAF V600E AS G12D кДНК.Результаты сравнивали с использованием однофакторного дисперсионного анализа с последующим многократным сравнением Даннета. Данные взяты из анализа 105 или более отдельных ячеек. ( C ) Обнаружение иммуноблотом CCS или ACTIN в MEF, стабильно экспрессирующих Scr , BRAF V600E кДНК или KRAS BCG12D кДНК или кДНК кДНК или кДНК Количественное определение: ΔCCS / ACTIN, нормализованное до Scr . Результаты 3 независимых биологических повторов сравнивали с использованием непарного теста t .( D ) Количественная оценка средних уровней Cu (частей на миллион, ppm), обнаруженных с помощью ICP-MS для MEF, стабильно экспрессирующих Scr , BRAF V600E кДНК или KRAS G12D cDNA на массу образца ± SEM ( n = 5). Результаты сравнивали с использованием однофакторного дисперсионного анализа с последующим многократным сравнением Даннета. ( E и F ) Экспрессия qPCR мРНК Ctr1 или Atp7a из MEF, стабильно экспрессирующих Scr , BRAF V600E кДНК KRNA кДНК KRK( n = 4). Результаты сравнивали с использованием однофакторного дисперсионного анализа с последующим многократным сравнением Даннета. ( G и H ) Количественное определение общего клеточного глутатиона (GSH, мкМ) или отношения GSH к GSSG (GSH / GSSG) ± SEM из MEF, стабильно экспрессирующих Scr , BRAF V600E , или KRAS G12D кДНК. Результаты сравнивали с использованием однофакторного дисперсионного анализа с последующим тестом множественного сравнения Даннета ( n, ≥ 11).Данные взяты из 4 биологических повторностей, проведенных в трех повторностях. ( I и J ) Экспрессия кПЦР мРНК Gclc или Gsr из MEF, стабильно экспрессирующих Scr , BRAF V600E кДНК или кДНК Gclc KRAS . Результаты сравнивали с использованием однофакторного дисперсионного анализа с последующим тестом множественного сравнения Даннета ( n = 4). Данные взяты из 4 биологических повторностей, проведенных в трех повторностях.( K ) Обнаружение иммуноблотом GCLC, GSR или ACTIN в MEF, стабильно экспрессирующих Scr , BRAF V600E кДНК или KRAS G12D кДНК. Количественное определение: ΔGCLC / ACTIN или ΔGSR / ACTIN, нормализованные до Scr . Результаты 3 независимых биологических повторов сравнивали с использованием непарного теста t . ( L ) Анализ проточной цитометрии уровня ROS, количественно выраженный средней интенсивностью флуоресценции CellROX Green ± SEM для MEF, стабильно экспрессирующих Scr , BRAF V600E кДНК или KRAS 9060D кДНК.Результаты сравнивали с использованием однофакторного дисперсионного анализа с последующим тестом множественного сравнения Даннета ( n, ≥ 11). * P <0,05, ** P <0,01 и **** P <0,0001; нс, статистически не значимо. ( M ) Предполагаемые эффекты онкогенной активации BRAF V600E или KRAS G12D на биодоступность лабильных пулов Cu (I).

    Учитывая наши коллективные результаты, которые показывают, что Cu (I) кажется менее биодоступным в контексте онкогенной трансформации, мы предположили, что различия в метаболизме глутатиона могут быть движущей силой фенотипа.С этой целью мы протестировали общие уровни GSH и отношения GSH / GSSG в MEF, трансформированных онкогенным BRAF V600E или KRAS G12D , и обнаружили, что экспрессия любого из онкогенов увеличивает общие уровни GSH, хотя только статистически значимо в KRAS G12D. ячеек (рис.6 G ). К нашему удивлению, отношения GSH / GSSG были значительно ниже в BRAF V600E и KRAS G12D , стабильно экспрессирующих MEF, по сравнению с контрольными клетками (фиг. 6 H ).Поскольку MEF, трансформированные BRAF V600E и KRAS G12D , фенокопировали генетический нокдаун Gsr в отношении пониженной ратиометрической флуоресценции от FCP-1 и уменьшенного отношения GSH / GSSG, уровни экспрессии белка Gsr и мРНК были допросили. При нормализации к контрольным клеткам уровни транскрипта Gsr были значительно снижены при стабильной экспрессии либо BRAF V600E , либо KRAS G12D , тогда как уровни транскрипта Gclc остались относительно неизменными среди них (рис.6 I и J ). Параллельно с уровнями транскрипта Gsr экспрессия белка GSR снижалась в клетках BRAF V600E и KRAS G12D по сравнению с контрольными клетками (фиг. 6 K ). Напротив, уровни белка GCLC были выше в клетках BRAF V600E и KRAS G12D по сравнению с контрольными клетками (фиг. 6 K ). Чтобы еще больше подтвердить связь между онкогенезом, гомеостазом меди и изменениями экспрессии фермента метаболизма глутатиона, как BRAF V600E , так и KRAS G12D значительно увеличили уровни зеленой флуоресценции CellROX (рис.6 L ), предполагая, что онкогенная трансформация увеличивает ROS и, в свою очередь, снижает лабильный пул Cu (I). Из этих данных мы заключаем, что клетки, трансформированные BRAF V600E и KRAS G12D , демонстрируют лабильный дефицит Cu (I), частично из-за снижения уровней Gsr и повышенных уровней ROS, которые оба могут способствовать более окисленному клеточная среда из-за неспособности регенерировать GSH (рис. 6 M ).

    Заключительные замечания

    Сложное и динамическое взаимодействие между лабильными и полными пулами металлов имеет значение для гомеостаза металлов и дисрегуляции металлов в здоровом и болезненном состояниях.Медь является ярким примером этой дихотомии сигнал / стресс, поскольку ее мощная окислительно-восстановительная активность делает ее важным питательным веществом, но такая же химическая реакционная способность делает потерю гомеостаза меди опасностью для окислительно-восстановительного баланса клетки. Чтобы удовлетворить потребность в новых химических инструментах для исследования лабильных пулов меди, которые будут использоваться в сочетании с дополнительными традиционными методами определения общего состояния меди, мы разработали FCP-1, ратиометрический датчик FRET первого поколения, основанный на активности, который обеспечивает выборочную визуализацию лабильных Cu (I) объединяется в живых клетках с самокалибрующейся реакцией.FCP-1 использует классический мотив биоинорганического лиганда TPA для Cu (I) -зависимого расщепления, чтобы регулировать FRET между донорными единицами флуоресцеина и акцепторами родамина в зависимости от дозы, обеспечивая высокую специфичность к металлу и степени окисления для Cu (I). Благодаря своей логометрической реакции, FCP-1 способен визуализировать динамические изменения уровней лабильного Cu (I) в живых клетках с добавлением меди и / или хелатированием, а также отслеживать снижение уровня эндогенного лабильного Cu (I) в клетках с дефицитом MEF. в транспортере меди CTR1.Действительно, ратиометрическое считывание FCP-1 с внутренней самокалибровкой двух эмиссионных сигнатур является ключевым отличительным признаком для мониторинга базальных уровней лабильного Cu (I) в разных клеточных линиях, так как контрольный зонд FL-TPA, который использует тот же самый триггер на основе активности, но реагирует только в режиме интенсивности при 1 считывании выбросов, не может отличить лабильный статус Cu (I) между линиями CTR1 дикого типа и нокаутными линиями CTR из-за вариабельности загрузки зонда.

    На этом фоне мы применили FCP-1 для визуализации изменений в лабильных пулах Cu (I) в условиях окислительно-восстановительного стресса, уделяя особое внимание связи между гомеостазом меди и глутатиона.Действительно, мы наблюдали повышенные уровни лабильной Cu (I) в клетках с нокдауном Gclc , которые обладают меньшим количеством общего GSH по сравнению с соответствующими контролями дикого типа, тогда как мы обнаружили более низкие уровни лабильной Cu (I) в Gsr . нокдаун клеток относительно контрольных конгенеров. Эти данные визуализации отслеживают значительное уменьшение отношения GSH / GSSG в клетках с нокдауном Gsr , но не в клетках с нокдауном Gclc . Более того, мы идентифицировали снижение соотношения GSH / GSSG в MEF, трансформированных онкогенным BRAF V600E или KRAS G12D , что, в свою очередь, вызывает лабильный дефицит Cu (I).В сочетании с тем фактом, что общие уровни меди остаются неизменными в линиях нокдауна Gclc или Gsr и онкогенных клеточных линиях BRAF V600E или KRAS G12D , и что мы также наблюдаем более высокую экспрессию белка CCS, который может прочно связывать медь и более низкие уровни лабильной Cu (I), ратиометрические измерения флуоресценции FCP-1 показывают, что на пул лабильных Cu (I) избирательно влияет трансформация онкогенов по всему пулу меди. Разное

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *