Продажа квадроциклов, снегоходов и мототехники
second logo
Пн-Чт: 10:00-20:00
Пт-Сб: 10:00-19:00 Вс: выходной

+7 (812) 924 3 942

+7 (911) 924 3 942

Содержание

Технические характеристики Лада Х Рей 2021 / Lada XRAY

Ниже представлены основные технические характеристики Лада Х Рей 2018-2019 / Lada XRAY в новом кузове для российского рынка.

В таблице приведены основные параметры: габаритные размеры, расход топлива (бензина), дорожный просвет (клиренс), масса (вес), объем багажника и бака, двигатели, коробки передач, тип привода, динамические характеристики и т.д.

Кузов

Тип кузова хэтчбек
Класс автомобиля класс B
Длина / ширина / высота, мм 4165 / 1764 / 1570
Колесная база, мм 2592
Клиренс (дорожный просвет), мм 195
Объем багажника, л 361 / 1207
Снаряженная масса, кг 1190
Объем топливного бака, л 50

Двигатель и трансмиссия

Тип двигателя бензин бензин
Объем, л 1,6 1,8
Мощность, л.с. 106 122
Крутящий момент, Нм 148 173
Тип коробки передач механика робот
Число передач 5 5
Привод передний передний
Разгон 0-100 км/ч, с 11,9 10,9
Макс скорость, км/ч 170 183
Расход топлива, л    
— город 9,3 8.6
— трасса 5,9 5.8
— смешанный 7,5 7,1
Тип топлива АИ-95 АИ-95

Двигатель и трансмиссия

Тип двигателя бензин  
Объем, л 1,6  
Мощность, л.с. 110  
Крутящий момент, Нм 150  
Тип коробки передач механика  
Число передач 5  
Привод передний  
Разгон 0-100 км/ч, с 10,3  
Макс скорость, км/ч 171  
Расход топлива, л    
— город 8.9  
— трасса 5.6   
— смешанный 6,9  
Тип топлива АИ-95  

Технические характеристики Лада Х Рей 2021

Дополнительную техническую информацию уточняйте у официальных дилеров.

Технические характеристики Лада Х Рей / МирАвто Лада

Технические характеристики Лада Х Рей кроссовер в цифрах. На Лада Икс Рей устанавливаются новые современные моторы от АвтоВАЗа и концерна Reanult объемом 1.6 и 1.8 литра мощностью 106, 110 и 122 л.с. Новый уровень безопасности для автомобиля: ЭРА ГЛОНАСС, ABS с Brake Assist, ESP, фронтальные подушки безопасности, дневные ходовые огни и Isofix. Краш тест Lada Xray пока не проводился.

Технические характеристики в цифрах

  • 100 000 Гарантия (км)

  • 15 000 Интервал ТО (км)

  • 195 Клиренс (см)

  • Краш тест

  • 361 Объем багажника (л.)

  • 50 Объем бака (л.)


С двигателем 106 л.с. механика

  • 1.6 л. 16-кл.

    Тип двигателя

  • 9.3 л. 5.9 л.  

    Расход на 100 км

  • 176 км/ч

    Максимальная скорость

  • 11.4 с.

    Разгон до 100 км/ч

  • 5МТ   

    Тип коробки передач

  • 694 км

    Запас хода по трассе

С двигателем 110 л.с. механика

  • 1.6 л. 16-кл.

    Тип двигателя

  • 8.9 л. 5.6 л.  

    Расход на 100 км

  • 181 км/ч

    Максимальная скорость

  • 11.1 с.

    Разгон до 100 км/ч

  • 5МТ   

    Тип коробки передач

  • 735 км

    Запас хода по трассе

С двигателем 122 л.с. робот

  • 1.8 л. 16-кл.

    Тип двигателя

  • 8.6 л. 5.8 л.  

    Расход на 100 км

  • 186 км/ч

    Максимальная скорость

  • 10.9 с.

    Разгон до 100 км/ч

  • 5АМТ   

    Тип коробки передач

  • 735 км

    Запас хода по трассе

Лада XRay технические характеристики — двигатель, коробка передач, габариты, клиренс, кузов, подвеска (фото, видео)

Возможно, качество продукции концерна «АвтоВАЗ» с последними внесенными изменениями в новые модели, вскоре перестанет быть поводом для анекдотов – и это не может не радовать. Технические характеристики  новой Лады XRay уже успели поразить многих.

Описание возможностей разработки

Как видно на предложенных фото, которые были сделаны еще во время предварительного показа концептов Икс Рей и Весты еще в 2014 году, данный автомобиль имеет внушительные габаритные размеры. Длина кузова составляет 4165 мм, его ширина – 1764 мм и высота – 1570 мм. Данные габариты, как и колесная база длиной 2592 мм, останутся, по заявлениям конструкторов, едиными для всех автомобилей Лада Х Рей. Характеристики, относящиеся к другим показателям и параметрам, могут существенно отличаться.

Касательно модификаций и изменений данной модели, конструкторы и генеральный директор автомобильного концерна «АвтоВАЗ» заявили о том, что Икс Рей будет выпускаться в трех разнообразных версиях привода. Кузов, по заверению руководства концерна, останется неизменным (относительно того вида, в котором сейчас серийно производится Лада XRay) – однако не исключается возможность легкого рестайлинга в случае таковой необходимости.

В настоящее время готов к выходу в продажу только переднеприводный вариант этого нового автомобиля. Выход в свет версии Лады Икс Рей Cross в полном приводе в виде полноправного внедорожника должен состояться во второй половине 2016 года – и примерно в это же время будет выпущен автомобиль с переключаемым полным приводом 4х2, сочетающий все преимущества двух описанных модификаций.

Хэтчбек Лада Икс Рей

Конструкторы «АвтоВАЗ» еще до начала разработки серийной модели заявили, что данный автомобиль не будет претендовать на звание городского кроссовера, даже несмотря на огромное внешнее сходство. Во всех источниках, благодаря этому, данный автомобиль упоминается исключительно как хэтчбек (либо SUV).

Многие отечественные автолюбители с нетерпением ждали новый автомобиль Лада XRay хэтчбек – характеристики и практически полное устранение всех ошибок предыдущих провальных моделей сыграли свою роль. Машина отлично подойдет как для городской езды, так и для использования для путешествия по разбитым гравийным дорогам, благодаря высокому (195 мм в снаряженном состоянии) клиренсу и мощной подвеске. Подвеска, по мнению экспертов, получилась очень динамичной и приятной: передняя выполнена независимой, по системе Мак-Ферсон, а задняя представляет собой цельную упругую балку с мощными рессорами.

Несмотря на то, что данная модель не является внедорожником, конструкторы сделали все возможное, чтобы сделать этот автомобиль более устойчивым на трассе. Задняя ось длиннее передней на 35 мм, благодаря чему автомобилю будет значительно динамичнее и маневреннее, чем ожидается от машины подобных габаритов.

Силовые агрегаты

Технические характеристики новой Лады Х-Рей во многом зависят и от примененных для ее сборки силовых агрегатов. Стоит рассмотреть предложенные конструкторами возможности и оценить все то, что может быть размещено под капотом данной модели.

Наиболее простой и дешевый силовой агрегат, применяемый для оснащения данного автомобиля, состоит из стандартного «вазовского» 1.6-литрового двигателя мощностью 106 лошадиных сил и дополняется французской пятиступенчатой трансмиссией ручного переключения от Renault. И двигатель, и МКПП уже были использованы в целом ряде предыдущих разработок (мотор с оглушительным успехом был применен в разработке седана Лада Веста, коробка передач – также при сборке этой модели). Механическая трансмиссия отечественного производства не используется ввиду своей шумности, которую так и не удалось «вылечить» после выхода в продажу Лады Калины.

Более продвинутая версия силового агрегата сочетает ту же трансмиссию с 1.6-литровым двигателем от Nissan, мощностью 110 лошадиных сил. Разница достаточно невелика, однако этот мотор объективно лучше отечественного, производительнее и долговечнее.

Наиболее мощный силовой агрегат, предложенный для хэтчбека Lada XRay, сочетает 1.8 литровый шестнадцатиклапанник мощностью 122 л.с. с пятиступенчатой роботизированной АКПП (АМТ). Характеристики автомата Лада Икс Рей будут существенно выше, чем у предыдущих комплектаций, ввиду значительно большей мощности двигателя. Тем не менее, существенно вырастет и расход топлива, что делает лучший силовой агрегат из предложенных «палкой о двух концах».

Скорость, разгон и расход топлива

Каждый из предложенных силовых агрегатов имеет свои возможности. Их стоит рассмотреть более детально.

  • Силовой агрегат на базе 106-сильного двигателя имеет неплохие показатели расхода топлива (7.6 литров на 100 километров), однако достаточно слабый разгон (11.9 секунд от 0 до 100 километров в час). Максимальная скорость модели, оснащенной этим двигателем, составляет всего 170 км/ч – ниже, чем у базовой комплектации Весты ввиду большей массы.
  • Силовой агрегат на базе 110-сильного мотора разгоняется значительно резвее – от нуля до сотни он может разогнаться всего за 10.3 секунды. Максимальная скорость не сильно отличается от предыдущего агрегата – всего 171 км/ч, однако расход топлива существенно ниже и составляет всего 6.9 литра на 100 километров.
  • Наиболее мощный и производительный агрегат на базе 122-сильного двигателя способен развить скорость до 183 км/ч и значительно более динамичен. Тем не менее, автоматическое переключение передач существенно снижает способность автомобиля к быстрому разгону с места. При большей мощности данный силовой агрегат позволяет с места разогнаться до 100 км/ч за 10.9 секунд. Тем не менее, автомат позволяет снизить расход топлива: нужно всего 7.1 литра на 100 км пути.

Данная выкладка позволяет с уверенностью говорить о том, что оснащаемая исключительно первым типом силового агрегата комплектация Икс Рей «Оптима» вряд ли будет пользоваться высоким спросом. Покупателю будет выгоднее приобрести более продвинутую версию, которая в эксплуатации будет и удобнее, и дешевле.

Комплектации

В настоящее время автомобиль предложен в четырех типах комплектации, характеристики и цены на которые уже известны и общедоступны на официальном сайте концерна «АвтоВАЗ». Существует две основных комплектации (Оптима и Топ) и два пакета дополнительных опций, доступных для оснащения автомобиля определенной комплектации (Комфорт – для базовой, Престиж – для высшей).

Примечательно, что базовая версия Оптима (без пакета опций Комфорт) может быть снабжена исключительно первым описанным силовым агрегатом. Все остальные версии комплектаций автомобиля могут быть оснащены как вторым, так и третьим силовым агрегатом – в зависимости от предпочтений покупателя.

Интерьер и «начинка» автомобилей серьезно зависят от того, какую комплектацию выберет пользователь. К примеру, магнитола и бортовой компьютер есть уже в базовой версии Лады Х-Рей, а кондиционер появляется только при выборе версии не ниже Комфорт. Максимальная комплектация предлагает покупателю комфортный салон с кожаными элементами, сенсорную мультимедийную панель (известную еще по Весте), сиденья с подогревом и массу других приятных и полезных функций.

Внедорожник Лада Икс Рей Кросс

Характеристики кроссовера Лада XRay пока еще не известны. Тем не менее, известно, что его планируют выпускать в двух модификациях: постоянный и переключаемый полный привод. Какие изменения должны будут коснуться этих автомобилей для того, чтобы они могли считаться полноценными внедорожниками – автомобилями повышенной проходимости?

В первую очередь, наверняка будет существенно переработана схема силовых агрегатов. Полный привод передает усилия двигателя на обе колесные оси, снижая в итоге максимальную скорость и динамичность машины в обмен на увеличенную тягу. Для того, чтобы автомобиль не стал излишне тихоходным, характеристики моторов должны будут быть достаточными для обеспечения нужд полного привода. Предполагается, что в качестве базового мотора будет взят используемый и сейчас 1.8-литровый двигатель от «АвтоВАЗ» с номинальной мощностью 122 лошадиных силы, а для оснащения более продвинутых версий – турбированный двигатель той же марки, усиленный до 140 «лошадей».

Скорее всего, изменения коснутся и подвески. Характеристики Lada XRay Cross должны быть направлены на то, чтобы автомобиль комфортно эксплуатировался даже в условиях бездорожья. Все-таки хэтчбек с передним приводом, хоть и является оптимальным сочетанием возможностей, разработан в первую очередь для городского использования. Подвеску, по мнению экспертов, придется усиливать и видоизменять для полного соблюдения портрета будущего внедорожника.

Существует также неподтвержденная информация, ставшая доступной общественности, что концерн собирается прекратить разработку полноприводных версий Икс Рей. Многие автолюбители России уже выразили недовольство этим фактом.

Тем не менее, отзывы о Lada XRay содержат слишком много упоминаний об ожидании полноприводных версий, чтобы руководство концерна «АвтоВАЗ» могло закрыть на них глаза и остановить разработку. Как показывают некоторые статистические данные, практически половина всех автолюбителей с нетерпением ожидают кросс-версию Икс Рей.

Таблица ТТХ: Технические характеристики Lada XRay

Автомобиль Лада XRAY: Технические характеристики
Объем двигателя 1.6 (106 л.с.) 1.6 (114 л.с.) 1.8 (123 л.с.)
Тип кузова 5-дверный хэтчбек
Число мест 5
Длина, мм 4164
Ширина, мм 1764
Высота, мм 1570
Колесная база, мм 2592
Дорожный просвет (клиренс), мм 190
Снаряженная масса, кг 1140 1156 1135
Тип двигателя бензиновый, с распределенным впрыском
Расположение спереди, поперечно
Число и расположение цилиндров 4, в ряд
Рабочий объем, куб. см. 1596 1598 1774
Число клапанов 16 16 16
Максимальная мощность, л. с. (кВт) / об/мин 106 (78) 114 (84) 123 (90)
Максимальный крутящий момент, Нм / об/мин 148 155 178
Коробка передач механическая, 5-ступенчатая
Привод передний
Шины 195/65 R16, 205/55 R16
Максимальная скорость, км/ч 170 171 183
Время разгона 0-100 км/ч, с 11,9 10,3 10,9
Расход топлива в смешанном цикле, л/100 км 7,5 6,9 7,1
Емкость топливного бака, л 50
Тип топлива бензин, АИ-95

 

Лада Х Рэй: технические характеристики

Февраль 2016 года ознаменован появлением на российских рынках автомобилей нового хэтчбека: Lada XRAY. Пользовавшийся популярностью предшественник 2012 года кажется совсем не похожим на обновленного «брата», к тому же здесь уже используется французская платформа B0.

Модель отлично принята покупателями: в 2017 году Икс-рей занял девятую позицию в рейтинге продаж, показав результат в 33 319 экземпляров.

 

 

Сравнение двух моделей: XRAY и Sandero, их сходства и отличия

Данный хэтчбек – родственник с Renault Sandero Stepway, однако Икс-рей отличается оригинальностью кузова, перенастройкой шасси и собственной линейкой двигателей.

По статусу Икс-рей можно поставить ниже, чем его французский аналог. Такой вывод можно сделать, приглядевшись к мелочам. Икс-рей меньше похож на кроссовер, автомобиль не имеет защитного некрашеного обвеса. Но, по словам производителя, XRAY имеет прямое отношение к классу кроссоверов.

При том, что в базовой комплектации Sandero установлены колеса 16-ти дюймов, а диски имеют стиль литых, то рассматриваемая модель Икс-рей оснащена лишь 15-дюймовым вариантом, а колеса 16 и 17 дюймов можно приобрести только при покупке более дорогой версии.

Сопоставив колесную базу двух автомобилей, можно сделать выводы: Лада стоит на шасси основательнее – по габаритам авто длиннее на 8,5 см и шире на 0,7 см, а задняя колея увеличена здесь на 3,8 см. В чем же задумка данного апгрейда? Теперь у Икс-рея больше объем багажника (361 литр вместо 320). Клиренс сравним с французским автомобилем – 19,5 см.

Внутреннее оснащение автомобиля

Отличным от концепта выдался и интерьер Икс-рея. Вместо зачастую футуристичных деталей теперь предложен более практичный и традиционный вариант. Смотрится этот маневр уместно, стильно и современно. Клавиши управления подогревом сидений расположены не очень удобно, также имеются недочеты при функционировании мультимедиа с системой навигации. Камера заднего вида с экраном в 7 дюймов предоставляет хорошее изображение, но необходимо регулярно отслеживать камеру на предмет загрязнений – она размещена не слишком удачна и в моменты непогоды постоянно загрязняется.

Салон автомобиля оборудован нишами и карманами, а также вместительным бардачком. Климат-контроль присутствует исключительно в более дорогой комплектации, являясь только однозонным. Отсутствует центральный подлокотник на задних сиденьях. Кожаная отделка руля и рычага механической коробки передач имеется только в самых дорогостоящих комплектациях.

Ширина салона позволяет с комфортом разместить трех пассажиров на задних креслах.

Багажник автомобиля выполнен очень аккуратно, отличается вместительностью. Для более дорогой версии добавлено выгодное решение: двойной пол и съемная верхняя часть. Запаска представлена в полном размере, но при базовом диске 15-дюймов, независимо от того, какие колеса предусмотрены комплектацией.

Пару слов о езде по бездорожью

Сами производители повлекли увеличение стоимости эксплуатации автомобиля, заявив Икс-рей как кроссовер. Теперь при посещении автомойки автомобиль принадлежит к более дорогому классу. Но по характеристикам данная модель с натягом походит на хэтчбек. В комплектации отсутствуют характерные для кроссоверов элементы: пластиковая защита кузова, рейлинги.

 

 

Однако что касается езды по бездорожью, здесь не лишними будут короткая база и приподнятый кузов данного автомобиля. Но тогда понадобятся качественные шины с подходящим протектором для бездорожья.

Увеличенный клиренс (до 19,5 см) и стальная защита моторного отсека предназначены для уверенного движения по пересеченной местности. Если дно выглядит плоским, то здесь есть свои нюансы: проводка одного из датчиков на выхлопном тракте собирает по пути все ветки, камни и другие элементы бездорожья. Известны случаи, когда тормозная трубка на задней балке была сорвана в колее. Более того, нижняя губа становится слабым местом автомобиля не только на бездорожье, но и в случае парковки в городе – возможно повредить ее о бордюр.

В базовую комплектация автомобиля входят: фронтальные подушки безопасности, ESP (с возможностью отключения), система помощи при старте с уклонной поверхности, автоматическая блокировка дверных замков, светодиодные ходовые огни, бортовой компьютер. Имеются также регулировка по высоте кресла водителя, дистанционный ключ, передние электрические подъемники стекол, аудиосистема (с поддержкой USB, AUX и Bluetooth), складная спинка заднего дивана (в пропорции 40/60) и даже розетка в багажном отсеке.

 

Оценить статью

Понравилась статья? Поделиться с друзьями:

Технические характеристики новой Lada X-RAY

Автомобиль Лада Х-Рей – первый отечественный кроссовер, выпущенный АвтоВАЗом еще летом, 2012 года. Над созданием его дизайна работали как наши инженеры, так и коллеги из Италии. В 2014 году, модель Lada X-REY выступила на московской выставке, в качестве главного экспоната, собрав на себе большое количество взглядов и внимания. Для того, чтоб узнать данный кроссовер получше, давайте проведем его обзор в данной статье.

Двигатель и трансмиссия

Технические характеристики двигателя xrey имеют три заводские вариации, обзор которых вы сможете увидеть далее. Самая первая, с наиболее низкой мощностью – 16-ти клапанный бензиновый мотор, рабочим объемом 1,6 литра. При его максимальной нагрузке, кроссовер мог развивать до 170 км/час максимальной скорости, и получать до 106 лошадиных сил мощности. Такие характеристики достигались при вращении коленчатого вала, со скоростью 5800 об/мин.

Максимально эффективный крутящий момент двигателя xrey, достигался на 4200 об/мин, а далее мотор работает через силу. Даже несмотря на то, что Лада Х-Рей – это кроссовер, до первой сотни он доходил, буквально за 11,9 секунды. Такие характеристики не сильно отличались от характеристик отечественного седана, такого как Лада Веста или Гранта.

Что касается расхода топлива, на каждую сотню, то он не превышал 7,5 литров, при работе в смешанном режиме. Рекомендуемый бензин для двигателя Lada X-REY – не менее АИ – 95. Данная комплектация оснащалась 5-ти ступенчатой механической коробкой передач. Максимальный объем топливного бака всех вариаций – 50 литров. На этом, обзор первого варианта двигателя xrey окончен, и можно переходить ко второму.

Второй вариант мотора Лада Х-Рей, имеет практически такие же технические характеристики, как и первый. Его рабочий объем – 1600 кубов, а количество клапанов – 16. При максимальной работе второй вариации мотора, кроссовер Lada X-REY сможет развить 171 км/час, что вовсе не ощущается по сравнению с первым вариантом. Мощность, также увеличена не существенно – 110 лошадей, вместо 106.

Плюс второй вариации xrey в том, что его максимальные технические характеристики достигаются при меньшей скорости вращения коленчатого вала – при 5500 об/мин, тем самым экономя на каждой сотне пробега по 0,6 литра бензина, что значительно ощущается при длительных поездках.

Максимальный крутящий момент Lada X-REY, во втором варианте мотора, также уменьшен до 4000 тыс., что позволяет машине разгонятся до сотни быстрее – за 10,3 секунды. Данная модификация, также имеет 5-ти ступенчатую механику. Обзор второго варианта также завершен, и мы переходим к последнему, самому мощному варианту мотора xrey.

Технические характеристики третьей вариации мотора Лада Х-Рей, значительно отличаются от предыдущих. Рабочий объем всех четырех цилиндров, составляет 1800 кубических сантиметров, а количество клапанов, также равно 16-ти. При максимальной нагрузке такого агрегата, кроссовер достигает максимальной скорости в 183 км/час, и развивает номинальную мощность в 122 лошадиные силы, что на 12 лошадей больше, чем во второй вариации.

Максимальный крутящий момент, Lada X-REY получает при скорости вращения коленчатого вала, в 6000 об/мин. При этом, машина потребляет около 7,1 литра топлива, на каждую сотню километров пробега. Как нам показал обзор предыдущих вариантов, разница практически не значительная.

Разгон до первой сотни, занимает порядка 10,9 секунд. Такой показатель довольно высокий, учитывая тип кузова xrey. Данная модификация, в отличии от предыдущих, оснащена автоматической коробкой передач, имеющей 5 ступеней. На этом, обзор модификаций моторов окончен, и теперь давайте изучим остальные характеристики Lada X-REY, такие как: максимально допустимый вес, габаритные размеры, и т.д.

Кузов и грузоподъемность

Машина Лада Х-Рей, имеет кузов, типа: 5-ти дверный хэтчбек. Ее габаритные размеры, очень схожие с размерами Renault Sandero. Длина кузова xrey, достигает 4165 мм, ширина – 1764 мм, а высота – 1570 мм. даже несмотря на то, что Lada X-REY – это кроссовер, его высота всего на 70 мм больше, чем у стандартного отечественного седана.

Большой плюс данной модели – высокий клиренс – 195 мм. Он позволяет преодолевать значительные препятствия на бездорожье, а также высокие бордюры в городе. Кстати, клиренс у Renault Sandero имеет точно такие же размеры, как и у xrey.

Lada X-REY базовой версии, выпускается в двух вариациях колес – R15 и R16. При этом, размеры колеи у обоих вариаций, будут несколько разные. При варианте в R15, размеры передней колеи будут равны 1592 мм, а задней – 1532 мм. А вот при варианте в R16, передняя колея будет иметь 1484 мм, и задняя – 1524 мм. На этом, обзор габаритов окончен, и можно перейти к грузоподъемности.

Максимально допустимый вес, который способен «поднять» xrey, равен 590 кг. Сам же вес автомобиля довольно невелик – всего 1190 кг. В цифру 590 кг, входит вес всех пассажиров, и вес груза, положенного в багажное отделение, объемом 350 литров.

Нагрузка на обе оси автомобиля Лада Х-Рей, распределена примерно так: 51 % на переднюю ось, и 49 % веса на заднюю ось. То есть, вес автомобиля, практически поровну разделен между обеими осями, что дает машине преимущество на бездорожье.

Также, на модель Lada X-REY предусмотрено прицепное устройство, позволяющее перевозить дополнительный груз, вес которого не будет превышать 300 кг. Конечно, при подсоединении прицепа, длина машины значительно увеличится, и снизится ее маневренность. Кстати, стоит отметить, что дополнительный вес на прицепном устройстве, практически не влияет на клиренс. На этом, обзор габаритов Лада Х-Рей завершен.

Подводя итоги…

Проведя детальный обзор автомобиля Lada X-REY, можно сделать некоторые выводы. При разработке данной модели, инженеры максимально постарались над вариациями мотора, которые позволяют выдавать такие же характеристики, как и у отечественных седанов, последнего поколения.

Также, несмотря на то, что Лада Х-Рей – кроссовер, его габаритные размеры также невелики, что увеличивает комфорт управления, и ездовые качества по бездорожью. Вес автомобиля, также положительно сказывается на его проходимости, так как он не превышает нормы седана. Таким образом, модель Лада Х-Рей, можно смело считать удачным отечественным кроссовером, способным конкурировать с зарубежными оппонентами.

Технические характеристики LADA XRAY Cross

1.8 л 16-кл. (122 л.с.), 5МТ
Кузов
Колесная формула / ведущие колеса4 х 2 / передние
Расположение двигателяпереднее поперечное
Тип кузова / количество дверейкроссовер / 5
Количество мест5
Длина / ширина (по зеркалам) / высота по антенне, мм4171 / 1810 (1983) / 1645
База, мм2592
Колея передних / задних колес, мм1503 / 1546
Дорожный просвет, мм215
Объем багажного отделения в пассажирском / грузовом вариантах, л361 / 1207…1514
Двигатель
Код двигателя21179
Тип двигателябензиновый
Система питаниявпрыск топлива с электронным управлением
Количество, расположение цилиндров4, рядное
Рабочий объем, куб. см1774
Максимальная мощность, кВт (л.с.) / об. мин.90 (122) / 6050
Максимальный крутящий момент, Нм / об. мин.170 / 3700
Рекомендуемое топливобензин 92, 95
Динамические характеристики
Максимальная скорость, км/ч180
Время разгона 0-100 км/ч, с10,9
Расход топлива
Городской цикл, л/100 км9,7
Загородный цикл, л/100 км6,3
Смешанный цикл, л/100 км7,5
Масса
Снаряженная масса, кг1295…1300
Технически допустимая максимальная масса, кг1650
Максимальная масса прицепа без тормозной системы / с тормозной системой, кг650 / 800
Объем топливного бака, л50
Трансмиссия
Тип трансмиссии5МТ
Передаточное число главной передачи4,2
Подвеска
Передняянезависимая, типа Макферсон, пружинная, с гидравлическими или газонаполненными телескопическими амортизаторами, со стабилизатором поперечной устойчивости
Задняяполузависимая, рычажная, пружинная, с гидравлическими или газонаполненными телескопическими амортизаторами
Рулевое управление
Рулевой механизмшестерня-рейка
Шины
Размерность215/50 R17 (91, H)

Структурная информация из экспериментов с FRET одиночной молекулой с использованием системы быстрого нано-позиционирования

J Vis Exp. 2017; (120): 54782.

Тило Дёрфлер

1 Институт биофизики, Ульмский университет

Тобиас Эйлерт

1 Институт биофизики Ульмского университета

Карлхайнц

Институт биофизики Университет

Джулия Надь

1 Институт биофизики, Ульмский университет

Йенс Михаэлис

1 Институт биофизики, Ульмский университет

1 Институт биофизики, Ульмский университет

, равный номер.

Авторские права © 2017, Журнал визуализированных экспериментов Эта статья цитируется в других статьях PMC.

Abstract

Одномолекулярный резонансный перенос энергии Ферстера (smFRET) может использоваться для получения структурной информации о биомолекулярных комплексах в реальном времени. Таким образом, несколько измерений smFRET используются для локализации неизвестного положения красителя внутри белкового комплекса посредством трилатерации. Для получения количественной информации система нанопозиционирования (NPS) использует вероятностный анализ данных для объединения структурной информации из рентгеновской кристаллографии с данными флуоресценции одиночных молекул для расчета не только наиболее вероятного положения, но и полного трехмерного распределения вероятностей. , названный апостериорным, что указывает на экспериментальную неопределенность.Эта концепция была обобщена для анализа сетей smFRET, содержащих множество молекул красителей. Последняя версия NPS, Fast-NPS, включает новый алгоритм, использующий оценку байесовских параметров на основе выборки методом Монте-Карло цепи Маркова и параллельного темперирования, что позволяет анализировать большие сети smFRET за сравнительно короткое время. Более того, Fast-NPS позволяет рассчитать апостериор, выбирая одну из пяти различных моделей для каждого красителя, которые учитывают различное пространственное и ориентационное поведение, демонстрируемое молекулами красителя из-за их локального окружения.

Здесь мы представляем подробный протокол для получения данных smFRET и применения Fast-NPS. Мы предоставляем подробные инструкции для получения трех входных параметров Fast-NPS: значений smFRET, а также квантового выхода и анизотропии молекул красителя. Недавно NPS был использован для выяснения архитектуры открытого промоторного комплекса архей. Эти данные используются для демонстрации влияния пяти различных моделей красителей на апостериорное распределение.

Ключевые слова: Биохимия, Выпуск 120, Система нанопозиционирования, Fast-NPS, флуоресценция одиночных молекул, резонансный перенос энергии Фёрстера одиночных молекул, структурная биология

Введение

Определение структуры биомолекулы является ключевым предварительным условием для понимания его функции.Два хорошо зарекомендовавших себя метода определения структуры — криоэлектронная микроскопия и рентгеновская кристаллография1,2. Сегодня оба метода предоставляют структурную информацию с высоким разрешением и разрешением до уровня Ангстрема. Эти два метода широко используются для выяснения структуры больших биомолекул, таких как белковые комплексы. Хотя существующие методы постоянно совершенствовались на протяжении последних десятилетий, сложность биологических структур по-прежнему представляет собой серьезную проблему для структурной биологии, особенно при исследовании больших, динамических и переходных комплексов3.

Для изучения динамики макромолекулярных комплексов и, в частности, взаимосвязи структура-функция, методики исследования отдельных молекул предоставили полезную информацию4. Было разработано несколько новых стратегий, обеспечивающих ортогональный подход к получению структурной и динамической информации. Примерами являются высокоскоростной AFM5, механическое манипулирование6, флуоресцентная микроскопия локализации7, а также одномолекулярный резонансный перенос энергии Ферстера (smFRET) 8,9. С самого начала FRET был назван молекулярной линейкой из-за зависимости расстояния от масштаба биомакромолекул10.

Одним из особенно интересных приложений smFRET является использование информации о расстоянии, полученной из измерений smFRET, для вывода структурной информации11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23. Благодаря высокому временному разрешению smFRET положение мобильных частей белковой структуры может быть локализовано. Однако, чтобы извлечь количественную информацию из данных smFRET, во время измерения необходимо определить важные поправочные параметры о молекулах красителя24. С этими поправочными коэффициентами эффективность FRET E FRET может быть рассчитана по формуле

,

, где I A и I D — интенсивности флуоресценции молекулы донора и акцептора. соответственно (см. Рисунок 2 ).Β-фактор учитывает перекрестные помехи, утечку излучения донора в канал акцептора и рассчитывается по формуле

, где I ‘ A и I’ D — интенсивности флуоресценции донора и молекула-акцептор после фотообесцвечивания молекулы-акцептора.

γ-фактор корректирует разницу в относительной эффективности обнаружения в двух каналах, а также разницу в квантовом выходе флуоресценции донорного и акцепторного красителей.Он рассчитывается по каждому индивидуальному временному графику с помощью

. Обратите внимание, что в этом описании не учитывается прямое возбуждение акцепторной молекулы, которое иногда становится важным и также требует корректировки. Для определения этих поправочных коэффициентов полезно возбуждать как донор, так и акцептор по чередующейся схеме25, чтобы различать фотофизические изменения и структурную динамику.

Для получения не только количественной эффективности smFRET, но и количественной структурной информации, в 2008 году была введена система нанопозиционирования (NPS).Название было выбрано на основе его сходства со спутниковой системой глобального позиционирования (GPS). NPS — это гибридный метод, сочетающий данные smFRET и рентгеновской кристаллографии для локализации неизвестных положений красителя в биомакромолекулярных комплексах. Кристаллическая структура служит опорным кадром, а результаты smFRET используются для получения информации о расстоянии между неизвестным положением флуорофора (антенна , ) и положением, известным из кристаллической структуры (спутник , ).В последовательных экспериментах измеряются расстояния между антенной и несколькими спутниками, а положение антенны определяется с помощью статистически строгой схемы анализа, основанной на оценке байесовских параметров. В результате вычисляется не только наиболее вероятное положение антенны, но и ее полное трехмерное распределение неопределенности, так называемое апостериорное, визуализируемое с помощью достоверных объемов. Кроме того, NPS был расширен, чтобы обеспечить возможность анализа полных сетей smFRET27.

NPS использовался для решения ряда важных вопросов эукариотической транскрипции, а именно, прохождения восходящей ДНК, нематричной ДНК и возникающей мРНК внутри комплекса элонгации РНК-полимеразы II12,28, что также демонстрирует эффект факторы инициации транскрипции26 и динамическая архитектура открытого промоторного комплекса29.Более того, NPS использовали для выяснения структуры открытого комплекса РНК-полимеразы архей 30 и, в частности, положения фактора инициации транскрипции TFE, который конкурентно связывается с тем же сайтом, что и фактор элонгации транскрипции Spt4 / 531.

С тех пор было опубликовано несколько структурных подходов на основе smFRET15,18,21,23. При сравнении различных структурных методов на основе smFRET становится ясно, что кажущаяся точность метода сильно зависит от конкретного выбора моделей красителя.Следует отметить, что молекулы красителя могут демонстрировать различное пространственное и ориентационное поведение в зависимости от их локального окружения.

С этой целью был введен Fast-NPS32. Fast-NPS использует усовершенствованный алгоритм выборки, значительно сокращающий время вычислений. Кроме того, Fast-NPS позволяет выполнять структурный анализ, и для каждой молекулы красителя пользователь может выбрать из набора из пяти различных моделей красителя, которые будут описаны ниже. Самая консервативная модель, получившая название classic , предполагает, что краситель занимает только одну, но неизвестную позицию.В этом положении флуорофор может свободно вращаться внутри конуса, размер которого определяется его соответствующей (зависящей от времени) анизотропией флуоресценции. Ориентация конуса неизвестна, что приводит к большим погрешностям при преобразовании измеренной эффективности smFRET в расстояния. В этом отношении модель консервативна, так как она дает наименьшую точность по сравнению с другими моделями красителей. Только для очень коротких расстояний допущения, сделанные классической моделью, должны приводить к заметно неправильному определению местоположения.Для типичных значений smFRET правильная позиция всегда заключена в сравнительно большой достоверный объем.

Однако, поскольку желательна более высокая точность, важно разработать и испытать альтернативные модели красителей, которые могут помочь повысить точность. Если краситель вращается намного быстрее, чем время его собственной флуоресценции, можно применить так называемую модель iso . Здесь коэффициент ориентации κ 2 (необходимый для расчета характеристического изотропного радиуса Ферстера

) установлен равным 2/3.В результате рассчитанные достоверные объемы почти на два порядка меньше, чем в классической модели32. В случае, если флуорофор находится в среде, которая обеспечивает не только быструю переориентацию, но и дополнительное быстрое движение во всем доступном объеме, следует использовать модель meanpos-iso . В этой модели краситель эффективно занимает только одно среднее положение, где пространственное усреднение учитывается путем преобразования полиномиального расстояния15. Эта модель применима, например, если (обычно гидрофобный) краситель прикреплен к гидрофильной области, e.г., ДНК. Применение модели meanpos-iso приводит к дальнейшему уменьшению размера достоверных объемов примерно в два раза. Однако краситель, связанный с белком, может обратимо связываться с несколькими гидрофобными участками в своем стерически доступном объеме (AV). Флуорофор, который мгновенно переключается между этими областями, но внутри одной области подвергается свободному вращению и быстрому локализованному движению, лучше всего описывается моделью var-meanpos-iso . Для аналогичной ситуации, когда краситель не может свободно вращаться, применяется модель var-meanpos .Более подробную информацию об этих моделях можно найти в нашей недавней публикации32.

Эти модели имеют обширный репертуар, специально предназначенный для различных сред, с которыми может столкнуться краситель, и их разумное применение оптимизирует точность его локализации. В Fast-NPS каждая молекула красителя, прикрепленная к определенному положению, может быть отнесена к отдельной модели, так что FRET-партнерам разрешено иметь разные модели. Это обеспечивает безграничное моделирование, приближенное к природе. Однако важно проводить строгие статистические тесты, чтобы гарантировать, что результат, полученный с помощью окончательной комбинации моделей, по-прежнему согласуется с экспериментальными данными.Эти тесты включены в программное обеспечение Fast-NPS.

Чтобы применить Fast-NPS к экспериментальным данным, требуется измерение (только) трех входных параметров. Во-первых, необходимо определить изотропные радиусы Фёрстера для каждой пары красителей (

). Следовательно, необходимо измерять квантовый выход (QY) донорного красителя, спектры излучения донорной флуоресценции и спектры поглощения акцептора. Эти измерения можно проводить в большом количестве, используя стандартный спектрометр и стандартный флуоресцентный спектрометр.Для каждой пары затем вычисляется R 0 с помощью бесплатного программного обеспечения PhotochemCAD и может использоваться в анализе NPS. Более того, (разрешенная во времени) анизотропия флуоресценции молекул красителя должна быть получена с использованием поляризационного (и временного) флуоресцентного спектрометра. Однако наиболее важными входными параметрами для Fast-NPS являются эффективности smFRET, измеренные на установке для флуоресцентной микроскопии одиночных молекул, такой как флуоресцентный микроскоп полного внутреннего отражения (TIRFM).

Здесь мы представляем пошаговый протокол для получения данных smFRET и применения Fast-NPS (, рис. 1, ).

Протокол

1. Предварительные условия и лабораторное оборудование

ПРИМЕЧАНИЕ: Сборка измерительной камеры изображена на Рис. 3 . Сэндвич-конструкция измерительной камеры состоит из трех основных компонентов: предметного стекла из кварцевого стекла (плавленого кварца), герметизирующей пленки и покровного стекла, закрывающего проточную камеру. Измерительная камера устанавливается на специальный держатель образца.Размеры камеры для образцов и металлического держателя соответствуют стандартному предметному стеклу из кварцевого стекла для микроскопии (76 мм x 26 мм).

  1. Вырежьте предметные стекла из кварцевого стекла с помощью алмазного сверла (0,75 мм) в положениях, указанных на Рисунок 4 . Конструкция слайдов из кварцевого стекла асимметрична, чтобы различать две стороны каждого слайда. ПРИМЕЧАНИЕ. Кварцевые предметные стекла можно использовать повторно после измерения до появления царапин на поверхности.

  2. Для установки камер используйте индивидуальные металлические держатели образцов, как показано на Рисунок 5 .Держатели образцов содержат две резьбы (M4) для соединения впускной и выпускной трубок для проточной камеры. Кроме того, используйте резьбу (M3), чтобы установить камеру для образца на металлический держатель, а также резьбу (M3), чтобы закрепить держатель призмы на нижней половине металлического держателя.

  3. Выполните измерения smFRET на флуоресцентном микроскопе полного внутреннего отражения призменного типа (TIRFM) (, рис. 6, ). ПРИМЕЧАНИЕ: TIRFM включает три лазера: зеленый (532 нм, Nd: YAG-лазер) и красный лазер (643 нм, диодный лазер) для возбуждения донорных и акцепторных молекул красителя, а также синий лазер (491 нм. , твердотельный лазер с диодной накачкой) для обесцвечивания фоновых флуоресцентных примесей на камере для образца перед измерением smFRET.Три лазерных луча пространственно объединены и могут быть выбраны с помощью акустооптического перестраиваемого фильтра (AOTF). Флуоресцентный свет собирается объективом с высокой апертурой, разделяется на донорный и акцепторный каналы с помощью дихроичного зеркала и проецируется на две камеры EM-CCD. Камера для образца прикреплена к микрометрическому столику, позволяющему перемещаться в направлениях x и y с помощью двух шаговых двигателей. Третий пьезодвигатель используется вместе с ИК-лазером и позиционно-чувствительным детектором для создания системы автоматической фокусировки, обеспечивающей оптимальную фокусировку на протяжении всего эксперимента.

    1. Используйте переменное лазерное возбуждение (ALEX), когда наблюдается динамика временных траекторий FRET 25 . Такая динамика может быть вызвана либо конформационными изменениями внутри молекул, либо флуктуациями яркости акцептора и мерцанием акцептора. ПРИМЕЧАНИЕ: ALEX позволяет различать эти две возможные причины и предотвращает неправильную интерпретацию динамических траекторий FRET. Однако из соображений простоты протокольная часть ограничивается анализом фильмов, снятых без ALEX.Внимание: в установке флуоресценции одиночных молекул используются лазеры класса 3B. Перед запуском системы убедитесь, что приняты соответствующие меры безопасности при работе с лазером в соответствии с постановлениями местного правительства.

  4. Выполните измерение поглощения, используемое для определения квантового выхода на спектрометре UV-VIS (см. Материалы и методы).

  5. Выполните измерение спектра излучения донорной флуоресценции, спектра поглощения акцептора и анизотропии флуоресценции на флуоресцентном спектрометре (см. Материалы и методы).

  6. Подготовьте камеры для проб в соответствии с опубликованными процедурами 33. В качестве альтернативы можно использовать процедуру, описанную в [34].

  7. Пометьте исследуемые образцы парой молекул донорно-акцепторного красителя, подходящей для smFRET, и убедитесь, что на поверхности камеры для образцов имеется фрагмент биотина для иммобилизации. ПРИМЕЧАНИЕ. Чтобы локализовать неизвестное положение красителя антенны с помощью программного обеспечения Fast-NPS, необходимы различные образцы конструкций. Каждая конструкция должна иметь одну метку в неизвестном положении окраски антенны и одну метку в спутниковой позиции, известной из кристаллической структуры.Для получения точных результатов требуются по крайней мере три различных конструкции с красителями, прикрепленными к положению антенны, и три различных положения спутника. Измерения между антеннами, а также между спутниками также полезны для повышения точности, однако для этого требуется обмен молекулами красителя, который необходимо правильно ввести в анализ.

2. Установка проточных камер в специальный держатель

  1. Протяните силиконовую трубку (внутренний диаметр 0,8 мм, внешний диаметр 2,4 мм) в полые винты с выступом (M4) и обрежьте трубку с обоих концов ровно, оставив выступ 1 см с обеих сторон острым лезвием бритвы.Отрегулируйте выступ трубки примерно на 2 мм с одной стороны винта с выступом.

  2. Установите проточную камеру в держатель образца таким образом, чтобы отверстия в предметном стекле из кварцевого стекла совпадали с резьбой держателя образца. Осторожно затяните впускные и выпускные винты, чтобы убедиться, что впускное и выпускное отверстия камеры для пробы по-прежнему проницаемы. Осторожно затяните четыре винта держателя акрилового стекла, чтобы зафиксировать положение проточной камеры.

  3. Обрезанная силиконовая трубка (0.58 мм ВД, 0,96 мм ВД) на куски длиной 20 см. Вставьте одну из частей во входной и выходной винт измерительной камеры. Закройте впускной и выпускной трубопровод с помощью зажима. ПРИМЕЧАНИЕ. Собранные камеры для проб можно хранить при комнатной температуре до двух недель.

3. Измерение smFRET на микроскопе TIRF

  1. Используйте шприц, чтобы промыть камеру для образца 500 мкл PBS. Постоянно предотвращайте попадание пузырьков воздуха в камеру для пробы, создавая каплю на конце впускной трубки перед переходом на другой буферный раствор.

  2. Промойте камеру для образцов раствором 100 мкл нейтравидина (0,5 мг / мл в PBS) и инкубируйте 15 мин при комнатной температуре.

  3. Промойте раствор нейтравидина 500 мкл PBS.

  4. Навинтите металлический держатель призмы на камеру для образца.

  5. Установите камеру для образца на микрометрический столик TIRF-микроскопа. Убедитесь, что камера для образца установлена ​​горизонтально как можно прямо перед объективом, чтобы избежать расфокусировки во время сканирования.

  6. Запустите программное обеспечение для управления камерами EM-CCD и программное обеспечение для управления пьезодвигателями сцены.

  7. Отрегулируйте фокусировку объектива микроскопа, глядя на отражение ИК-лазера.

  8. Поместите призму (PS991, n = 1,52) поверх металлического держателя призмы. Отрегулируйте боковое положение призмы, чтобы лазерные лучи попадали на призму, затем используйте клей и инкубируйте с УФ-светом в течение 5 мин.ПРИМЕЧАНИЕ. Установленную призму можно повторно использовать после очистки.

  9. В программном обеспечении управления камерой нажмите «Настройка сбора данных» и определите следующие параметры сбора данных: время интеграции 100 мс, 401 кадр / видеоролик (зеленая камера), 400 кадров / видеоролик (красная камера), коэффициент усиления электронного умножителя 225, предварительный -усиление 5-кратное усиление и скорость считывания 3 МГц при 14 битах.

  10. Создайте папку на локальном жестком диске для измерения. Выберите желаемое имя для файлов измерений, e.г. , год-месяц-день. В настройках программы зайдите в райдер «Автосохранение», включите «Автосохранение» и выберите формат файла * .sif для получения фильма. Выберите папку на жестком диске. Используйте имя папки как файл.

  11. Включите функцию «Автоинкремент» (установите начальное значение на 1). Включите привязку оператора к имени файла. Используйте «ДОН» и «АСС» для донорного и акцепторного каналов соответственно. Выберите «_» в качестве разделителя.

  12. В программном обеспечении управления камерой нажмите «Видео», чтобы запустить прямое изображение с камеры и обесцветить фоновую флуоресценцию путем сканирования камеры для образца с использованием максимальной интенсивности всех трех лазеров (вместе ≈ 3000 Вт / см 2 для 10 с на поле зрения).

  13. Выключите синий лазер. Уменьшите интенсивность зеленого лазера примерно до 200 Вт / см 2 и примерно до 40 мВт / см 2 для красного лазера, если используется переменное лазерное возбуждение (ALEX).

  14. Разбавьте биотинилированный флуоресцентный образец до концентрации 50–100 пМ. Загрузите 100 мкл раствора. При связывании образец иммобилизируется на поверхности камеры. ПРИМЕЧАНИЕ. Следите за тем, чтобы не перегружать камеру. Соседние молекулы должны быть отделены друг от друга.

  15. При необходимости загрузите в камеру дополнительные 100 мкл пробы, в 2 раза более концентрированной.

  16. Закройте впускной и выпускной трубопроводы измерительной камеры зажимами после завершения загрузки.

  17. Выключите все лазеры и используйте пьезодвигатели для перемещения проточной камеры на два поля зрения дальше.

  18. В программном обеспечении управления камерой щелкните «Take signal», чтобы начать запись видео и одновременно включить лазер.Регулируя мощность лазера, убедитесь, что к концу пленки обесцвечивается более 80% молекул.

  19. Повторите шаги 3.17 и 3.18 для всей области предварительно обесцвеченной камеры для образца.

4. Получение карты трансформации («beadmap»)

  1. Подготовьте проточную камеру, как описано в разделах 1.1, 1.2 и 2.

  2. Используйте флуоресцентные мультиспектральные шарики, покрытые авидином, которые показывают испускание флуоресценции в донорный и акцепторный каналы.Вихревую смесь в течение 1 мин, затем разбавьте 50 мкл смеси в 50 мкл ddH 2 O. Снова встряхните на вортексе в течение 1 мин, обработайте ультразвуком 1-2 мин, затем встряхните еще 10 сек.

  3. Выполните шаги, описанные для измерений smFRET (Раздел 3.5–3.10).

  4. Загрузите 100 мкл (1 объем камеры) разбавленных 1: 2 флуоресцентных шариков в проточную камеру. Подождите 10 минут, чтобы флуоресцентные шарики связались с поверхностью.

  5. Используйте параметры сбора данных в 3.9, но измените длину видеоролика на 26 (зеленая камера) и 25 (красная камера), а коэффициент усиления электронного умножителя на 10.

  6. Установите интенсивность зеленого лазера на значение 20 Вт / см 2 .

  7. Возьмите один видеоролик в поле зрения примерно с 50–100 бусинами.

5. Обработка и анализ данных smFRET

  1. Используйте специально написанное программное обеспечение SM FRET для анализа диаграммы направленности (см. Материалы и методы) и полученных фильмов. Запустите программу viewPlot1.m.

  2. Щелкните «Анализ» | «Анализ партии», снимите флажок «ALEX», если он не использовался.Для лучшей производительности выберите «высокий» порог нахождения пика. Нажимаем «ОК».

  3. Выберите «НЕТ», когда вас спросят, анализировалась ли карта уже. Просмотрите папку, содержащую полученный beadmap, и выберите файл * .sif (дважды щелкнув по нему). В следующем диалоговом окне нажмите «ОК». ПРИМЕЧАНИЕ. Если диаграмма направленности уже была проанализирована в ходе предыдущего измерения, выберите здесь «ДА» и выберите сохраненную карту разбивки, перейдя в нужную папку и дважды щелкнув файл карты схемы * .map.Продолжите с шага 5.8.

  4. Выберите два одиночных шарика, расположенных в противоположных углах поля зрения. Интенсивность пикселей имеет цветовую кодировку от темно-синего (низкая интенсивность) до темно-красного (высокая интенсивность).

  5. Щелкните по центру первой бусинки. Если центр молекулы можно четко определить по цветовой кодировке, выберите «ДА» или нажмите «НЕТ» и выберите другую пару молекул.

  6. Поместите перекрестие на пиксель, показывающий максимальную интенсивность, и нажмите «СОХРАНИТЬ».Повторите процесс со вторым каналом.

  7. Щелкните по молекуле в противоположном углу и повторите шаги 5.5 и 5.6. ПРИМЕЧАНИЕ. Относительный сдвиг пикселей двух каналов отображается в командном окне, и карта преобразования автоматически сохраняется как файл * .map в папку, содержащую файл beadmap * .sif.

  8. Чтобы загрузить донорные и акцепторные фильмы (* .sif) для «пакетного анализа», перейдите в папку, выберите все фильмы, которые должны быть проанализированы, и нажмите «ОК».В следующем диалоговом окне нажмите «ОК». ПРИМЕЧАНИЕ. Пакетный анализ завершен, когда последняя дорожка, отображаемая в командном окне, начинается с «Завершенный анализ…». Обнаруженные молекулы отображаются в новом окне, в котором также указывается относительный сдвиг донорного и акцепторного каналов, определенный из карты трансформации.

  9. Чтобы загрузить пакетные файлы фильмов, щелкните Файл | Загрузить. Снимите отметку с опции «ALEX», если она не использовалась. Установите гладкость на 10 и нажмите «ОК».Выберите папку, содержащую файлы * .ttr, и нажмите «выбрать все» и «ОК» в следующем контекстном меню.

  10. Если отображаемая кривая имеет характерные фазы smFRET ( Рисунок 2 ), нажмите кнопку переключения «Не выбрано» и сначала выберите момент времени начала события FRET, перемещая линию с помощью курсора мыши и щелкнув левой кнопкой мыши. Затем выберите момент времени обесцвечивания молекулы-акцептора и, наконец, момент времени обесцвечивания молекулы-донора.

  11. В следующем окне эффективность FRET отображается синим цветом. Чтобы выбрать график, нажмите кнопку «Да», в противном случае выберите «Нет». Чтобы повторно получить доступ к временной шкале, нажмите кнопку «Назад».

  12. Повторяйте процедуру до последней молекулы фильма.

  13. После анализа последней молекулы в фильме сохраните выбранные следы, нажав «Файл | Сохранить». Сохраните выбранные трассы в той же папке, что и файлы * .sif.

  14. Повторите шаги 5.10-5,13 за все приобретенные фильмы.

  15. Выполнить программу comb_fret_results.m . Выберите папку, содержащую файлы * .res и все файлы * .FRETonly_trace. Сохраните молекулярные файлы FRET и FRET как MW.dat и FRW.dat соответственно. ПРИМЕЧАНИЕ. Файлы * .dat сохраняются как файлы ASCII. Файл FRW.dat содержит шесть столбцов и одну строку для каждого кадра FRET. Шестой столбец содержит скорректированную покадровую эффективность FRET. Файл MW.dat содержит 21 столбец и одну строку для каждой выбранной молекулы FRET.Третий столбец содержит молекулярную эффективность FRET.

6. Отображение данных smFRET в гистограммах

ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы извлечь среднюю эффективность smFRET всех записанных данных smFRET, покадровые данные или данные по молекулам наносятся на гистограммы и анализируются с использованием гауссовских аппроксимаций для ( множественные) пики. Далее в протоколе используется коммерческое программное обеспечение для анализа данных (см. Список материалов). Однако вместо этого можно использовать любое другое доступное программное обеспечение.

  1. Откройте программное обеспечение для анализа данных (см. Список материалов). Щелкните File | Import | multiple ASCII. Выберите папку, содержащую файл FRW.dat. Выберите файл и нажмите «ОК». Подтвердите вариант ввода нажатием «ОК» без изменений.

  2. Выберите третий столбец C (Y), содержащий скорректированные значения эффективности FRET, щелкните столбец правой кнопкой мыши и выберите «График | Статистика | Гистограмма». В окне гистограммы дважды щелкните столбцы и отмените выбор «автоматическое разбиение на интервалы» и выберите желаемый размер интервала, e.г. , 0,05. Также выберите начальное и конечное значения, , например, -0,025 и 1,025.

  3. Выберите столбцы гистограммы, щелкнув по ним левой кнопкой мыши. Затем щелкните правой кнопкой мыши и выберите «Перейти к рабочему листу корзины». Выберите столбец «Количество», щелкнув его левой кнопкой мыши, а затем щелкните правой кнопкой мыши и выберите «График | Столбец / столбец / круговая диаграмма | Столбец».

  4. На столбчатой ​​диаграмме перейдите в диалоговое окно Анализ | Подгонка | Подгонка нелинейной кривой | Открыть. Выберите «Гауссовский» в разделе «Функция», затем перейдите к райдеру «Параметр».Отмените выбор автоматической инициализации параметров. Зафиксируйте значение смещения (y0) на 0. Нажмите «Подогнать». ПРИМЕЧАНИЕ. Функция подгонки, а также детали подгонки теперь отображаются на столбчатой ​​диаграмме. Значение «xc» дает центр функции соответствия, , то есть — средний КПД FRET, который служит входным параметром для программного обеспечения NPS.

7. Измерение квантового выхода

  1. Выполните определение квантового выхода относительным методом, аналогичным процедуре, описанной Würth et al. 35, используя в качестве стандарта родамин 101, растворенный в этаноле (QY = 91,5%).

  2. Запишите спектры поглощения на спектрометре UV-VIS, используя объем 80 мкл в абсорбционной кювете с длиной пути 1 см. Поглощение на длине волны, которая будет использоваться для возбуждения флуоресценции, должно быть ≤ 0,05.

  3. Запишите спектры излучения на спектрометре с ламповой калибровкой, работающем в режиме счета фотонов. Проведите измерения с поляризаторами Глана-Томпсона в возбуждении (0 °) и эмиссии (54.7 °) (условия магического угла) с использованием спектральной ширины полосы около 5 нм и 2,5 нм для монохроматора возбуждения и излучения соответственно. Измерьте образцы после их переноса во флюоресцентную кювету с длиной пути 3 мм, следя за тем, чтобы скорость счета не превышала 10 6 с -1 .

    1. Рассчитайте квантовый выход согласно

, где n и n Std — показатели преломления растворителя образца и стандарта соответственно.f (λ) и f_Std (λ) — интенсивности флуоресценции образца и стандарта на длине волны λ. A (λ от ) и A std от ) — это оптическая плотность образца и эталона на длине волны возбуждения, а Φ std — квантовый выход стандарта.

8. Расчет изотропного радиуса Ферстера

  1. Рассчитайте изотропный радиус Ферстера (

    ) из ​​спектра излучения молекулы донора, спектра поглощения молекулы акцептора, квантового выхода донора и показателя преломления среды.Используйте бесплатную программу PhotochemCAD для расчета

    . Однако вместо него можно использовать любое другое доступное программное обеспечение36.

9. Измерение анизотропии

  1. Определите стационарную анизотропию флуоресценции по записям спектров флуоресценции с различными настройками поляризатора возбуждения / излучения (V / V, V / H, H / V, H / H) 36 .

  2. Рассчитайте G-фактор, который корректирует артефакты поляризации прибора, для каждой длины волны из отношения

и используйте его для вычисления значения анизотропии для каждой длины волны:

, где I xy указывает интенсивность для поляризации возбуждения x и поляризации излучения y .

  1. Усредните значения по спектральному диапазону излучения для расчета стационарной анизотропии флуоресценции.

10. Установка программного обеспечения Fast-NPS

  1. Загрузите UCSF Chimera с http://www.cgl.ucsf.edu/chimera и следуйте инструкциям по установке.

  2. Перейдите на сайт «Института биофизики» при Ульмском университете: https://www.uni-ulm.de/en/nawi/institute-of-biophysics/software.html. Загрузите текущую версию Fast-NPS и распакуйте ее в любую папку.Откройте подпапку «Распространяемый компонент» и установите распространяемый пакет Visual C ++, который подходит для системы.

11. Центрирование файла pdb

  1. Откройте интересующие файлы pdb в Chimera. Выберите все атомы макромолекулярного комплекса и вычислите координаты центроида (Инструменты | Анализ структуры | Оси / Плоскости / Центроиды | Определить центроид… | Хорошо).

  2. Откройте журнал ответов (Избранное | Журнал ответов) и инструмент преобразования (Инструменты | Движение | Трансформировать координаты).Введите координаты центроида, показанного в журнале ответов, в текстовое поле «Сдвиг» окна преобразования координат и измените знак каждой координаты. Нажмите «Применить» и сохраните файл с помощью «Сохранить PDB» (Файл | Сохранить PDB).

12. Настройка приоритетных позиций

ПРИМЕЧАНИЕ. Все значения указаны в ангстремах.

  1. Запустите язык технических вычислений и измените текущую папку на локальную папку Fast-NPS. Введите в командном окне: FastNPS.

  2. Создайте новый файл вакансии в Менеджере проектов (Проект | Новый).

  3. Установите предыдущую позицию (Инструменты | Модель красителя до).

  4. В панели «предыдущие основы» определите пространственное разрешение предыдущей позиции, введя ее значение (рекомендуется 2).

  5. Исключите внутреннюю часть макромолекулы, установив флажок и нажав кнопку «загрузить PDB». Выберите и загрузите центрированный файл PDB, как описано в Разделе 11.

  6. Укажите приблизительный диаметр (рекомендуется 13 Å, см. Обсуждение) красителя, указав его значение.

  7. Введите расстояние скелетонизации, , т. Е. расстояние, на которое молекула красителя может проникнуть в макромолекулу (рекомендуется 2 Å).

  8. В панели «Максимальный предыдущий размер» введите минимальные и максимальные координаты предыдущей позиции (рекомендуется: x в [-150,150], y в [-150,150] и z в [-150,150]).

  9. При определении сателлита активируйте флажок «присоединение через гибкий линкер» на панели «предыдущие основы» и введите в панель «линкер» координаты атома (в центрированном файле pdb), в котором находится молекула красителя. прилагается.Далее укажите длину и диаметр линкера, введя их значения (рекомендуются 13 Å и 4,5 Å, см. Обсуждение). В случае антенны пропустите этот пункт.

  10. Нажать кнопку «рассчитать доступный объем».

  11. Сохраните предыдущее положение и при желании экспортируйте его для целей визуализации с помощью такого программного обеспечения, как Chimera.

13. Определение сетевой геометрии

  1. Откройте окно определения измерений (Режим | Редактировать геометрию).

  2. Создайте новую молекулу красителя, нажав кнопку «Новый» в панели «Красители».

  3. Задайте анизотропию флуоресценции (Раздел 9), введя значение и выбрав модель красителя в раскрывающемся меню «Модель красителя».

  4. Нажмите кнопку «Загрузить», выберите соответствующую позицию и установите флажок активировать краситель. Повторите эту процедуру для всех красок, , то есть для всех антенн, а также для всех спутников.

  5. После создания всех красителей определите размеры.Создайте новое измерение, нажав «Создать» на панели «Измерения».

  6. Выберите партнеров FRET в раскрывающихся меню «Dye1» и «Dye2» ниже.

  7. Введите эффективность smFRET с ошибкой и изотропный радиус Ферстера этой пары красителей.

  8. Наконец, отметьте флажок активации измерения. Повторите эту процедуру для всех измерений. ПРИМЕЧАНИЕ. Часто сеть становится все более сложной, так что пользователь может запутаться.Во избежание ошибок проверьте сеть визуально, нажав кнопку «Проверить сеть». На рисунке показаны активированные красители и измерения с помощью линий, соединяющих красители FRET.

14. Расчет

  1. Откройте окно расчета (режим | Расчет).

  2. Если каждому красителю в сети назначена определенная модель, выберите «Определено пользователем» и запустите расчет, нажав «Расчет». Чтобы использовать все красители в одной модели, выберите одну из пяти моделей (классическая, iso, meanpos-iso, var-meanpos-iso и var-meanpos) и продолжайте.ПРИМЕЧАНИЕ. В командном окне будет отображаться ход расчета. Fast-NPS сделает это во всплывающем сообщении, когда расчет будет завершен.

15. Визуализация результатов

  1. Чтобы экспортировать достоверные объемы красителей, откройте окно просмотра результатов (Модель | Просмотр результатов).

  2. Экспортные плотности красителей:

    1. Экспортные красители по отдельности или все одновременно. Чтобы экспортировать отдельный краситель, выберите его на панели «Отображаемые красители» и нажмите «Экспорт плотности».Введите разрешение (рекомендуется 2) и выберите тип файла для экспорта. Справа показана плотность и некоторые ее математические характеристики.

    2. Чтобы экспортировать все красители одновременно, нажмите «Пакетный экспорт».

  3. Откройте полученные файлы плотности в Chimera.

16. Проверка согласованности выбранной комбинации моделей

  1. Откройте окно просмотра результатов (Модель | Просмотр результатов).Если на панели «Информация о расчетах» в текстовом поле «Согласованность» отображается значение ниже 90%, текущая модель не отражает в достаточной степени измеренную эффективность smFRET и, таким образом, является несовместимой.

  2. В случае несоответствия нажмите кнопку «Детальная согласованность». Найдите измерения со значением ниже 90%. Если в этих измерениях преимущественно задействованы один или несколько красителей, их модели могут вызвать несоответствие. Рассмотрите различные модели красителей для этих красителей и повторно запустите расчет Fast-NPS.

Типичные результаты

Транскрипция — это первый шаг в экспрессии генов у всех организмов. У архей транскрипция осуществляется одной РНК-полимеразой (РНКП). По сравнению с эукариотами, RNAP архей имеет поразительное структурное сходство со своими эукариотическими аналогами, но при этом имеет более простой механизм транскрипции. Таким образом, археи можно использовать в качестве модельной системы для изучения инициации транскрипции эукариот с помощью РНК-полимеразы II (Pol II). Недавно полная архитектура открытого комплекса РНК-полимеразы архей была определена из одномолекулярных FRET и NPS.Данные анализа NPS были использованы для построения модели полного открытого промоторного комплекса архей, которая дает полезные сведения о механизме инициации транскрипции.

Чтобы выяснить эту структуру, была измерена эффективность smFRET между неизвестными молекулами антенного красителя, расположенными внутри открытого промоторного комплекса, и несколькими известными молекулами красителя-сателлита, которые были включены в пять ссылочных сайтов в RNAP, положения которых известны из кристаллографических структур (pdb-ID). : 2WAQ) 37.Антенные красители были прикреплены к любому из различных положений нематричной ДНК, TFB, TBP или TFE. Полная сеть, использованная в этом исследовании, состояла из более чем 60 измеренных расстояний.

Рисунок 7 изображает модель полного комплекса открытого промотора архей, построенного на основе анализа NPS. Он состоит из двухцепочечной промоторной ДНК (голубой и голубой), РНК-полимеразы (серый) и факторов инициации транскрипции ТВР (фиолетовый), TFB (зеленый) и TFE (желтый).Модель накладывается на результаты анализа NPS, достоверные объемы, которые были рассчитаны с использованием классической модели (A), модели iso (B), модели meanpos-iso (C), модели var-meanpos-iso. (D) и модель var-meanpos (E).

Рисунок 1: Рабочий процесс сбора и обработки параметров, необходимых для расчета Fast-NPS. Щелкните здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Примерная временная диаграмма интенсивности флуоресценции для события smFRET. Интенсивности флуоресценции донора (зеленый) и молекулы акцептора (красный), показывающие три характерные фазы, а именно: I: smFRET, II: флуоресценция донора после фотообесцвечивания акцептора, III: фоновая флуоресценция после фотообесцвечивания донора. Щелкните здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Схематическое изображение проточной камеры для экспериментов smFRET. Проточная камера устанавливается на индивидуальный металлический держатель с держателями из акрилового стекла.Сэндвич-конструкция проточной камеры состоит из предметного стекла из кварцевого стекла (плавленого кварца) с двумя отверстиями для крепления впускной и выпускной трубок, герметизирующей пленки и покровного стекла, закрывающего проточную камеру. Призма для освещения TIRF устанавливается на нижнюю половину проточной камеры. Полые винты с язычками обеспечивают вход и выход для проточной камеры. Щелкните здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Подготовка предметного стекла из кварцевого стекла и герметизирующей пленки. Механический чертеж предметного стекла из кварцевого стекла с указанием положения отверстий (в миллиметрах). Щелкните здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5: Механический чертеж проточной камеры. Размеры алюминиевого держателя призмы, держателя акрилового стекла и алюминиевой монтажной рамы указаны в миллиметрах. Щелкните здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 6: Схематическое изображение призменной установки TIRF, используемой для экспериментов smFRET. Сокращения для обозначения оптических компонентов: A — диафрагма; DM — дихроичное зеркало; F, эмиссионный фильтр; L, линза; М, зеркало; О, объективный; П — призма; PSD, позиционно-чувствительный фотодиод; S, образец; PS, этап позиционирования; Т, телескоп. Щелкните здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 7: Результаты моделирования различных допущений модели. Все изображения показывают полимеразу РНК архей (pdb-ID: 2WAQ, вид сверху) вместе с моделью для промоторной ДНК (тДНК и нтДНК синим и голубым соответственно), TBP (фиолетовый), TFB (зеленый) и TFE (желтый). ) в археологическом открытом комплексе 30.Надежные объемы накладываются на результаты моделирования NPS ( A ) классической модели, ( B ) iso-модели, ( C ) meanpos-iso модели, ( D ) var-meanpos- iso и ( E ) модель var-meanpos. Все объемы показаны с достоверностью 68%. Классическая сеть и сеть var-meanpos согласуются с данными smFRET. Напротив, сети, в которых для всех красителей выбрана модель iso, meanpos-iso или var-meanpos-iso, не соответствуют измеренным данным.Щелкните здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Обсуждение

Мы представляем установку и экспериментальную процедуру для точного определения эффективности FRET между красителями, прикрепленными через гибкие линкеры к биомакромолекулам, то есть , нуклеиновым кислотам и / или белкам.

Для обеспечения точных измерений smFRET (Раздел 3) очень важно исключить воздух из проточной камеры в любой момент во время измерения. Кроме того, следите за тем, чтобы не перегружать проточную камеру флуорофорами.Флуорофоры должны быть четко разделены для обеспечения правильного анализа. Поскольку пары smFRET, которые не показывают обесцвечивание донора, должны быть исключены из анализа, убедитесь, что> 80% молекул в поле зрения обесцвечиваются в конце фильма. Чтобы учесть неоднородности в образце, β-фактор и γ-фактор, корректирующие перекрестные помехи и относительную эффективность обнаружения донорного и акцепторного каналов, соответственно, рассчитываются для каждой пары FRET отдельно.

Настройки камеры (время интегрирования, коэффициент усиления электронного умножителя, коэффициент усиления предварительного усилителя и скорость считывания, описанные в разделе 3.9) должны быть установлены на значения, обеспечивающие наилучший компромисс между отношением сигнал / шум, динамическим диапазоном и временным разрешением. Их необходимо перенастроить для разных экспериментов или при использовании другого оборудования. Количество кадров должно быть достаточно большим, чтобы обеспечить обесцвечивание большинства донорных молекул в течение времени наблюдения.

Для измерений на флуоресцентном спектрометре (разделы с 7 по 9) должен быть найден хороший компромисс между интенсивностью сигнала и спектральным разрешением записанных данных.С этой целью щели на пути возбуждения и излучения флуоресцентного спектрометра должны быть адаптированы в зависимости от используемого инструмента и концентрации образца.

Кроме того, мы представляем метод анализа Fast-NPS для получения структурной информации о переходных или динамических макромолекулярных комплексах. NPS был применен для выявления пути нематричной цепи ДНК и положения факторов инициации транскрипции в открытом комплексе РНК-полимеразы архей. Используя сеть из более чем 60 различных измерений расстояний, мы показали, что Fast-NPS, оснащенный недавно реализованным механизмом отбора проб (Eilert, T., Beckers, M., Drechsler, F., & Michaelis, J. в стадии подготовки), сокращает время, необходимое для анализа этой сложной сети smFRET, примерно на 2 порядка по сравнению с исходным глобальным методом NPS27. Надежность алгоритма основана на сэмплере «Метрополис внутри Гиббса» в сочетании с параллельной схемой темперирования. Fast-NPS показывает точную воспроизводимость сетевых результатов и согласуется с результатами, опубликованными ранее30.

Было опубликовано несколько различных методов, нацеленных на вывод структурной информации из измерений smFRET11,12,13,14,15,16,17,18.Все эти подходы обеспечивают только одну конкретную модель красителя. Таким образом, красители, которые не соответствуют предположениям, сделанным соответствующей моделью, не могут быть использованы или приводят к ложной структурной информации. Fast-NPS, напротив, позволяет подбирать для каждой молекулы красителя отдельную модель. Это помогает учесть различное конформационное поведение как самой молекулы красителя, так и линкера, используемого для ее прикрепления. Локальное молекулярное окружение молекулы красителя, а также ее физические свойства будут определять, какая модель является наиболее подходящей.

Для анализируемой сети smFRET комплекса инициации архей изотропное предположение для всех молекул красителя приводит к резкому уменьшению размера вероятных объемов по сравнению с классической моделью. В сочетании с динамическим усреднением положения для всех молекул красителя медиана всех вероятных размеров объема (при 95%) уменьшается до менее 0,5 нм 3 . Однако эти задние молекулы красителя больше не согласуются с их измерениями smFRET, указывая на то, что сделанные предположения приводят к ложной структурной информации.Напротив, апостериорные уровни, определенные в классической модели, согласуются с определенными значениями эффективности smFRET.

Поскольку предположение об изотропном и / или динамическом усреднении положения для всех красителей приводит к несоответствиям, Fast-NPS позволяет использовать априорные молекулы красителя, в которых каждому красителю может быть назначена одна из пяти моделей. В каждой модели используется один и тот же доступный объем. Алгоритм расчета АВ красителя делает несколько предположений. Сначала пространственная форма флуорофора аппроксимируется сферой.Таким образом, следует использовать диаметр, учитывающий ширину, высоту и толщину флуорофора (раздел 12). Далее форма линкера аппроксимируется гибким стержнем. Значения, представленные в разделе 12, были вычислены для красителя Alexa 647, присоединенного через линкер 12-C. На сегодняшний день невозможно точно определить априори, какая модель наиболее подходит, учитывая геометрию эксперимента, и поэтому все модели должны быть проверены. Как правило, выбирают модель, которая дает наименьший возможный апостериорный размер, но при этом согласуется с данными.Чтобы проверить, соответствует ли выбор модели данным smFRET, мы вычисляем как апостериорную, так и вероятность. Согласованность означает, что более 90% образцов, собранных в апостериорной области, находятся в пределах 95% доверительного интервала правдоподобия.

Хотя верно, что чем ниже анизотропия, тем меньше неопределенность расстояния, в сети smFRET также необходимо учитывать геометрическое расположение молекул красителя. Таким образом, хотя представление молекул красителя с низкой анизотропией флуоресценции с помощью изомодели является типичным первым выбором, тест на консистенцию предоставляет более прямые средства для выбора правильной модели красителя.Оптимальный выбор моделей красителей может привести к резкому увеличению точности локализации и в то же время сохранить согласованность сети с ее данными FRET.

Таким образом, Fast-NPS позволяет получать структурную и динамическую информацию о крупных макромолекулярных комплексах. В отличие от обычных структурных методов, таких как рентгеновская кристаллография или криоэлектронная микроскопия, это позволяет отслеживать очень гибкие или переходные комплексы, что значительно расширяет наше понимание механизмов сложных биологических процессов.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы благодарят Б. Грюхманна за механические чертежи проточной камеры. Кроме того, мы хотим выразить нашу благодарность Максу Бекерсу и Флориану Дрекслеру за содержательные комментарии и обсуждения, касающиеся NPS и лежащего в основе механизма выборки.

Ссылки

  • Cheng Y. Крио-ЭМ одиночных частиц с кристаллографическим разрешением. Клетка. 2015; 161: 450–457.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Гарман Э. Ф. Развитие методов рентгеноструктурного определения биологических макромолекул. Наука. 2014. 343 (6175): 1102–1108. [PubMed] [Google Scholar]
  • Сали А. Итоги первого семинара рабочей группы по гибридным / интеграционным методам wwPDB. Структура. 2015; 23: 1156–1167. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Хопфнер К.П., Михаэлис Дж. Механизмы транслоказ нуклеиновых кислот: уроки структурной биологии и биофизики одиночных молекул.Curr Opin Struct Biol. 2007; 17: 87–95. [PubMed] [Google Scholar]
  • Андо Т., Учихаши Т., Кодера Н. Высокоскоростной АСМ и приложения к биомолекулярным системам. Анну Рев Биофиз. 2013; 42: 393–414. [PubMed] [Google Scholar]
  • Нойман К.К.С., Надь А. Силовая спектроскопия одиночных молекул: оптический пинцет, магнитный пинцет и атомно-силовая микроскопия. Нат методы. 2008; 5: 491–505. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Йилдиз А. Миозин V ходит из рук в руки: визуализация одного флуорофора с помощью 1.5-нм локализация. Наука. 2003. 300 (5628): 2061–2065. [PubMed] [Google Scholar]
  • Джу К., Бальчи Х, Ишицука Й., Бураначай С., Ха Т. Достижения в методах флуоресценции одиночных молекул для молекулярной биологии. Анну Рев Биохим. 2008. 77 (1): 51–76. [PubMed] [Google Scholar]
  • Hohlbein J, Craggs TD, Cordes T. Возбуждение переменного лазера: FRET одной молекулы и не только. Chem Soc Rev.2014; 43 (4): 1156–1171. [PubMed] [Google Scholar]
  • Страйер Л., Хаугланд Р.П. Передача энергии: спектроскопическая линейка.Proc Natl Acad Sci U S. A. 1967; 58 (2): 719–726. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Rasnik I, Myong S, Cheng W, Lohman TM, Ha T. Ориентация связывания ДНК и конформация домена мономера Helicase Rep E. coli, связанного с частичным дуплексным соединением : Исследования одиночных молекул флуоресцентно меченых ферментов. J Mol Biol. 2004. 336 (2): 395–408. [PubMed] [Google Scholar]
  • Андрека Дж. Одномолекулярное отслеживание мРНК, выходящей из РНК-полимеразы II. Proc Natl Acad Sci U S A.2008. 105 (1): 135–140. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Шредер Г.Ф., Грубмюллер Х. FRETsg: Построение модели биомолекулярной структуры на основе нескольких экспериментов FRET. Comput Phys Commun. 2004. 158 (3): 150–157. [Google Scholar]
  • Маргиттай М. Одномолекулярный резонансный перенос энергии флуоресценции обнаруживает динамическое равновесие между закрытой и открытой конформациями синтаксина 1. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2003; 100 (26): 15516–15521. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Калинин С.Набор инструментов и эталонное исследование для высокоточного структурного моделирования с ограничениями FRET. Нат методы. 2012. 9 (12): 1218–1227. [PubMed] [Google Scholar]
  • Choi J. N6-метиладенозин в мРНК нарушает отбор тРНК и динамику удлинения трансляции. Nat Struct Mol Biol. 2015; 23 (август 2015): 110–115. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Свенссон Б. Трилатерация зондов, связанных с функциональными рианодиновыми рецепторами, на основе FRET. Biophys J. 2014; 107 (9): 2037–2048. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Стивенсон Дж. Д., Кеньон Дж. К., Симмонс М. Ф., Lever AML.Характеристика трехмерной структуры РНК с помощью одиночной молекулы FRET. Методы. 2016. С. 1–11.
  • Ли Н.К. Точные измерения FRET в одиночных диффундирующих биомолекулах с использованием переменного лазерного возбуждения. Биофиз Дж. 2005; 88 (4): 2939–2953. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • McCann JJ, Choi UB, Zheng L, Weninger K, Bowen ME. Оптимизация методов восстановления абсолютной эффективности FRET от иммобилизованных одиночных молекул. Биофиз Дж. 2010; 99 (3): 961–970. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Brunger AT, Strop P, Vrljic M, Chu S, Weninger KR.Трехмерное молекулярное моделирование с помощью FRET одной молекулы. J. Struct Biol. 2011; 173: 497–505. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Шулер Б. Одномолекулярный FRET структуры и динамики белка — праймер. J нанобоитехнология. 2013; 11 (Приложение 1): 1–17. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Choi UB. Одномолекулярная модель слитого комплекса синаптотагмин 1-SNARE, полученная из FRET. Nat Struct Mol Biol. 2010. 17 (3): 318–324. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Dale RE, Eisinger J, Blumberg WE.Ориентационная свобода молекулярных зондов. Фактор ориентации при внутримолекулярном переносе энергии. Биофиз Дж. 1979; 26 (2): 161–193. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Kapanidis AN. Переменное лазерное возбуждение одиночных молекул. Acc Chem Res. 2005. 38 (7): 523–533. [PubMed] [Google Scholar]
  • Muschielok A. Система нанопозиционирования для анализа структуры макромолекул. Нат методы. 2008. 5 (11): 965–971. [PubMed] [Google Scholar]
  • Muschielok A, Michaelis J.Применение системы нано-позиционирования для анализа сетей резонансного переноса энергии флуоресценции. J. Phys Chem B. 2011; 115 (41): 11927–11937. [PubMed] [Google Scholar]
  • Andrecka J. Система нано-позиционирования выявляет направление восходящей и неэлементной ДНК внутри комплекса элонгации РНК-полимеразы II. Nucleic Acids Res. 2009. 37 (17): 5803–5809. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Трейтлейн Б. Динамическая архитектура комплекса открытого промотора с минимальной РНК-полимеразой II.Mol Cell. 2012. 46 (2): 136–146. [PubMed] [Google Scholar]
  • Надь Дж. Полная архитектура открытого комплекса РНК-полимеразы архей из одной молекулы. FRET и NPS. Nat Commun. 2015; 6: 6161. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Grohmann D, et al. Фактор инициации TFE и фактор элонгации Spt4 / 5 конкурируют за зажим RNAP во время инициации и удлинения транскрипции. Mol Cell. 2011. 43 (2): 263–274. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Beckers M, Drechsler F, Eilert T, Nagy J, Michaelis J.Количественная структурная информация из FRET одной молекулы. Фарадей Обсуди. 2015; 184: 117–129. [PubMed] [Google Scholar]
  • Беннинк М.Л. Разворачивание отдельных нуклеосом путем растягивания отдельных волокон хроматина с помощью оптического пинцета. Nat Struct Biol. 2001. 8 (7): 606–610. [PubMed] [Google Scholar]
  • Chandradoss SD. Пассивация поверхности для исследования одномолекулярных белков. J Vis Exp. 2014. с. e50549. [Бесплатная статья PMC] [PubMed]
  • Würth C, Grabolle M, Pauli J, Spieles M, Resch-Genger U.Относительное и абсолютное определение квантовых выходов флуоресценции прозрачных образцов. Nat Protoc. 2013. 8 (8): 1535–1550. [PubMed] [Google Scholar]
  • Lakowicz JR. Принципы флуоресцентной спектроскопии. Бостон, Массачусетс: Springer США; 2006. [Google Scholar]
  • Корхин Ю. Эволюция сложных РНК-полимераз: Полная структура РНК-полимеразы архей. PLoS Biol. 2009; 7 (5) [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

Анализ флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET)

Анализ флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET)

Мембранные белки составляют 1 / 4–1 / 3 от общего числа 30000 белков, кодируемых геномом человека.Мембранные белки играют важную роль в различных сложных и уникальных клеточных процессах, включая транспортировку материалов, распознавание клеток, иммунный ответ, передачу и регуляцию сигналов, а также передачу энергии, et.al . Почти 70% известных или исследуемых мишеней для лекарств — это мембранные белки. По-прежнему остается проблемой определение структур и функциональные анализы мембранных белков.

Creative Biostructure создал превосходную сервисную платформу для преобразования генов мембранных белков в структуру, созданную группой опытных профессионалов.Наши услуги по предоставлению полного набора мембранных белков, включая экспрессию и очистку, кристаллизацию и определение, а также различные функциональные анализы как in vivo, и in vitro, , ускоряют ваши научные исследования. Creative Biostructure может разрабатывать и предоставлять индивидуальный анализ флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET) Mempro ™ или анализ FRET для функционального исследования взаимодействий мембранных белков.

Белковые взаимодействия имеют решающее значение для сигнальных сетей мембранных белков.Однако резонансный перенос энергии флуоресценции может иметь место только в том случае, если расстояние донор-акцептор не превышает 10 нм, что делает его очень мощным инструментом для обнаружения и определения взаимодействий с мембранными белками.

Анализ флуоресцентного резонансного переноса энергии ( FRET ), один из наиболее передовых и желаемых методов с широким диапазоном применения, выполняет анализы для прямого определения состояния олигомеризации и степени олигомеризации мембранных белков в их естественной среде.FRET — это зависящее от расстояния взаимодействие между флуоресцентными донорно-акцепторными парами в непосредственной близости, при котором энергия флуоресценции передается от возбужденного донора к подходящей молекуле акцептора без излучения. Эффективность FRET сильно зависит от расстояния донор-акцептор и от спектров перекрытия донорного излучения и возбуждения акцептора.

Рисунок 1. Схематический график фотофизического процесса FRET (Molecules, 2012)

FRET может иметь место только в том случае, если расстояние донор-акцептор не превышает 10 нм, что делает его очень мощным инструментом для обнаружения и определения взаимодействий с мембранными белками.Creative Biostructure может предоставить платформу Mempro ™ FRET для выполнения специального структурного и функционального анализа мембранных белков.

• Mempro ™ FRET с индивидуальной парой донор-акцептор

Принимая во внимание большое влияние расстояния Форстера на FRET, Creative Biostructure может помочь вам выбрать оптимальную флуоресцентную пару донор-акцептор в соответствии с вашими особенностями требование исследования мембранного белка.

Таблица 1.Популярные донорно-акцепторные пары FRET и их фотофизические свойства.

Оптимальные условия для FRET:
1. Донорно-акцепторная пара должна находиться на близком расстоянии (обычно 1–10 нм).
2. Перекрытие спектра поглощения акцептора и спектра излучения донора.
3. Ориентация донора и акцептора должна быть примерно параллельна.

• Mempro ™ FRET для индивидуальных целей

FRET может предоставить не только качественные измерения, но и количественные данные в исследованиях функции мембраны. Creative Biostructure разработала полный набор методов FRET , таких как 1) Upconversion FRET , 2) Photochromic FRET , 3) Single-Molecule-FRET и 4) FRET Frustration et. al . Creative Biostructure — ваш компетентный и профессиональный партнер в области научных исследований для выполнения всех видов FRET-приложений мембранных белков, включая :
1. Структура и конформация мембранных белков,
2.Пространственное распределение мембранных белков,
3. Олигомеризация мембранных белковых комплексов,
4. Мембранный белок участвует во взаимодействиях рецептор / лиганд,
5. Взаимодействие между мембранными липидами и мембранными белками.

Рисунок 2. Внутримолекулярный и межмолекулярный FRET (Current Opinion in Structural Biology, 2001)

Рисунок 3. Применение сигломолекулярного FRET (J. Am. Chem. Soc., 2013)

Рисунок 4. Измерение взаимодействия между мембранами белков, липидов и лигандов по FRET (PNAS, 2013)

• Mempro ™ FRET с индивидуальными подходами к визуализации

Компания Creative Biostructure разработала ряд методов для определения FRET.Обычно мы предлагаем три индивидуальных подхода, которые оказались особенно полезными, исходя из практических соображений:
1. Фотообесцвечивание донора и акцептора
FRET может быть построено путем доступа к скорости обесцвечивания донора с присутствием акцептора и без него. Основными двумя преимуществами этого подхода являются: относительно простота и легкость выполнения. Требуются соответствующие комплекты фильтров и мощный источник света, позволяющий отбеливать акцептор.
2. Сенсибилизированная эмиссия
Сенсибилизированная эмиссия — это самый простой метод обнаружения FRET, и наиболее идеальным условием для этого метода является полное разделение каналов донора и акцептора и отсутствие перекрестных помех между ними.
3. Флуоресцентная микроскопия для получения изображений в течение всей жизни
Флуоресцентная микроскопия для получения изображений в течение жизни, также называемая FLIM, может использоваться для картирования пространственного распределения времен жизни флуорохромов как в микроскопических изображениях, так и в живых клетках. Creative Biostructure может определять точное пространственное расположение или распределение мембранных белков с высоким разрешением и специфичностью в живых клетках.

Creative Biostructure также предоставляет ряд услуг по функциональному анализу Mempro ™. Пожалуйста, свяжитесь с нами для получения подробного предложения.

Ссылки:
H. C. Ishikawa-Ankerhold, et al. . (2012). Передовые методы флуоресцентной микроскопии — FRAP, FLIP, FLAP, FRET и FLIM. Молекулы , 1 7 (3): 4047-4132.
К. Чыонг и М. Икура. (2001). Использование микроскопии изображений FRET для обнаружения белок-белковых взаимодействий и изменений конформации белков in vivo. Текущее мнение в структурной биологии , 11 : 573-578.
W. Bae, и др. . (2013). Наблюдение в реальном времени за образованием множественных белков с помощью одномолекулярного FRET. J. Am. Chem. Soc ., 135 (28): 10254-10257.
C. Matsushita, и др. . (2013). Ориентация трансмембранной спирали влияет на связывание с мембраной внутриклеточного юкстамембранного домена в пептидах рецептора Neu. Proc. Natl. Акад. Sci. США, 110 (5): 1646–1651.