Коммутатор ваз: основа бесконтактного зажигания волжских автомобилей

Содержание

Коммутаторы на ВАЗ от «Астро»

Коммутатор ВАЗ – важная часть системы зажигания автомобиля, от качества которой зависит успешность работы двигателя внутреннего сгорания. Качественный коммутатор зажигания ВАЗ обеспечит бесперебойную работу бесконтактной системы зажигания. Кроме того, продвинутые версии коммутаторов могут устанавливать начальный момент зажигания и диагностировать работу датчика Холла.

С 1994 года коммутатор электронного зажигания на ВАЗ от Астро завоевал себе прочную репутацию среди владельцев отечественных автомобилей. Многие автолюбителя полагают, что лучший коммутатор на ВАЗ – именно наш. Дело в том, что мы не экономим на «начинке» устройства, и отдаем предпочтение качественным отечественным расходникам, что повышает срок службы электронного коммутатора ВАЗ.

Коммутатор на ВАЗ. Бесконтактное зажигание

Коммутатор системы зажигания ВАЗ работает на бесконтактном принципе. Коленвал, вращаясь, подает сигнал на датчик Холла, и оттуда он передается в коммутатор. Принимая сигнал от датчика, коммутатор отправляет импульс на катушку зажигания.

Благодаря использованию датчика Холла система зажигания стала менее уязвимой, что повысило работоспособность всех устройств в ней. Коммутатор – важное связующее звено между прочими элементами системы зажигания, это своеобразный «мозг», который получает и передает сигналы, обеспечивая тем бесперебойную работу всей системы.

Наш завод производит универсальные модели коммутаторов, двухконтактные, шестиконтактные и семиконтактные. Они подходят для всех моделей легковых карбюраторных автомобилей, оснащенных бесконтактной системой зажигания. Сюда входят и все модели ВАЗ. В том числе ВАЗ 2101, ВАЗ 2104, ВАЗ 2105, ВАЗ 2106, ВАЗ 2107, ВАЗ 2110, ВАЗ 2114, ВАЗ 21083, ВАЗ 21099, ВАЗ 2121, ВАЗ 21213.

Двухканальный коммутатор ВАЗ

Коммутатор на ВАЗ 2108 и ВАЗ 2109 требует особой модели. Микропроцессорная система зажигания предполагает, что коммутатор для такой системы должен быть двухканальным. Специально под такие условия нами был разработан коммутатор 951.3734.

Эта модель подходит не только для ВАЗ 2108-2109, но и для и всех их модификаций.

Коммутатор ВАЗ. Цена

Стоимость коммутаторов ВАЗ от нашего завода невысока, но это не влияет на качество. Мы используем проверенные временем материалы и расходники, экономя за счёт выгодных контрактов с давними поставщиками.

Цена коммутатора получается выше, если брать его в комплекте с датчиком детонации и жгутом для подключения. Например, именно в таком комплекте продается модель 962.3734.

Купить коммутатор ВАЗ

На нашем сайте вы можете купить коммутатор зажигания ВАЗ оптовым тиражом, что обеспечит выгодные цены от производителя. Если вам требуется единичный коммутатор, обратитесь к нашим представителям в вашем городе. Мы предлагаем модели автоэлектроники и на другие типы автомобилей, например, коммутатор на Оку.

Способы оплаты: через расчетный счет, на карту банка, через платежные системы.

Способы доставки: самовывоз, Почта России, ПЭК, Деловые линии, Автотрейдинг, ЖелДорЭкспедиция, Байкал-сервис.

Способы связи: [email protected], +7 (8412) 48-00-02

Коммутатор ВАЗ 2108 2109 VAZ (восьмёрка, девятка)

1. Отсоедините от клеммы “К” катушки зажигания коричневый провод с красной полосой (провод идет к контакту “1” коммутатора).

2. Подключите этот провод к контрольной лампе, рассчитанной на 12 В, мощностью 3 Вт. Другой контакт лампы подключите к клемме “К” катушки зажигания. Проверните двигатель стартером, при этом лампа должна замигать. Если лампа не загорается, замените коммутатор.

Примечание

Данный метод проверки позволяет проверить, подает ли коммутатор управляющие импульсы на катушку зажигания. Более точную проверку (величину длительности и форму импульсов) коммутатора надо производить на специальном стенде.

3. Для замены коммутатора (смотрите примечание ниже) отсоедините колодку с проводами от коммутатора зажигания, отжав отверткой пружинную скобу на колодке.

Примечание

Перед снятием коммутатора отсоедините провод от клеммы “–” аккумуляторной батареи.

4. Отверните две гайки крепления радиатора и снимите коммутатор с радиатором.

5. Установите новый коммутатор с радиатором в порядке, обратном снятию. Обратите внимание: под левой гайкой должен быть закреплен провод “массы”.

Коммутатор электронный 7 конт. ВАЗ 2108, 2109, 21099 с эл. тахометром ВТН (0729.3734)

Коммутатор электронный 0729.3734 — 7 контактный

На контакте №7 предусмотрено наличие выходного низковольтного управляющего сигнала для систем электрооборудования с электронным тахометром или другими контрольными приборами.

(также в наличии есть 6-контактный для классики 2101-2107, 2121)

Коммутатор электронный 0729.3734 предназначен для работы в бесконтактных системах зажигания автомобилей ВАЗ-2108, ВАЗ-2109, “Таврия» и других, в том числе иностранного производства, оснащенных аналогичными системами зажигания с датчиком на эффекте Холла.

Коммутатор работает комплектно с катушкой зажигания типа 27.3705 и распределителем 40.3706, 53.3706 или другими с аналогичными параметрами.

Данное изделие разработано как коммутатор повышенной экономичности. Рекомендован для установки на автомобили зарубежного производства.

Благодаря быстродействию коммутационного транзистора энергия искры выше, чем в традиционных коммутаторах, что позволяет получить высокие технико-экономические показатели двигателя и облегчить его запуск даже при низком качестве топлива.

Работа с отключенной аккумуляторной батареей или при ее неисправности не допускается.

Имеет повышенный рабочий температурный диапазон. Надежность и соответствие техническим условиям гарантируется при температуре радиатора коммутатора до 115 °С.

Согласно требованиям к системам зажигания, коммутатор обеспечивает защиту датчика Холла* от перенапряжения путем стабилизации подаваемого на датчик напряжения. Изделие обладает защитой от короткого замыкания в цепи питания датчика Холла.

Для обработки сигнала и управления выходным ключом применен современный микроконтроллер.

Коммутатор сконструирован для работы по однопроводной схеме, в которой с корпусом автомобиля соединен отрицательный вывод источника питания. Рабочий режим коммутатора — S1 по ГОСТ 3940. Данное изделие является функциональным аналогом коммутатора BOSCH 0227100139.

Коммутатор устанавливается на предусмотренное для него место в автомобиле при помощи штатных крепежных деталей и штатного разъема, при этом необходимо обеспечить надежный контакт между основанием коммутатора и корпусом автомобиля.

Технические данные:

	Диапазон рабочих температур, °С		-40 .. +100
	Номинальное напряжение питания, В		12,0
	Допустимые пределы напряжения питания, В		6,0 .. 18,0
	Диапазон бесперебойного искрообразования, об/мин коленчатого вала 4-тактного 4-цилиндрового двигателя		20 .. 7000
	Ток коммутации, А		7,0 ± 0,2
	Время безыскровой отсечки коллекторного тока, с		1 .. 2
	Максимально допустимое воздействие повышенного напряжения питания длительностью до 5 мин. при частоте искрообразования более 200 Гц (6000 об/мин коленчатого вала 4-тактного 4-цилиндрового двигателя), В		25,0
	Максимально допустимые импульсные перенапряжения положительной и отрицательной полярности, В		160,0

Схема включения в составе системы зажигания:

Габаритный чертеж:

Коммутатор электронный Ваз 2108 0529.3734 ВТН

Коммутатор электронный для Ваз 2108, 0529.3734 ВТН.

Коммутатор электронный 0529.3734 применяется на карбюраторных автомобилях с бесконтактной системой зажигания.

Применяется на автомобилях ВАЗ-2108, ВАЗ-2109, «Таврия» и других, в том числе иностранного производства, оснащенных аналогичными системами зажигания с датчиком Холла.

Коммутатор работает в комплекте с катушкой зажигания типа 27.3705 и распределителем 40.3706, 53.3706 или другими с аналогичными параметрами.

Данный коммутатор разработан специально для возможности установки на автомобили с электрическими цепями низкого качества и обладает повышенной помехоустойчивостью.

Имеет повышенный рабочий температурный диапазон. Надежность и соответствие техническим условиям гарантируется при температуре радиатора коммутатора до 115 °С. Данное изделие имеет осциллограммы токов и напряжений несколько отличные от традиционных, в процессе эксплуатации имеет нагрев радиатора на низкой частоте оборотов коленчатого вала двигателя, что предусмотрено. Начиная с 2007 г. коммутатор 0529.3734 обладает защитой от короткого замыкания в цепи питания датчика Холла.

Согласно требованиям к системам зажигания, коммутатор обеспечивает защиту датчика Холла* от перенапряжения путем стабилизации подаваемого на датчик напряжения.

Допускается работа коммутатора без аккумуляторной батареи.

Технические данные:

Диапазон рабочих температур, °С	-40 .. +100
Номинальное напряжение питания, В	12,0
Допустимые пределы напряжения питания, В (до 5 мин.)	6,0 .. 18,0
Диапазон бесперебойного искрообразования, об/мин коленчатого вала 4-тактного 4-цилиндрового двигателя	20 .. 7000
Ток коммутации, А	7,5 ± 0,2
Время безыскровой отсечки коллекторного тока, с	1 .. 2
Максимально допустимое воздействие повышенного напряжения питания длительностью до 5 мин. при частоте искрообразования более 200 Гц (6000 об/мин коленчатого вала 4-тактного 4-цилиндрового двигателя), В	25,0
Максимально допустимые импульсные перенапряжения положительной и отрицательной полярности, В	200,0

Как проверить коммутатор, своими силами

Приветствую вас друзья на сайте ремонт автомобилей своими руками. Система зажигания автомобилей ВАЗ выполняет одну из главных функций – она формирует искру, обеспечивает воспламенение топливовоздушной смеси и эффективную работу силового узла.

Коммутатор

Но система зажигания – это не один какой-то узел или деталь. Она состоит из нескольких сложных элементов, одним из которых является коммутатор.

Каково назначение этого устройства? Как его проверить? Когда стоит производить замену?

Назначение и особенности конструкции коммутатора

Коммутатор – это один из элементов электрического оборудования автомобиля. Его задача – обеспечение нормальной работы бесконтактной системы зажигания. Крепления узла производится в подкапотном пространстве.

Устройство отличается надежностью, способностью выдерживать серьезные вибрации и ударные нагрузки. Это очень важно, ведь в корпусе коммутатора находятся чувствительная к воздействиям электроника.

В основе коммутатора ВАЗ – стандартная микросхема L 497, которая производит управление транзистором «N-P-N» типа.

Особенность схемы – возможность программирования со стороны пользователя и установка необходимого коэффициента задержки. От корректности этого показателя напрямую зависит запуск холодного двигателя.

Благодаря четкой настройке, можно ускорить частоту вращения коленчатого вала (исключив при этом провалы в работе) и гарантировать качественную тягу силового узла.

К основным параметрам устройства можно отнести:

Диапазон напряжений – от 6 до 16 Вольт;
рабочий уровень напряжения – 13,5 Вольт;
обеспечение бесперебойной искры при вращении коленвала в диапазоне от 20 до 7000 оборотов;
ток коммутации – от 7,5 до 8,5 А.

Признаки неисправности коммутатора

Одним из главных симптомов неисправности коммутатора — потеря искры. Двигатель плохо заводится и время от времени глохнет, появляются перебои в работе.

Но не стоит торопиться с заменой — важно убедиться в причине, ведь потеря искры может произойти по целому ряду причин – выходу из строя датчика Холла, разрыве ремня ГРМ, неисправности катушки зажигания, плохому контакту в крышке распределителя, проблемами в проводке и так далее.

Если диагностика остальных узлов не дала результатов, то можно переходить к нашему «герою». Но как проверить коммутатор, ведь устройство имеет весьма сложную конструкцию?

Как проверить коммутатор, своими силами

Большинство автолюбителей не морочат голову с диагностикой и просто ставят новый узел. Такой способ имеет свои плюсы. Во-первых, не нужно тратить время на проверку – достаточно установить новую деталь.

Во-вторых, можно сразу определить, в ней причина или нет. На самом деле бояться работы не стоит, ведь проверка коммутатора занимает несколько минут.

Итак, для выполнения работ в домашних условиях хватит контрольной лампы (номинальное напряжение должно быть 12 Вольт) и стандартного набора ключей.

С их помощью можно убедиться в наличии или отсутствии импульсов, а в дальнейшем принять решение об исправности самого устройства.

Алгоритм действий по проверке коммутатора следующий:

Для начала выполнения работ желательно отключить АКБ, что бы случайно не замкнуть проводки, которые вы будите откручивать.

С помощью ключа на «восемь» выкручивайте гайку и снимите проводок с катушку зажигания с маркировкой «К». Этот провод легко распознать – он имеет коричневатый цвет и направляется к зажиму под маркировкой один на коммутаторе;

Подключайте этот провод через контрольную лампочку к зажиму «К» на катушке зажигания, а далее подсоединяйте аккумулятор;

Включайте стартер двигателя и наблюдайте за действиями лампы. Если она мигает, то коммутатор исправен. Если же лампочка не подает никаких признаков жизни, то единственный выход – это замена устройства.

При наличии сомнений в исправности детали, проверка должна производиться на специальном стенде (такой всегда есть на СТО).

В этом случае можно не только определить факт работоспособности изделия, но и измерить продолжительность импульсов.

При появлении первых подозрений не стоит сразу же менять коммутатор или тратить деньги на мастера. Вы вполне способны справиться с работой своими руками.

Тем более, теперь вы знаете, как проверить коммутатор на ВАЗ 2109 и других моделях отечественной марки. Остается выделить время и подготовить минимальный набор инструментов. Удачной дороги и конечно же без поломок.

Как проверить коммутатор ВАЗ-2109 (инжектор, карбюратор) своими руками: инструкция

Каждый владелец легкового транспорта должен не только постоянно следить за технической исправностью своего верного четырехколесного друга, но и понимать, из каких комплектующих состоит эта довольно сложная техника, чтобы иметь возможность своевременно заменить вышедший их строя элемент.

Автомобильная система зажигания

Конечно, в автомобиле ВАЗ-2109, да и в других моделях, каждая система очень важна, ведь она выполняет свое основное предназначение, а выход из строя любой системы просто не позволит машине осуществляет свои функции. Поэтому в своем автомобиле нужно наблюдать за каждой системой, и, конечно, за системой зажигания, без которой силовой узел не сможет работать. Автовладельцы не должны рассматривать систему зажигания как отдельную деталь, так как она состоит из нескольких достаточно сложных комплектующих, а одним из самых важных является коммутатор.

Довольно часто владельцы машин задаются вопросом: как можно проверить коммутатор ВАЗ-2109 и реально ли с этой задачей справиться самостоятельно? С этими вопросами мы и попробуем далее разобраться.

Читайте также: Как проверить катушку зажигания ВАЗ-2109

Какие признаки укажут на неисправность коммутатора

Самый очевидный признак неисправности коммутатора – это потеря так называемой искры, а также перебои в работе двигателя, к примеру, он может начать плохо заводиться и быстро глохнуть даже после прогрева.

Менять коммутатор из-за потери искры сразу не рекомендуется, так как такую неисправность порой вызывают и другие автомобильные комплектующие, которые выходят из строя:

датчик Холла;
разрыв ремня ГРМ;
плохой контакт в распределителе;
поломка катушки зажигания. Если неисправность будет обнаружена именно в этом элементе, то, по мнению специалистов, катушку нужно заменить, а не тратить время на ее починку.

Если диагностика вышеописанных комплектующих подтвердит их исправность, придется приступить к проверке более сложного устройства, которое называется коммутатором.

Самостоятельная проверка коммутатора

Чтобы проверить работу коммутатора своими силами, потребуются набор обычных автомобильных ключей. Мультиметром и специальной лампочкой замеряется номинальное напряжение, показатель которого должен быть не более 12 В.

Самостоятельно проверить дееспособность коммутатора довольно просто, если выполнять это мероприятие поэтапно:

Аккумуляторную батарею нужно отключить от питания, чтобы не допустить замыкания проводки.
Используя ключ размером на 8, отвинчивается крепеж с провода, который идет к катушке зажигания. Найти этот проводок довольно просто по маркировке «К».
Отсоединенный провод нужно соединить с контрольной лампочкой и зажимом, у которого имеется такая же маркировка «К».
Далее следует подсоединить этот провод к аккумуляторной батарее.
После включения автомобильного стартера нужно понаблюдать за так называемым поведением контрольной лампочки. Если коммутатор исправен, лампочка будет периодически включаться и выключаться, а если никаких действий она не станет производить, то устройство впору считать недееспособным, и его понадобится заменить.

Читайте также: Проверка генератора на ВАЗ-2109

На этом процесс проверки коммутатора считается законченным, и, как многие могут убедиться, он весьма прост и понятен. Поэтому не стоит сразу обращаться за решением этого вопроса на СТО и тратить при этом довольно внушительную сумму денег. В первую очередь стоит попробовать проверить это устройство самостоятельно, а если все же возникнут трудности, то можно в любой момент посмотреть обучающее видео на интернет-ресурсе, которое проводят настоящие мастера своего дела.

Читайте также: Как почистить карбюратор ВАЗ-2109

Если же автовладелец ВАЗ-2109 будет сомневаться в исправности элемента, то лучше всего проверить его работу на контрольно-проверочном стенде, который предусматривается на каждой станции технического обслуживания. С помощью такого стенда проверяется не только дееспособность коммутатора, но и продолжительность импульса, который вырабатывается этим устройством.

Выключатель сигнала ВАЗ-21011 21011-3402051 на автомобиль ВАЗ-2101

13832101

# 13832101
Гайка M6 с зубчатым буртиком

2101-3402060 # 21011-3402060
Крышка переключателя сигналов

$ 11,85

2101-3726400

# 2101-3726400
Реле указателей поворота

21011-3402060 # 2101-3402060
Крышка

$ 17,78

2101-3726410

# 2101-3726410
Пульт дистанционного управления

2101-3402068

# 2101-3402068
Шайба упорная

2101-3402050 # 2101-3402050
Выключатель сигнала ВАЗ-21011

$ 59,26

21011-3402050 2101-3402075

# 2101-3402075
Тяга передней подвески

2101-3402077

# 2101-3402077
Шайба

2101-3402076

# 2101-3402076
Весна

21011-3709310-50

# 21011-3709310-50
Переключатель

21011-3709310-60

# 21011-3709310-60
Переключатель

2103-3709609

# 2103-3709609
Переключатель

21011-3709310-80

# 21011-3709310-80
Переключатель

107

# 107
Гайка М4 низкая

12605170

# 12605170
Шайба стопорная 4

10519201

# 10519201
Шайба 4

2101-3738030

# 2101-3738030
Кронштейн

2101-3738010

# 2101-3738010
Реле-выключатель

14142390

# 14142390
Лампа 4Вт

2101-3726000 # 2101-3726000
Боковой указатель поворота

$ 29,63

2101-3726065

# 2101-3726065
Прокладка

2101-3721001

# 2101-3721001
Звуковой сигнал Low Tone

10615471

# 10615471
Шайба стопорная 6

2101-3721290

# 2101-3721290
Кронштейн

# 10

1
Болт М6х12

21012-3721290

# 21012-3721290
Кронштейн

2101-3757010

# 2101-3757010
Свет

12605570

# 12605570
Шайба стопорная 8

2101-3720000

# 2101-3720000
Переключатель

16043421

# 16043421
Болт М8х20

107

# 107
Гайка M12x1,5

2101-3720125

# 2101-3720125
Наконечник переключателя

16100811

# 16100811
Гайка М8

2101-3721000

# 2101-3721000
Высокий тон звукового сигнала

2101-3726110-01

# 2101-3726110-01
Переключатель

Привод предохранительных выключателей ВАЗ-ИМ1-ТД-РАДИУС-БОЛТ-С

Контроллер данных: Parmley Graham Limited,

South Shore Road, Гейтсхед, Тайн и Уир, NE8 3AE

Parmley Graham Limited собирает и обрабатывает ваши личные данные, когда вы взаимодействуете с нами.Для целей настоящей Политики конфиденциальности ссылки на «мы», «нас» или «организацию» относятся к Parmley Graham Limited. Организация является контролером ваших личных данных и несет ответственность за соблюдение законов о защите данных. Организация стремится быть прозрачной в отношении того, как она собирает и использует эти данные, а также выполнять свои обязательства по защите данных.

Это уведомление относится ко всем поставщикам, клиентам и другим сторонам, которые пользуются услугами Parmley Graham Limited.

Предоставляя свои личные данные, вы подтверждаете, что мы можем использовать их только способами, изложенными в настоящей Политике конфиденциальности.

Время от времени нам может потребоваться внести изменения в настоящую Политику конфиденциальности, например, в результате правительственного регулирования, новых технологий или других изменений в законах о защите данных или конфиденциальности в целом, и мы предоставим вам новое уведомление о конфиденциальности, когда мы сделаем существенные обновления.

Наши принципы конфиденциальности

Когда мы собираем и используем ваши персональные данные, мы обеспечиваем надлежащий уход за ними и используем их в соответствии с нашими принципами конфиденциальности, изложенными ниже, согласно которым личная информация, которую мы храним о вас, должна быть:

· обрабатывается честно, законно и прозрачно;

· получено только для определенных законных целей;

· адекватно, актуально и не чрезмерно;

· точные и актуальные;

· не удерживается дольше необходимого;

· обрабатывается в соответствии с правами субъектов данных;

· защищен соответствующим образом;

· нельзя передавать за пределы Европейской экономической зоны (ЕЭЗ), за исключением случаев, когда это необходимо и эта страна или территория также обеспечивает адекватный уровень защиты.

Какие личные данные мы собираем?

Мы собираем и обрабатываем различные данные о вас. Это может включать:

· контактные данные, такие как имя, адрес электронной почты, почтовый адрес и номер телефона;

· финансовая информация и информация о характере вашего бизнеса, такая как банковские реквизиты, данные кредитной карты и информация, полученная в результате наших проверок кредитоспособности;

· подробности вашего взаимодействия с нами через наши филиалы или в Интернете;

· информация о характере вашего бизнеса и коммерческих активов;

· ваше изображение может быть записано на систему видеонаблюдения при посещении сайта Parmley Graham;

· информация, полученная с помощью файлов cookie.Вы можете узнать больше об этом в нашей политике использования файлов cookie; и

· ваши маркетинговые предпочтения.

Как мы собираем ваши личные данные?

Мы собираем, храним и обрабатываем личные данные напрямую от вас:

· по запросу;

· при создании учетной записи у нас;

· при покупке любого из наших продуктов или услуг;

· кавычки;

· через наши телефонные разговоры с вами;

· по электронной почте;

· когда вы предоставляете нам свои данные онлайн или офлайн;

· когда вы общаетесь с нами в социальных сетях;

Как мы используем ваши личные данные?

В основном мы используем ваши персональные данные для предоставления вам товаров и услуг.Мы используем ваши персональные данные по ряду других причин, которые описаны в списке ниже.

В определенных ситуациях мы требуем, чтобы ваши данные преследовали наши законные интересы таким образом, который можно было бы разумно ожидать в рамках ведения нашего бизнеса, при этом гарантируя, что такие бизнес-потребности не нарушают ваши права и свободы и не причиняют вам никакого вреда. В тех случаях, когда мы указываем законные интересы в качестве причины, мы также описываем ниже, что мы считаем этими законными интересами.

В определенных ситуациях мы можем собирать и обрабатывать ваши данные с вашего согласия. Обычно мы запрашиваем ваше согласие только при предоставлении вам маркетинговой информации, включая информацию о других продуктах и услугах. Это станет ясно, когда вы предоставите свою личную информацию. Если мы попросим вашего согласия, мы объясним, почему это необходимо.

Для чего мы используем ваши личные данные для	Наши причины (правовая основа)	Разъяснение наших законных интересов
Создайте учетную запись клиента	Законный интерес	Эффективность процесса при такой деятельности
Предоставим вам котировки	Законный интерес	Эффективность процесса при такой деятельности
Обработка вашего заказа, чтобы предоставить вам товары и услуги	Договорные обязательства	Выполнить договор
Уведомить вас о статусе вашего заказа	Законный интерес	Эффективность процесса при такой деятельности
Управляйте своим счетом	Законный интерес	Ведение деловой документации
Выявлять, расследовать и сообщать о финансовых преступлениях (например, о мошенничестве)	Соответствие законодательным нормам	NA
Провести маркетинговую коммуникацию, чтобы проинформировать вас о других продуктах и услугах	Законный интерес	Чтобы клиенты, подписанные на рассылку, были в курсе последних новостей о связанных услугах и продуктах.
Использование видеонаблюдения для записи изображений в целях безопасности.	Законный интерес	Для защиты наших клиентов, помещений, активов и сотрудников от преступлений

Кто имеет доступ к данным?

Ваша информация может быть передана внутри организации, в том числе директорам, членам финансовой группы штаб-квартиры, ИТ-персоналу и сотрудникам филиалов, если доступ к данным необходим для выполнения их ролей.

Кроме того, мы можем иногда передавать ваши данные доверенным третьим лицам, которые обрабатывают данные от нашего имени. Мы передаем только ту личную информацию, которая им необходима для оказания им конкретных услуг, и они могут использовать ваши данные только по причинам, которые мы описали.

Мы тесно сотрудничаем со сторонними обработчиками данных, чтобы обеспечить постоянное уважение и защиту вашей конфиденциальности.

Как мы защищаем данные?

Организация серьезно относится к безопасности ваших данных.У нас есть внутренние политики и средства контроля, чтобы гарантировать, что ваши данные не будут потеряны, случайно уничтожены, использованы не по назначению или разглашены, а также доступны только сотрудникам, выполняющим свои обязанности.

Мы защищаем доступ к нашим системам, а доступ к вашим личным данным защищен паролем.

Мы регулярно отслеживаем нашу систему на предмет возможных уязвимостей и атак, а также проводим тестирование на проникновение, чтобы определить пути дальнейшего повышения безопасности.

Как долго мы храним данные?

Мы будем хранить ваши личные данные только до тех пор, пока это необходимо для достижения целей, для которых они собираются.

При оценке срока хранения ваших персональных данных мы принимаем во внимание:

· требования нашего бизнеса и предоставляемых услуг;

· любые законодательные или юридические обязательства;

· цели, для которых мы изначально собирали персональные данные;

· законные основания, на которых мы основали нашу обработку;

· типы собранных нами персональных данных;

· количество и категории ваших персональных данных; и

· можно ли разумно выполнить цель обработки другими средствами.

Ваша обязанность сообщать нам об изменениях

Важно, чтобы личная информация, которую мы храним о вас, была точной и актуальной. Пожалуйста, информируйте нас, если ваша личная информация изменится во время ваших рабочих отношений с нами.

Ваши права / обращение в регулирующий орган

Как субъект данных вы имеете следующие права в отношении использования нами ваших личных данных:

— Право на доступ к вашим личным данным

Вы имеете право на получение копии ваших личных данных, которые мы храним, и некоторых деталей того, как мы их используем

— Право на исправление

Мы принимаем разумные меры для обеспечения точности и полноты личной информации, которую мы храним о вас.Однако, если вы не верите, что это так, свяжитесь с нами, используя данные, указанные в вашей документации, и вы можете попросить нас обновить или изменить ее.

— Право на стирание

В определенных обстоятельствах вы имеете право попросить нас удалить вашу личную информацию, например, если личная информация, которую мы собрали, больше не нужна для первоначальной цели или если вы отозвали свое согласие. Однако это должно быть сбалансировано с другими факторами, например, в зависимости от типа личной информации, которую мы храним о вас, и того, почему мы ее собрали, могут быть некоторые юридические и нормативные обязательства, которые означают, что мы не можем выполнить ваш запрос.

— Право на ограничение обработки

В определенных обстоятельствах вы имеете право попросить нас прекратить использование вашей личной информации, например, если вы считаете, что личная информация, которую мы храним о вас, может быть неточной, или если вы считаете, что нам больше не нужно обрабатывать вашу личную информацию.

— Право на переносимость данных

В определенных обстоятельствах у вас есть право потребовать, чтобы мы передали любую личную информацию, которую вы нам предоставили, другой третьей стороне по вашему выбору.После передачи другая сторона будет нести ответственность за сохранение вашей личной информации.

— Право на возражение против прямого маркетинга

Вы можете попросить нас прекратить отправку вам маркетинговых сообщений в любое время. Дополнительную информацию см. В разделе «Маркетинг» в конце этой страницы.

— Право не подвергаться автоматизированному принятию решений

Мы не используем автоматизированное принятие решений

— Право на отзыв согласия

Для определенных видов использования вашей личной информации мы будем запрашивать ваше согласие.Если мы это сделаем, вы имеете право отозвать свое согласие на дальнейшее использование вашей личной информации.

Если вы хотите воспользоваться любым из этих прав, свяжитесь с по электронной почте: [email protected], по адресу: Parmley Graham Ltd, South Shore Road, Gateshead, Tyne and Wear, NE8 3AE.

Если мы решим не предпринимать никаких действий по вашему запросу, мы объясним вам причины нашего отказа.

Если вы считаете, что ваши данные обрабатывались некорректно, или вы недовольны нашим ответом на любые запросы, которые вы нам направили относительно использования ваших личных данных, вы имеете право подать жалобу в Управление уполномоченного по информации.

Вы можете связаться с ними по телефону 0303 123 1113.
Или перейдите по адресу https://ico.org.uk/make-a-complaint/ (открывается в новом окне; обратите внимание, что мы не несем ответственности за содержание внешних веб-сайтов)

Если вы находитесь за пределами Великобритании, вы имеете право подать жалобу в соответствующий регулирующий орган по защите данных в стране вашего проживания.

Маркетинг

Мы обязуемся отправлять вам только те маркетинговые сообщения, в получении которых вы явно выразили заинтересованность.Если вы хотите отказаться от подписки на электронные письма, отправленные нами, вы можете сделать это в любое время, следуя инструкциям по отказу от подписки, которые появляются во всех электронных письмах, или отправив электронное письмо с адреса электронной почты, от которого вы хотите отказаться, для отказа от подписки @ parmley-graham .co.uk.

Майкл Генри Хайден и Энн Либби

ПРЕСС-РЕЛИЗ

Del Vaz Projects рада представить Reflexions, выставку для двух человек, на которой представлены расписные настенные рельефы Майкла Генри Хайдена и полированные алюминиевые скульптуры Анны Либби.В представленных работах оба художника используют повсеместную домашнюю атрибутику как основу, на которой строятся нестабильные и амбивалентные повествования.

В трех настенных рельефах Хайдена (все 2015 г.) последовательно повторяются идентичные расположения стены, выключателя света, отделки, двери и цепного замка. Используя классические техники рисования, такие как светотень, и ссылаясь на световые эффекты в стиле нуар и неонуар, Хайден затем рисует каждую трехмерную конструкцию, чтобы отразить отдельные домашние сцены.Эти сцены развиваются из гиперреальности, как тени, отбрасываемые утренним светом, проходящим через ставни, и становятся все более эмоциональными — как угрожающий красный свет, прорезающий венецианские жалюзи à l’heure entre chien et loup. И, наконец, необъяснимое сочетание света и цвета встречаются в состоянии повышенного психологического возбуждения.

Создав последнюю серию скульптур, Либби продолжает отливать элементы жалюзи из алюминия и полировать их до зеркального блеска.В этом, казалось бы, парадоксальном жесте художник соединяет окно и штору, уговаривая преломляющее качество стекла на жалюзи, чтобы создать объекты, которые одновременно непрозрачны и непроницаемы, но полны света, глубины и перспективы. Жесткое и эфемерное сочетается с постоянством скульптуры.

Работы Хайдена и Либби — созерцания на пороге. Изнутри двери, окна и жалюзи позволяют нам контролировать то, что открывается, разделяется и скрывается снаружи.Эти работы, однако, не касаются того, кто или что находится за пределами, а скорее чего-то гораздо более неуловимого — с кем или с чем он сталкивается. Хотя их непроницаемость «порочена» нарисованными на них тенями или светом, который они отклоняют, уступает место зеркальное отражение, отражение или, скорее, рефлекс-ион, где произведение (субъект) и зритель (объект) сливаются воедино.

Майкл Генри Хайден (род. 1981, Силоам-Спрингс, Арканзас) получил степень магистра иностранных дел в Университете Южной Калифорнии в Лос-Анджелесе и степень бакалавра иностранных дел в Купер Юнион, Нью-Йорк.Недавние выставки включают Moskowitz-Bayse, Лос-Анджелес; Team Gallery, Нью-Йорк; Галерея «Левое поле», Сан-Луис-Обиспо; M + B, Лос-Анджелес; Galerie Xippas, Париж; ACME., Лос-Анджелес; Стив Тернер Современник, Лос-Анджелес; LA>

Энн Либби (р. 1987, Лос-Анджелес, Калифорния) недавно провела персональные выставки в Night Gallery, Лос-Анджелес; Риборди Тетаз, Женева; Маджента-Плейнс, Нью-Йорк, штат Нью-Йорк; Мягкое открытие, Лондон, Даунер, Берлин; Проектное пространство Зака, Нью-Йорк; Кафе Вайолет, Бруклин; и Столичные структуры, Балтимор.Ее работы были включены в групповые выставки в «Различных небольших кострах» в Лос-Анджелесе; Галерея Джоша Лилли, Лондон; Галерея Нины Джонсон, Майами; Галерея Мередит Розен, Нью-Йорк и другие. Она была представлена в Artforum, Art in America, Artsy, Mousse Magazine и Emulsion Magazine, среди других. Она живет и работает в Лос-Анджелесе.

Двойной переключатель — Анелиз Ваз

Просматривать
- Обзор
- Платные истории
- Выбор редактора
- Ватти
- Приключение
- Современное освещение
- Разнообразный горит
- Фанфики
- Фантазия
- Историческая беллетристика
- Фильм ужасов
- Юмор
- ЛГБТК +
- Тайна
- Новый взрослый
- Нехудожественная литература
- Паранормальное явление
- Поэзия
- Романтика
- Научная фантастика
- Короткий рассказ
- Подростковая фантастика
- Триллер
- Оборотень
- Выбор Wattpad
- Выбор редактора
- Доступно в книжных магазинах
- От наших звезд
- Хиты Wattpad Studios
- Куратор сообщества: @darlis_steff
- Написано с гордостью
Сообщество
- Награды Уотти

Напишите
- Создать новую историю
- Мои истории
- Полезные ресурсы для писателей
- Программы и возможности Wattpad
- Писательские конкурсы

Попробовать Премиум

Двойной переключатель

Рейтинг самых впечатляющих

# 335 эсколар из 954 рассказов

Другие рейтинги

# 16 гемеос из 42 рассказов
# 106 Сейя из 236 рассказов
# 899 Conto из 1.8K историй
# 44 год инфантоювенил из 45 рассказов

Платные истории
Попробовать Премиум
Скачать приложение
Язык
Писатели
|
Бизнес
Вакансий
Пресс

Условия
Конфиденциальность
Доступность
Справка
© 2021 Wattpad

убиквитиновый переключатель контролирует автокаталитическую инактивацию протеазы репарации ДНК-белков SPRTN | Исследование нуклеиновых кислот

Аннотация

Ремонт ковалентных ДНК-белковых сшивок (DPC) металлопротеазой SPRTN предотвращает нестабильность генома, преждевременное старение и канцерогенез.SPRTN специфически активируется структурами ДНК, содержащими одно- и двухцепочечные элементы, но разрушает белковые компоненты DPC беспорядочно и независимо от аминокислотной последовательности. Этот недостаток специфичности полезен для нацеливания на различные белковые аддукты, однако он требует взамен жесткого контроля, чтобы запретить неконтролируемый протеолиз белков хроматина. Здесь мы обнаруживаем компоненты и принципы переключения убиквитина, который негативно регулирует SPRTN. Мы демонстрируем, что моноубиквитилирование индуцируется независимо от лигазы E3 и, в отличие от предыдущих предположений, не контролирует доступ фермента к хроматину.Данные, полученные на клетках и in vitro, показывают, что моноубиквитилирование индуцирует инактивацию фермента путем запуска автокаталитического расщепления в транс-, а также примирования SPRTN для протеасомной деградации в цис-. Наконец, мы показываем, что деубиквитилирующий фермент USP7 противодействует этому отрицательному контролю SPRTN в присутствии DPC.

ВВЕДЕНИЕ

Ковалентные перекрестные связи ДНК-белок (DPC) представляют собой особенно опасные повреждения ДНК, которые мешают всем основным операциям хроматина, включая транскрипцию и репликацию (1–3).Эндогенные DPC вызываются не только токсичными метаболитами, такими как реактивные альдегиды, но также захватом промежуточных продуктов ковалентной реакции ферментов, таких как топоизомеразы (4). Более того, сшивание может быть вызвано экзогенными агентами, такими как ионизирующее излучение, а также различными широко используемыми химиотерапевтическими средствами (5,6). Белковый компонент DPCs нацелен на репарацию протеазами семейства Wss1 / SPRTN (7–14). Человеческая протеаза SPRTN важна для жизнеспособности клеток млекопитающих, что подчеркивает масштаб угрозы, исходящей от эндогенных DPC (15).Более того, мутации зародышевой линии в SPRTN , которые приводят к делеции С-концевого хвоста фермента, являются причиной синдрома Ruijs-Aalfs (RJALS) (16,17). RJALS характеризуется преждевременным старением и ранним началом гепатоцеллюлярной карциномы с аналогичными фенотипами, наблюдаемыми у гипоморфных мутантных мышей Sprtn (16-18). SPRTN — это ДНК-зависимая металлопротеиназа, которая активируется структурами ДНК, содержащими одно- (ss) и двухцепочечные (ds) элементы, такие как соединения ss- / dsDNA или потертые концы dsDNA (19).Однако протеолитическая активность SPRTN очень неоднородна (8,9,11). Отсутствие предпочтения определенных аминокислотных последовательностей необходимо для нацеливания на различные DPC, но взамен это требует жесткого контроля. Значительная часть SPRTN (30-50%) конститутивно моноубиквитилирована (20-22). Модификация сильно снижается в вариантах SPRTN с заменами аминокислот в С-концевом убиквитин-связывающем цинковом пальце (UBZ) фермента (20–22). Попытки идентифицировать сайт моноубиквитилирования с помощью масс-спектрометрии выявили четыре потенциально модифицированных остатка лизина (K), но варианты SPRTN с коллективными заменами лизина на аргинин (KR) сохранили модификацию (8).Было высказано предположение, что моноубиквитилирование регулирует доступ фермента к хроматину, поскольку рекрутирование SPRTN на хроматин после индукции DPC сопровождается быстрым деубиквитилированием (8). Однако непосредственное тестирование этой модели оказалось невозможным, поскольку задействованный деубиквитилирующий фермент (DUB) неизвестен. Соответственно, механистические принципы регулирования SPRTN посредством моноубиквитилирования остаются неясными.

Здесь мы идентифицируем DUB USP7 как фактор, ответственный за деубиквитилирование SPRTN, когда клетки вызываются DPC.Более того, мы обнаружили, что моноубиквитилирование вызывает прямую инактивацию SPRTN, а не регулирует рекрутирование фермента хроматином. Модификация запускает автоматическое расщепление протеазы, а также усиливает протеасомную деградацию за счет прайминга полиубиквитилирования. Наконец, экспериментов in vitro подтверждают, что конститутивное моноубиквитилирование происходит очень беспорядочным, независимым от лигазы E3 образом. В совокупности мы раскрываем принципы и компоненты регуляторного переключателя, который обеспечивает безопасную работу потенциально опасной ферментативной активности в клетках человека.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Антитела и ингибиторы

антитела против Strep (ab76949) и против гистона h4 (ab10799) были приобретены у Abcam; антитела против тубулина (T6074), против Flag (F3165) и против IgG крысы (A9037) были приобретены у Sigma; антитело против GAPDH (2118) было приобретено в Cell Signaling; анти-USP7 (sc-137008) и антигистон h2 (sc-377468) были приобретены в Санта-Круз; Козьи анти-мышиные иммуноглобулины / HRP (P0447), свиные анти-кроличьи иммуноглобулины / HRP (P0399) антитела были приобретены у Dako, а антитела против GFP (PABG1, используемые для обнаружения YFP) были приобретены у Chromotek.Крысиные моноклональные антитела против SPRTN человека (6F2) получали путем иммунизации крыс Wistar очищенным GST-меченным SPRTN-ΔC, который экспрессировали в клетках насекомых, как описано ранее (8). Супернатанты гибридом подвергали скринингу с помощью ELISA на связывание с очищенным немаркированным белком SPRTN и дополнительно подтверждали вестерн-блоттингом лизатов клеток HeLa, а также рекомбинантного белка. Клон SPRT 6F2 (IgG2a) дважды субклонировали путем ограниченного разведения для получения стабильной моноклональной линии клеток гибридомы. Для ингибирования убиквитин-активирующего фермента E1 MLN7243 (TAK-243) был приобретен у Chemietek и использован в конечной концентрации 1 мкМ (23).Для ингибирования протеасомной деградации MG132 был приобретен у Sigma (M7449) и использован в конечной концентрации 5 мкМ. Для ингибирования синтеза белка циклогексимид был приобретен у Sigma (C4859) и использован в конечной концентрации 100 мкг / мл.

Клеточные линии

HCT116 дикого типа (WT), HCT116 USP7 KO и HAP1 WT, VCPIP1 KO, USP11 клетки KO были приобретены у Horizon Discovery. HeLa T-REx Flp-In, 293 T-REx Flp-In и DLD1 клетки были предоставлены Cell Services Института Фрэнсиса Крика.Клетки HeLa T-REx Flp-In, стабильно экспрессирующие варианты YFP-SPRTN-Strep-tag, были созданы с использованием системы Flp-In (Thermo Fisher) в соответствии с инструкциями производителя.

Переходная трансфекция

Для временных трансфекций клетки выращивали до 70–90% конфлюэнтности в 12-луночных планшетах. Плазмиды (1 мкг плазмиды) и реагент Lipofectamine 2000 (Invitrogen, 1 мкл / мкг плазмиды) разводили в 50 мкл среды Opti-MEM каждый. Разведения плазмиды и липофектамина 2000 смешивали после 5 мин инкубации.После дополнительных 15 мин инкубации к клеткам добавляли смесь для трансфекции.

трансфекция миРНК

Клетки выращивали до 20-30% конфлюэнтности в 6-луночных планшетах. 3 мкл миРНК (20 мкМ, ON TARGETplus SMARTpool, Horizon, USP7 (L-006097-00-0005), USP11 (L-006063-00-0005), VCPIP1 (L-019137-00-0005), Control (D- 001810-10-05)) и 3 мкл реагента для трансфекции липофектамина RNAiMAX (Invitrogen) разводили в 100 мкл среды Opti-MEM. Разведения реагентов для трансфекции siRNA и Lipofectamine RNAiMAX смешивали после 5-минутной инкубации.После дополнительных 15 мин инкубации к клеткам добавляли смесь для трансфекции. Через 48 ч клетки повторно высевали в чашки диаметром 60 мм с последующим фракционированием хроматина на следующий день.

Генерация нокаутирующих ячеек USP7

gRNA1 USP7 (GGTCTGTCTGGATAAAAGCG) и gRNA2 (GAGTGATGGACACAACACCG) были вставлены в плазмиду Lenti-multi-CRISPR (Addgene # 85402; RRID: Addgene_85402), как описано ранее (24). Полученную плазмиду затем временно трансфицировали в клетки HAP1 или DLD1, используя липофектамин 2000 (Invitrogen), для получения клеток, нокаутированных по USP7.Через день после трансфекции клетки отбирали пуромицином в течение 48 часов. Затем отобранные клетки повторно высевали в 96-луночные планшеты (0,5 клетки / лунку) для создания единичных клонов. Затем отдельные клоны подвергали скринингу с помощью вестерн-блоттинга с антителом против USP7.

Очистка частично убиквитилированного YFP-SPRTN-EQ-Strep

293 T-REx Flp-In клетки, экспрессирующие YFP-SPRTN-EQ-Strep, выращивали в двух чашках 245 × 245 мм до 50% слияния перед индукцией экспрессии белка в течение ночи добавлением 1 мкг / мл доксициклина.Клетки собирали соскабливанием, дважды промывали PBS и хранили при -80 ° C. Для очистки клетки размораживали и ресуспендировали в 10 мл буфера для лизиса (50 мМ HEPES / NaOH pH 7,2, 1 М NaCl, 10% глицерин, 1% IGEPAL CA-630, комплексные ингибиторы протеазы без ЭДТА, 0,04 мг / мл PefaBloc SC и 20 мМ йодацетамид). После обработки ультразвуком и переваривания бензоназой (4 Ед / мл) в течение 30 минут при 4 ° C лизаты очищали центрифугированием (23 500 g, 45 минут, 4 ° C). 60 мкл шариков MagStrep type3 XT (5% (об. / Об.) Суспензия) инкубировали с супернатантом в течение 1 ч при 4 ° C перед тремя стадиями промывки промывочным буфером (50 мМ HEPES / NaOH, pH 7.2, 0,5 М NaCl, 10% глицерин). Наконец, очищенный YFP-SPRTN-EQ-Strep элюировали 3 × 80 мкл элюирующего буфера (50 мМ HEPES / NaOH pH 7,2, 0,5 М NaCl, 10% глицерин, 50 мМ биотин).

ДУБ экран

71 кДНК, кодирующие человеческие DUB (коллекция деубиквитинирующих ферментов hORFeome v8.1 + семь дополнительных клонов ORFeome: CloneIds: 100011387, 100010734, 100002718, 100066416, 100070362, 100068239) были субклонированы в pDEST17 с использованием шлюза LR Clonase II. Затем плазмидами трансформировали клеток Escherichia coli BL21 (DE3) для экспрессии белка в 50 мл культур.Осадки клеток ресуспендировали в реагенте BugBuster (Merck Millipore, 5 мл / г). Бензоназу (25 Ед / мл) и DTT (5 мМ) добавляли перед инкубацией в течение 20 минут при комнатной температуре. Затем лизаты очищали центрифугированием (16 000 g, 20 мин, 4 ° C). Лизаты смешивали в пулах по три до оценки их способности деубиквитилировать YFP-SPRTN-EQ-Strep. С этой целью очищенный частично убиквитилированный YFP-SPRTN-EQ-Strep инкубировали с пулами лизата в течение 30 мин при 25 ° C. Лизаты нетрансформированных клеток BL21 служили отрицательным контролем, а неспецифическая деубиквитилирующая активность каталитического домена USP2 (USP2 ^cd, BostonBiochem, E-504) — положительным контролем.Затем оценивали деубиквитилирование с помощью SDS-PAGE с последующим вестерн-блоттингом с использованием антител против Strep.

Анализ активности DUB

DUB-кандидаты были частично очищены с использованием стандартной стратегии очистки Ni-NTA, а затем протестированы на их активность либо с использованием набора для анализа убиквитин-родаминового расщепления (BostonBiochem), следуя инструкциям производителя, либо путем инкубации с частично убиквитилированным YFP-SPRTN-EQ-Strep в течение 30 мин при 25 ° C с последующим SDS-PAGE и вестерн-блоттингом с использованием антител против Strep.

Экспрессия и очистка рекомбинантных белков

SPRTN, оптимизированный для бактериальной экспрессии (с использованием GeneOptimizer), был экспрессирован из плазмиды pNIC-Strep-ZB-SPRTN, как описано ранее (19). SPRTN-Ub ^LF был создан с использованием клонирования сборки Гибсона. Flag-SPRTN был создан с использованием инсерционного мутагенеза. Для экспрессии белка плазмидами трансформировали клетки E. coli BL21 (DE3) и выращивали при 37 ° C в среде Terrific broth (TB) до достижения OD 0.7. Экспрессию белка индуцировали добавлением 0,5 мМ IPTG в течение ночи при 18 ° C. Затем клетки собирали, ресуспендировали в буфере A (50 мМ HEPES / KOH pH 7,2, 500 мМ KCl, 1 мМ MgCl ₂, 10% глицерин, 0,1% IGEPAL, 0,04 мг / мл Pefabloc SC, cOmplete протеаза, не содержащая ЭДТА. ингибиторы, 1 мМ трис (2-карбоксиэтил) фосфина гидрохлорид (TCEP), pH 7,2) и лизировали обработкой ультразвуком. Все этапы проводились при 4 ° C. Лизат клеток инкубировали с бензоназой (45 ед. / Мл лизата) в течение 30 мин на льду перед удалением клеточного дебриса центрифугированием при 18 000 g в течение 30 мин.Очищенный супернатант наносили на картриджи высокой емкости Strep-Tactin ^® XT Superflow ^®, промывали 3 объемами колонки (CV) буфера A и 4 CV буфера B (50 мМ HEPES / KOH pH 7,2, 500 мМ KCl, 10% глицерин, 1 мМ TCEP, pH 7,2). Белки элюировали в буфере C 6 CV (50 мМ HEPES / KOH, pH 7,2, 500 мМ KCl, 10% глицерин, 1 мМ TCEP и 50 мМ биотина, pH 7,2). Элюированные белки затем наносили на аффинные колонки HiTrap Heparin HP и промывали 3 CV буфером B перед элюированием в буфере D (50 мМ HEPES / KOH, pH 7.2, 1 M KCl, 10% глицерин, 1 мМ TCEP, pH 7,2). Элюированные фракции, содержащие рекомбинантный белок SPRTN, обессоливали против буфера В с использованием обессоливающих колонок PD-10. Аффинную метку отщепляли в течение ночи при 4 ° C добавлением His-меченной протеазы TEV с массовым соотношением 1:10. Расщепленный рекомбинантный белок SPRTN дополнительно очищали эксклюзионной хроматографией с использованием колонки HiLoad 16/600 Superdex 200 пг, уравновешенной в буфере E (50 мМ HEPES / KOH, pH 7,2, 500 мМ KCl, 10% глицерин, 0,5 мМ TCEP, pH 7.2). Элюированные белки концентрировали с помощью центробежных фильтров Amicon Ultra с отсечкой 10 кДа перед мгновенным замораживанием в жидком азоте и хранением при -80 ° C.

UBE2D3 субклонировали в pDEST17 с использованием шлюза LR Clonase II (Invitrogen). Для экспрессии белка плазмидами трансформировали клетки E. coli BL21 (DE3) и выращивали при 37 ° C в среде Terrific broth (TB) до достижения OD 0,7. Экспрессию белка индуцировали добавлением 0,5 мМ IPTG в течение 3 ч при 37 ° C. Затем клетки собирали, ресуспендировали в буфере A (50 мМ NaH ₂ PO ₄ pH 8, 150 мМ NaCl, 10 мМ имидазол и 0.5 мМ TCEP) с добавлением 0,04 мг / мл Pefabloc SC и комплексных ингибиторов протеаз, не содержащих ЭДТА. Затем клетки лизировали ультразвуком. Все этапы проводились при 4 ° C. Лизат клеток инкубировали с бензоназой (45 ед. / Мл лизата) в течение 30 мин при 4 ° C перед удалением клеточного дебриса центрифугированием при 16 000 g в течение 30 мин. Очищенный супернатант дважды наносили на шарики Ni-NTA, уравновешенные в буфере A, промывали 5 CV буфера A и 7 CV буфера B (50 мМ NaH ₂ PO ₄ pH 8, 500 мМ NaCl, 20 мМ имидазол, 0.5 мМ TCEP). Белки элюировали 5 CV-буфером C (50 мМ NaH ₂ PO ₄ pH 8, 500 мМ NaCl, 250 мМ имидазол, 0,5 мМ TCEP). Элюированные фракции, содержащие рекомбинантный белок His-UBE2D3, обессоливали против буфера D (20 мМ Tris pH 7,5, 150 мМ NaCl, 10% глицерин, 2 мМ TCEP) с использованием колонок для обессоливания PD-10. Рекомбинантный белок дополнительно очищали эксклюзионной хроматографией с использованием колонки HiLoad 16/600 Superdex 200 пг, уравновешенной в буфере D. Элюированные белки концентрировали с помощью центробежных фильтров Amicon Ultra с отсечкой 3 кДа перед быстрым замораживанием в жидком азоте и хранением при -80 °. С.

Анализ убиквитилирования in vitro
Скрининг E2 был проведен с использованием набора для скрининга E2 (UBPBio) в соответствии с инструкциями производителя. Вкратце, человеческие ферменты, конъюгирующие с убиквитином E2 (2 мкМ), инкубировали вместе с каталитически неактивным SPRTN-E112Q (EQ) (2 мкМ), ферментом, активирующим убиквитин E1 (100 нМ), убиквитином (R&D Systems, U-100H, 50 мкМ). или без лизинов N-концевой биотин убиквитин (R&D Systems, UB-NOK-050, 50 мкМ), ДНК (11.1 нМ вириона ФX174) и АТФ (2 мМ) в течение 1,5 ч при 30 ° C. Все другие анализы убиквитилирования in vitro содержали указанные варианты SPRTN, фермент, активирующий убиквитин E1 (300 нМ), убиквитин (50 мкМ), АТФ (2 мМ) и очищенный His-меченый UBE2D3 (концентрации указаны в подписях к рисункам) и были инкубируют 1,5 ч при 30 ° С. Каталитический домен USP2 (USP2 ^cd) был приобретен у BostonBiochem и был включен, как указано. Реакции убиквитилирования останавливали добавлением 4х буфера для образца LDS с добавлением β-меркаптоэтанола и кипячением при 95 ° C в течение 10 мин, а затем подвергали SDS-PAGE с последующим окрашиванием белком InstantBlue Coomassie.Контраст отсканированных изображений был отрегулирован глобально с помощью программного обеспечения Adobe Photoshop
In vitro протеазный анализ
Реакции проводили в 20 мкл, содержащих указанные варианты SPRTN (500 нМ), гистон h2 (500 нМ, NEB), как указано, и либо оцДНК Вириона ФX174, либо дцДНК RFI (11,1 нМ, NEB). Реакционный буфер содержал 19,5 мМ HEPES / KOH pH 7,2, 2,9% глицерина, 5 мМ TCEP и 80 или 150 мМ KCl. Реакции инкубировали при 25 ° C в течение 1 ч и останавливали добавлением 4х буфера для образцов LDS с добавлением β-меркаптоэтанола.Образцы кипятили при 95 ° C в течение 10 минут, разделяли на 4–12% градиентных гелях Bis – Tris NuPAGE и окрашивали с использованием белкового красителя InstantBlue Coomassie или анализировали вестерн-блоттингом с использованием антител против SPRTN, анти-Flag и анти-h2. Интенсивность вестерн-блоттинга и сканированных гелей была отрегулирована глобально с помощью Adobe Photoshop. Реакции расщепления количественно оценивали путем деления количества расщепленного белка на общее количество белка (расщепленного и нерасщепленного), как определено анализом результатов вестерн-блоттинга с использованием ImageJ.
Анализ протеин-олигонуклеотидного конъюгата
Белок G конъюгировали с 5′-концевым, 3′-концевым или внутренним основанием 30-членного олигонуклеотида (5′-Cy5-ACCAGTGCCTTGCTAGGACATCTTTGCCCA-3 ‘), как описано ранее (19). Двухцепочечные DPC были получены путем отжига комплементарного обратного олигонуклеотида. Отжиг проводили непосредственно перед реакциями расщепления путем смешивания конъюгатов и обратных олигонуклеотидов в соотношении 1: 1,2 в буфере для отжига (25 мМ HEPES / KOH, pH 7.2, 50 мМ KCl, 5% глицерин и 0,2 мг / мл БСА) с последующей инкубацией в течение 2 минут при 37 ° C и последующим снижением температуры на 1 ° C / мин до достижения 25 ° C. Реакции расщепления с модельными DPC проводили в реакционном объеме 10 мкл, содержащем 6,25 нМ SPRTN и 25 нМ DPC в конечном реакционном буфере 17,5 мМ HEPES / KOH pH 7,2, 80 мМ KCl, 3,5% глицерина, 5 мМ TCEP и 0,1 мг. / мл BSA. Реакции инкубировали 2 ч при 25 ° C. Добавляли 2 мкл загрузочного красителя 6 × Orange G перед тем, как реакции разделялись на гелях с 20% TBE с использованием 1 × TBE в качестве рабочего буфера при 4 ° C.Гели фотографировали с использованием системы BioRad Chemidoc MP с настройками фильтра для флуоресценции Cy5. Интенсивность сканированных гелей регулировали глобально с помощью ImageJ, который также использовали для количественной оценки расщепления путем деления количества расщепленного конъюгата на общее количество конъюгата (расщепленного и нерасщепленного) и вычитания фонового сигнала (определенного из дорожек без SPRTN).
Коиммуно-преципитация
Для проверки связывания между USP7 / VCPIP1 / USP11 и SPRTN, клетки HeLa-T-REx Flp-In, стабильно экспрессирующие варианты YFP-SPRTN-Strep, высевали в 60-миллиметровые планшеты для культуры ткани, выращивали до 50% слияния и затем временно трансфицировали pcDNA5. -FRT / TO плазмиды, кодирующие варианты Flag / Flag-USP7 / VCPIP1 / USP11, с использованием липофектамина 2000 (Invitrogen) в соответствии с инструкциями производителя.Через шестнадцать часов после трансфекции и одновременной индукции экспрессии белка доксициклином (1 мкг / мл) клетки промывали один раз ледяным PBS и собирали соскабливанием в буфере для лизиса (20 мМ Трис / HCl pH 7,5, 137 мМ NaCl, 1% IGEPAL CA-630, 2 мМ ЭДТА, 2 мМ MgCl ₂, 4 Ед / мл бензоназы, комплексные ингибиторы протеазы без ЭДТА, 0,04 мг / мл PefaBloc SC и 20 мМ йодацетамида). Лизаты инкубировали 30 мин на льду перед центрифугированием при 16 000 g в течение 30 мин. Затем супернатанты использовали для иммуноосаждения с использованием 5 мкл магнитных гранул anti-Flag M2 (Sigma) при 4 ° C в течение 1 часа.Затем шарики трижды промывали промывочным буфером (10 мМ Трис / HCl pH 7,5, 150 мМ NaCl, 0,5 мМ EDTA и 0,5% IGEPAL CA-630). Наконец, образцы ресуспендировали в 100 мкл буфера для образцов 1 × LDS, анализировали с помощью SDS-PAGE и вестерн-блоттинга с антителами против Flag, против GAPDH и против Strep.
Анализ клеточного аутодеклаважа
плазмиды pcDNA5-FRT / TO, кодирующие YFP-SPRTN-Strep или YFP-SPRTN-Ub, варианты ^LF (1 мкг) и Flag / Flag-USP7 ^{WT / C223S} (3 мкг) временно трансфицировали с использованием липофектамина 2000 (Invitrogen ) в соответствии с инструкциями производителя.Экспрессию белка индуцировали инкубацией в течение ночи (16 ч) с доксициклином (конечная концентрация 1 мкг / мл). Клетки лизировали на льду в 1 мл буфера для лизиса (50 мМ HEPES pH 7,5, 1 М NaCl, 10% глицерин, 1% IGEPAL CA-630, 2 мМ MgCl ₂, 20 мМ йодацетамид, 0,04 мг / мл PefaBloc SC и cОбщие ингибиторы протеаз, не содержащие ЭДТА). После добавления бензоназы (4 ед. / Мл) лизаты инкубировали 30 мин на льду. Лизаты очищали центрифугированием (16 000 g, 30 мин) при 4 ° C и наносили на 15 мкл GFP-ловушки магнитной агарозы (Chromotek) и обрабатывали в соответствии с инструкциями производителя.Наконец, образцы ресуспендировали в 65 мкл буфера для образцов 1 × LDS, подвергали анализу с помощью SDS-PAGE и вестерн-блоттинга с антителом против GFP (PABG1, Chromotek).
Фракционирование хроматина
Клетки в средней экспоненциальной фазе роста собирали соскабливанием в ледяной 1X PBS. Затем клетки были разделены поровну и либо непосредственно ресуспендированы в 1X буфере LDS, либо инкубированы в течение 10 мин в ледяном буфере CSK (10 мМ PIPES, 100 мМ NaCl, 1,5 мМ MgCl ₂, 5 мМ EDTA, 300 мМ сахароза и 0.5% Triton X-100, 0,04 мг / мл PefaBloc SC и комплексные ингибиторы протеазы без ЭДТА). Затем белки, связанные с хроматином, выделяли центрифугированием на низкой скорости (3000 об / мин, 5 мин при 4 ° C).
Циклогексимидный патрон
Клетки высевали в 12-луночные планшеты для тканевых культур, выращивали до 80% конфлюэнтности и затем обрабатывали 5 мкМ MG132. Через 2 часа клетки обрабатывали 100 мкг / мл циклогексимида (Sigma) в течение указанного периода времени. Наконец, клетки лизировали в 150 мкл 1X буфера для образцов LDS с последующим SDS-PAGE и вестерн-блоттингом с указанными антителами.
Анализ чувствительности к формальдегиду
Длительная обработка: 10 ⁴ клеток высевали на лунку в 12-луночные планшеты и обрабатывали указанной концентрацией формальдегида на следующий день. Через 72 часа среду заменяли реагентом для определения жизнеспособности клеток alamarBlue (36 мкг / мл резазурина в PBS) и планшеты выдерживали еще 1 час для инкубации при 37 ° C. Затем жизнеспособность клеток оценивали путем измерения флуоресценции (возбуждение 560 нм / эмиссия 590 нм). Кратковременная обработка: 5 × 10 ^{4 клеток} высевали на лунку в 12-луночные планшеты и на следующий день обрабатывали формальдегидом в концентрации 1 мМ в течение 2 часов.Через 48 часов среду заменяли реагентом для определения жизнеспособности клеток alamarBlue (36 мкг / мл резазурина в PBS) и планшеты выдерживали еще 1 час для инкубации при 37 ° C. Затем жизнеспособность клеток оценивали путем измерения флуоресценции (возбуждение 560 нм / эмиссия 590 нм).
Обнаружение формальдегид-индуцированных сшивок ДНК-белок
DPC индуцировали обработкой клеток HAP1 WT или USP7 KO 75 мкМ формальдегидом в течение 2 часов. DPC измеряли с помощью анализа преципитации KCl / SDS, как описано ранее (25).Вкратце, клетки дважды промывали PBS и лизировали в 400 мкл денатурирующего лизисного буфера (2% SDS, 20 мМ Tris / HCl, pH 7,5), замораживали в жидком азоте и хранили при -80 ° C до дальнейшей обработки. Лизаты размораживали при 55 ° C в течение 5 минут со встряхиванием 1200 об / мин, после чего образцы пипетировали вверх и вниз 30 раз. Затем клеточный белок осаждали добавлением 400 мкл буфера для осаждения (200 мМ KCl, 20 мМ Трис, pH 7,5) и инкубацией на льду в течение 5 минут. Осажденный белок отделяли центрифугированием на полной скорости при 4 ° C в течение 5 мин.Затем 400 мкл супернатанта сохраняли и использовали для измерения растворимой ДНК. Осадок ресуспендировали в 400 мкл буфера для осаждения и растворяли встряхиванием при 55 ° C в течение 5 минут с последующим охлаждением на льду в течение 5 минут и центрифугированием на полной скорости при 4 ° C в течение 5 минут. После повторения процедуры отмывки 3 раза осадок белка ресуспендировали в 400 мкл буфера протеиназы К (200 мМ KCl, 20 мМ Трис, pH 7,5. Протеиназа К 0,2 мг / мл) и инкубировали при 55 ° C в течение 45 минут. Наконец, к раствору добавляли 10 мкл BSA (50 мг / мл) с последующим охлаждением на льду в течение 5 минут с последующим центрифугированием на полной скорости при 4 ° C в течение 5 минут.Затем собирали супернатант, содержащий сшитую ДНК. Тотальную ДНК и сшитую ДНК обрабатывали 0,2 мг / мл РНКазы A в течение 30 минут при 37 ° C. Концентрации ДНК определяли с использованием набора Qubit ™ dsDNA HS Assay Kit (Thermo Fisher) в соответствии с инструкциями производителя. Количество DPC рассчитывали как отношение между сшитой ДНК и общей ДНК (сшитая плюс растворимая ДНК).
Комплементация
клеток USP7 КО
DLD1 WT или USP7 KO клетки высевали в шестилуночные планшеты, выращивали до 50% конфлюэнтности перед временной трансфекцией плазмидами pcDNA5-FRT / TO, кодирующими YFP / YFP-USP7 ^{WT / C223S} (2 мкг) с использованием липофектамина 2000. (Invitrogen) в соответствии с инструкциями производителя.Через 16 часов после трансфекции клетки пересевали в 12-луночные планшеты (5 × 10 ⁴ клеток на лунку) с последующей обработкой 1 мМ формальдегидом в течение 2 часов на следующий день. Через 48 часов жизнеспособность клеток определяли с помощью анализа жизнеспособности клеток alamarBlue.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Моноубиквитилирование С-концевого хвоста SPRTN беспорядочное
Чтобы понять регуляцию SPRTN с помощью моноубиквитилирования, мы сначала попытались картировать модифицированный остаток (остатки) лизина с помощью усечения белков.Убиквитилирование полноразмерного SPRTN (с N-концом YFP-, с C-концом с меткой Strep) легко наблюдается при временной трансфекции и чувствительно к ингибированию фермента, активирующего убиквитин (E1) (рис. 1A). Усеченный вариант SPRTN, обнаруженный у пациентов с RJALS (SPRTN-ΔC), не убиквитилирован, в то время как изолированный C-концевой хвост (SPRTN-ΔN) модифицирован (рис. 1A). Модификация может быть дополнительно картирована на небольшой фрагмент 7 кДа, который содержит домен UBZ и пять остатков лизина (SPRTN-Δ425).Удивительно, но замена всех пяти лизинов (5KR) не изменяет уровень модификации (рис. 1А). N-концевая YFP-метка и линкер содержат различные лизины, и мы подозревали, что эти остатки также могут подвергаться модификации. В самом деле, делеция YFP-tag приводит к серьезному снижению убиквитилирования фрагмента SPRTN-Δ425-5KR (Рисунок 1B). Однако слегка расширенный вариант (SPRTN-Δ400) с теми же заменами лизина (SPRTN-Δ400-5KR) остается убиквитилированным, если также не заменены все дополнительные лизины (SPRTN-Δ400-9KR) (рис. 1C).Полноразмерный SPRTN с заменой 9KR экспрессируется нестабильно, но, по-видимому, остается моноубиквитилированным (Рисунок 1D). Примечательно, что фрагмент SPRTN-Δ400-8KR только с одним оставшимся остатком лизина демонстрирует несколько модификаций, что указывает на то, что моноубиквитилирование может быть дополнительно модифицировано (дополнительная фигура S1A). Мы пришли к выводу, что моноубиквитилирование SPRTN может нацеливаться на различные остатки лизина (даже на YFP-tag) и может быть расширено до убиквитиновой цепи.
Рисунок 1.
Беспорядочное E3-независимое моноубиквитилирование C-концевого хвоста SPRTN. ( A – D ) Статус моноубиквитилирования усеченных вариантов SPRTN. Плазмиды, кодирующие меченый полноразмерный (FL) SPRTN или укороченные (несущие указанные замены лизина на аргинин (KR) или вариант UBZ *, D473A) временно трансфицировали в клетки HeLa T-REx Flp-In. Экспрессию SPRTN индуцировали добавлением доксициклина за 6 ч до лизиса клеток (включая совместную обработку ингибитором фермента E1, активирующего убиквитин (E1i), как указано) и анализировали с помощью SDS-PAGE и вестерн-блоттинга.( E ) In vitro инкубировали анализы убиквитилирования, содержащие SPRTN-EQ (410 нМ), UBE2D3 (4 мкМ), фермент, активирующий убиквитин E1 (300 нМ), убиквитин (50 мкМ) и АТФ (2 мМ), как указано. в течение 1,5 ч при 30 ° C. Реакции останавливали добавлением буфера для образца LDS и подвергали SDS-PAGE с последующим окрашиванием белком InstantBlue Coomassie. ( F ) Анализ убиквитилирования in vitro , содержащий SPRTN-EQ или SPRTN-EQ-UBZ * (410 нМ), фермент, активирующий убиквитин E1 (300 нМ), убиквитин (50 мкМ), АТФ (2 мМ), UBE2D3 как указанные (8 мкМ) и возрастающие количества каталитического домена USP2 (USP2 ^cd) (0, 250 или 500 нМ) инкубировали в течение 1.5 часов при 30 ° C. Реакции останавливали добавлением буфера для образца LDS и подвергали SDS-PAGE с последующим окрашиванием белком InstantBlue Coomassie.
Рисунок 1.
Беспорядочное E3-независимое моноубиквитилирование C-концевого хвоста SPRTN. ( A – D ) Статус моноубиквитилирования усеченных вариантов SPRTN. Плазмиды, кодирующие меченый полноразмерный (FL) SPRTN или укороченные (несущие указанные замены лизина на аргинин (KR) или вариант UBZ *, D473A) временно трансфицировали в клетки HeLa T-REx Flp-In.Экспрессию SPRTN индуцировали добавлением доксициклина за 6 ч до лизиса клеток (включая совместную обработку ингибитором фермента E1, активирующего убиквитин (E1i), как указано) и анализировали с помощью SDS-PAGE и вестерн-блоттинга. ( E ) In vitro инкубировали анализы убиквитилирования, содержащие SPRTN-EQ (410 нМ), UBE2D3 (4 мкМ), фермент, активирующий убиквитин E1 (300 нМ), убиквитин (50 мкМ) и АТФ (2 мМ), как указано. в течение 1,5 ч при 30 ° C. Реакции останавливали добавлением буфера для образца LDS и подвергали SDS-PAGE с последующим окрашиванием белком InstantBlue Coomassie.( F ) Анализ убиквитилирования in vitro , содержащий SPRTN-EQ или SPRTN-EQ-UBZ * (410 нМ), фермент, активирующий убиквитин E1 (300 нМ), убиквитин (50 мкМ), АТФ (2 мМ), UBE2D3 в качестве указанные (8 мкМ) и возрастающие количества каталитического домена USP2 (USP2 ^cd) (0, 250 или 500 нМ) инкубировали в течение 1,5 ч при 30 ° C. Реакции останавливали добавлением буфера для образца LDS и подвергали SDS-PAGE с последующим окрашиванием белком InstantBlue Coomassie.
E3-независимое моноубиквитилирование SPRTN
Моноубиквитилирование белков, несущих ubiquitin-связывающие домены, часто наблюдается и, как предполагается, происходит E3-независимым образом (26-28).Таким образом, мы протестировали набор человеческих рекомбинантных убиквитин-конъюгированных ферментов (E2s) на их способность убиквитилировать каталитически неактивный SPRTN in vitro . Поразительно, что десять из двадцати девяти E2s индуцируют моноубиквитилирование SPRTN в отсутствие убиквитинлигазы E3 (рисунок 1E и дополнительный рисунок S1B). In vitro убиквитилирование E2 UBE2D3 даже запускает мульти-моноубиквитилирование SPRTN, на что указывают многочисленные модификации с вариантом убиквитина, не содержащим лизинов, и с биотинилированным N-концом (дополнительный рисунок S1C).Примечательно, что вариант SPRTN с измененным доменом UBZ (UBZ *, D473A) подвергается модификации in vitro , но его модификация чувствительна к добавлению неспецифической активности деубиквитилирования (каталитический домен USP2) (рис. 1F). Это может указывать на то, что варианты SPRTN-UBZ * лишены моноубиквитилирования в клетках, потому что функциональный домен UBZ важен для защиты модификации от клеточных активностей DUB. Тот факт, что моноубиквитилирование SPRTN происходит E3-независимым образом (хотя нельзя исключить участие лигаз E3 в клетках) и высокий уровень модификации в базовых условиях свидетельствует о том, что генерация убиквитилированного SPRTN (SPRTN-Ub) является конститутивным процесс.В свою очередь, это означает, что клеточный контроль модификации д. Происходить посредством деубиквитилирования.
Экран
in vitro показывает, что USP7 нацелен на убиквитилированный SPRTN
Чтобы идентифицировать DUB, ответственный за deubiquitylating SPRTN, мы разработали in vitro экран (рис. 2A). Мы субклонировали матричную библиотеку кДНК, содержащую последовательности семидесяти одного человеческого DUB, в бактериальные экспрессионные плазмиды. После экспрессии в E. coli лизаты были приготовлены и объединены в двадцать четыре набора по три.Активность деубиквитилирования оценивали путем инкубации каждого пула с частично моноубиквитилированным SPRTN-EQ, очищенным из клеток человека. Добавление пяти из двадцати четырех пулов запускало деубиквитилирование SPRTN (дополнительная фигура S2A). Каждый положительный пул содержал один лизат, способный деубиквитилировать SPRTN (рис. 2B). Соответствующие плазмиды повторно выделяли и определяли, что они кодируют четыре различных DUB: USP4, USP7, USP15 и USP42. Все четыре кандидата были повторно экспрессированы, частично очищены и успешно повторно протестированы на их способность деубиквитилировать SPRTN (дополнительный рисунок S2B-C).Чтобы проверить, обладают ли эти DUB способностью действовать на SPRTN-Ub в клетках, мы отслеживали моноубиквитилирование SPRTN в клетках при сверхэкспрессии соответствующих кандидатов. Сверхэкспрессия USP7, но не других кандидатов, приводит к потере эндогенного и экзогенно экспрессируемого SPRTN-Ub и одновременному увеличению немодифицированного SPRTN (Рисунок 3A-B). Следует отметить, что может ли USP42 деубиквитилировать SPRTN в клетках, остается неясным, учитывая, что он не экспрессируется на значительных уровнях. Важно отметить, что сверхэкспрессия каталитически неактивного варианта DUB (USP7 ^CS, C223S) не запускает деубиквитилирование (рис. 3C-D).Соответственно, USP7 связывается с SPRTN в экспериментах по коиммунопреципитации (рис. 3E). Примечательно, что каталитически неактивный USP7 (USP7 ^CS) предпочтительно связывается с убиквитилированным SPRTN. Интересно, что моноубиквитилированные виды SPRTN-UBZ * и SPRTN-ΔC коиммунопреципитата с USP7 ^CS, хотя эта модификация не обнаруживается во входных образцах (рис. 3E). Это наблюдение согласуется с нашим выводом о том, что SPRTN-UBZ * может быть моноубиквитилирован in vitro , но тогда не удается защитить модификацию (Рис. 1F).USP7 несет N-концевой домен TRAF, который предшествует каталитическому домену (CD) и пяти С-концевым убиквитин-подобным доменам (UBL). Удаление CD или UBL отменяет преимущественное связывание USP7 с SPRTN-Ub, указывая на то, что эти домены важны для обеспечения специфичности для модифицированного SPRTN, но не существенны для взаимодействия как такового (рис. 3F). Вариант USP7, лишенный домена TRAF (USP7-ΔTRAF), не имеет связывания SPRTN. Однако интерпретация этого результата осложняется тем фактом, что это усечение выражено на низких уровнях, что может указывать на более общие дефекты (рис. 3F).Мы пришли к выводу, что USP7 специфически взаимодействует с SPRTN-Ub и обладает способностью деубиквитилировать протеазу in vitro и в клетках.
Рисунок 2.
Экран in vitro идентифицирует DUB, нацеленные на убиквитилированный SPRTN. ( A ) Схематическое изображение стратегии скрининга, использованной для тестирования семидесяти одного человеческого деубиквитилирующего фермента (DUB) на их способность деубиквитилировать SPRTN. ( B ) Деконволюция положительных пулов, идентифицированных на дополнительном рисунке S2A, выявляет четыре кандидата DUB.Лизаты, приготовленные из пятнадцати клонов, присутствующих в пяти положительных пулах, инкубировали в течение 30 минут при 25 ° C вместе с очищенным частично моноубиквитилированным YFP-SPRTN-EQ-Strep. Реакции останавливали добавлением буфера для образцов LDS и анализировали с помощью SDS-PAGE и вестерн-блоттинга с использованием антител против Strep. Лизаты клеток BL21 служили отрицательным контролем, неспецифическая деубиквитилирующая активность каталитического домена USP2 (USP2 ^cd) — положительным контролем.
Рисунок 2.
Экран in vitro идентифицирует DUB, нацеленные на убиквитилированный SPRTN.( A ) Схематическое изображение стратегии скрининга, использованной для тестирования семидесяти одного человеческого деубиквитилирующего фермента (DUB) на их способность деубиквитилировать SPRTN. ( B ) Деконволюция положительных пулов, идентифицированных на дополнительном рисунке S2A, выявляет четыре кандидата DUB. Лизаты, приготовленные из пятнадцати клонов, присутствующих в пяти положительных пулах, инкубировали в течение 30 минут при 25 ° C вместе с очищенным частично моноубиквитилированным YFP-SPRTN-EQ-Strep. Реакции останавливали добавлением буфера для образцов LDS и анализировали с помощью SDS-PAGE и вестерн-блоттинга с использованием антител против Strep.Лизаты клеток BL21 служили отрицательным контролем, неспецифическая деубиквитилирующая активность каталитического домена USP2 (USP2 ^cd) — положительным контролем.
Рисунок 3.
USP7 взаимодействует с убиквитилированным SPRTN в клетках человека и нацеливается на него. ( A ) Анализ индуцированного сверхэкспрессией DUB деубиквитилирования эндогенного SPRTN в клетках HeLa T-REx Flp-In. Указанные DUB, меченные флагом на N-конце, временно экспрессировали в течение одного дня перед тем, как клетки лизировали и анализировали вестерн-блоттингом.( B ) Анализ индуцированного сверхэкспрессией DUB деубиквитилирования индуцируемого доксициклином YFP-SPRTN-Strep, стабильно экспрессируемого в клетках HeLa T-REx Flp-In. Указанные DUB, меченные флагом на N-конце, временно экспрессировали в течение одного дня перед тем, как клетки лизировали и анализировали вестерн-блоттингом. ( C ) Возрастающие количества USP7, меченного на N-конце Flag (или каталитически неактивного варианта CS), временно экспрессировались в клетках HeLa T-REx Flp-In в течение одного дня перед тем, как клетки лизировали и анализировали вестерн-блоттингом.( D ) Возрастающие количества USP7, меченного N-концом Flag (или каталитически неактивного варианта CS), временно экспрессировались в клетках HeLa T-REx Flp-In, стабильно экспрессирующих индуцируемую доксициклином YFP-SPRTN-Strep за один день до клеток. лизировали и анализировали вестерн-блоттингом. ( E ) Плазмиды, кодирующие Flag-tagged полноразмерный USP7 (WT или каталитически неактивный вариант CS), временно трансфицировали в клетки HeLa T-REx Flp-In, стабильно экспрессирующие указанные индуцируемые доксициклином варианты YFP-SPRTN-Strep.Связывание анализировали совместной иммунопреципитацией с использованием анти-Flag гранул с последующим вестерн-блоттингом. ( F ) Схематическое изображение доменной структуры USP7 и усечений белка, используемых для анализа коиммунопреципитации с SPRTN (верхняя панель). Плазмиды, кодирующие Flag-tagged полноразмерный USP7 (WT или каталитически неактивный вариант CS) или соответствующие усечения, временно трансфицировали в клетки HeLa T-REx Flp-In, стабильно экспрессирующие индуцируемый доксициклином YFP-SPRTN-Strep. Связывание анализировали совместной иммунопреципитацией с использованием гранул анти-Flag с последующим вестерн-блоттингом (нижняя панель).
Рисунок 3.
USP7 взаимодействует с убиквитилированным SPRTN в человеческих клетках и нацеливается на него. ( A ) Анализ индуцированного сверхэкспрессией DUB деубиквитилирования эндогенного SPRTN в клетках HeLa T-REx Flp-In. Указанные DUB, меченные флагом на N-конце, временно экспрессировали в течение одного дня перед тем, как клетки лизировали и анализировали вестерн-блоттингом. ( B ) Анализ индуцированного сверхэкспрессией DUB деубиквитилирования индуцируемого доксициклином YFP-SPRTN-Strep, стабильно экспрессируемого в клетках HeLa T-REx Flp-In.Указанные DUB, меченные флагом на N-конце, временно экспрессировали в течение одного дня перед тем, как клетки лизировали и анализировали вестерн-блоттингом. ( C ) Возрастающие количества USP7, меченного на N-конце Flag (или каталитически неактивного варианта CS), временно экспрессировались в клетках HeLa T-REx Flp-In в течение одного дня перед тем, как клетки лизировали и анализировали вестерн-блоттингом. ( D ) Возрастающие количества USP7, меченного N-концом Flag (или каталитически неактивного варианта CS), временно экспрессировались в клетках HeLa T-REx Flp-In, стабильно экспрессирующих индуцируемую доксициклином YFP-SPRTN-Strep за один день до клеток. лизировали и анализировали вестерн-блоттингом.( E ) Плазмиды, кодирующие Flag-tagged полноразмерный USP7 (WT или каталитически неактивный вариант CS), временно трансфицировали в клетки HeLa T-REx Flp-In, стабильно экспрессирующие указанные индуцируемые доксициклином варианты YFP-SPRTN-Strep. Связывание анализировали совместной иммунопреципитацией с использованием анти-Flag гранул с последующим вестерн-блоттингом. ( F ) Схематическое изображение доменной структуры USP7 и усечений белка, используемых для анализа коиммунопреципитации с SPRTN (верхняя панель).Плазмиды, кодирующие Flag-tagged полноразмерный USP7 (WT или каталитически неактивный вариант CS) или соответствующие усечения, временно трансфицировали в клетки HeLa T-REx Flp-In, стабильно экспрессирующие индуцируемый доксициклином YFP-SPRTN-Strep. Связывание анализировали совместной иммунопреципитацией с использованием гранул анти-Flag с последующим вестерн-блоттингом (нижняя панель).
USP7 деубиквитилирует SPRTN после индукции DPC
Затем мы проверили, является ли USP7 DUB, ответственным за регулирование доступа к хроматину SPRTN посредством деубиквитилирования при индукции DPC.Таким образом, мы обрабатывали нокаутные (KO) клетки HCT116 WT и USP7 в течение 2 ч формальдегидом перед оценкой набора SPRTN фракционированием хроматина. Действительно, эндогенный SPRTN не может быть деубиквитилирован в отсутствие USP7 при воздействии формальдегида (рис. 4A). Неожиданно, однако, отсутствие деубиквитилирования не приводит к нарушению рекрутирования. В клетках USP7 KO на хроматине также обнаружен SPRTN-Ub. Эти результаты показывают, что деубиквитилирование происходит ниже по течению или параллельно с рекрутированием и не предшествует перемещению SPRTN в хроматин.Чтобы понять вклад USP7-опосредованного деубиквитилирования в репарацию DPC, мы создали клетки DLD1 и HAP1 USP7 KO, потому что чувствительность KO-клеток HCT116 USP7 трудно оценить из-за их сильного дефекта роста. Клетки HAP1 и DLD1 USP7 KO демонстрируют дефектное деубиквитилирование SPRTN и гиперчувствительность к воздействию формальдегида (рис. 4B – E). Важно отметить, что чувствительность к формальдегиду клеток DLD1 USP7 KO дополняется временной трансфекцией USP7 ^WT, но не USP7 ^CS (рисунок 4F и дополнительный рисунок S3A).Кроме того, клетки HAP1 USP7 KO накапливают более высокие уровни DPC после 2-часового воздействия формальдегида, как определено с помощью анализов осаждения KCl-SDS (рис. 4G).
Рисунок 4.
USP7 деубиквитилирует SPRTN после индукции DPC. ( A ) Нокаут-клетки HCT116 WT или USP7 (KO) обрабатывали 2 мМ формальдегидом (FA) в течение 2 часов. Клетки либо лизировали непосредственно в буфере для образцов LDS (общий), либо подвергали фракционированию хроматина.Затем образцы анализировали с помощью SDS-PAGE с последующим вестерн-блоттингом. Звездочки указывают полосу перекрестной реактивности. ( B ) Клональные клетки DLD1 USP7 KO и соответствующие контрольные клетки WT обрабатывали 2 мМ формальдегидом (FA) в течение 3 часов. Клетки либо лизировали непосредственно в буфере для образцов LDS (общий), либо подвергали фракционированию хроматина. Затем образцы анализировали с помощью SDS-PAGE с последующим вестерн-блоттингом. Звездочки указывают полосу перекрестной реактивности. ( C ) Клональные клетки HAP1 USP7 KO и соответствующие контрольные клетки WT обрабатывали 2 мМ формальдегидом (FA) в течение 2 часов.Клетки либо лизировали непосредственно в буфере для образцов LDS (общий), либо подвергали фракционированию хроматина. Затем образцы анализировали с помощью SDS-PAGE с последующим вестерн-блоттингом. Звездочки указывают полосу перекрестной реактивности. ( D ) Клональные клетки DLD1 USP7 KO и соответствующие контрольные клетки WT обрабатывали указанными концентрациями формальдегида в течение 2 часов. Через 48 ч жизнеспособность клеток определяли с помощью анализа жизнеспособности клеток alamarBlue. Значения представляют собой среднее ± стандартное отклонение трех технических повторов, нормализованных к среднему значению для необработанных контролей каждой клеточной линии ( E ). Клональные клетки HAP1 USP7 KO и соответствующие контрольные клетки WT обрабатывали указанными концентрациями формальдегида в течение 72 часов.Затем определяли жизнеспособность клеток с помощью анализа жизнеспособности клеток alamarBlue. Значения представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение трех технических повторов, нормализованное к среднему значению необработанных контролей каждой клеточной линии. ( F ) YFP-тегированный полноразмерный USP7 (WT или каталитически неактивный вариант CS) или пустой вектор временно трансфицировали в клетки DLD1 USP7 KO и соответствовали контрольным клеткам WT. Клетки обрабатывали 1 мМ формальдегидом в течение 2 часов. Через 48 ч жизнеспособность клеток определяли с помощью анализа жизнеспособности клеток alamarBlue.Значения представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего для четырех независимых биологических повторов, нормализованные к среднему значению для необработанных контролей каждой клеточной линии. Достоверность определялась с использованием парного теста t (* P -значение <0,05). ( G ) Клеточные DPC количественно определяли в клональных клетках HAP1 USP7 KO и соответствующих контрольных клетках WT, обработанных 75 мкМ формальдегида в течение 2 часов, используя анализ преципитации KCl / SDS. DPC измеряли как отношение сшитой ДНК к общей ДНК.Значения представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение трех технических повторов.
Рисунок 4.
USP7 деубиквитилирует SPRTN после индукции DPC. ( A ) Нокаут-клетки HCT116 WT или USP7 (KO) обрабатывали 2 мМ формальдегидом (FA) в течение 2 часов. Клетки либо лизировали непосредственно в буфере для образцов LDS (общий), либо подвергали фракционированию хроматина. Затем образцы анализировали с помощью SDS-PAGE с последующим вестерн-блоттингом. Звездочки указывают полосу перекрестной реактивности. ( B ) Клональные клетки DLD1 USP7 KO и соответствующие контрольные клетки WT обрабатывали 2 мМ формальдегидом (FA) в течение 3 часов.Клетки либо лизировали непосредственно в буфере для образцов LDS (общий), либо подвергали фракционированию хроматина. Затем образцы анализировали с помощью SDS-PAGE с последующим вестерн-блоттингом. Звездочки указывают полосу перекрестной реактивности. ( C ) Клональные клетки HAP1 USP7 KO и соответствующие контрольные клетки WT обрабатывали 2 мМ формальдегидом (FA) в течение 2 часов. Клетки либо лизировали непосредственно в буфере для образцов LDS (общий), либо подвергали фракционированию хроматина. Затем образцы анализировали с помощью SDS-PAGE с последующим вестерн-блоттингом.Звездочки указывают полосу перекрестной реактивности. ( D ) Клональные клетки DLD1 USP7 KO и соответствующие контрольные клетки WT обрабатывали указанными концентрациями формальдегида в течение 2 часов. Через 48 ч жизнеспособность клеток определяли с помощью анализа жизнеспособности клеток alamarBlue. Значения представляют собой среднее ± стандартное отклонение трех технических повторов, нормализованных к среднему значению для необработанных контролей каждой клеточной линии ( E ). Клональные клетки HAP1 USP7 KO и соответствующие контрольные клетки WT обрабатывали указанными концентрациями формальдегида в течение 72 часов.Затем определяли жизнеспособность клеток с помощью анализа жизнеспособности клеток alamarBlue. Значения представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение трех технических повторов, нормализованное к среднему значению необработанных контролей каждой клеточной линии. ( F ) YFP-тегированный полноразмерный USP7 (WT или каталитически неактивный вариант CS) или пустой вектор временно трансфицировали в клетки DLD1 USP7 KO и соответствовали контрольным клеткам WT. Клетки обрабатывали 1 мМ формальдегидом в течение 2 часов. Через 48 ч жизнеспособность клеток определяли с помощью анализа жизнеспособности клеток alamarBlue.Значения представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего для четырех независимых биологических повторов, нормализованные к среднему значению для необработанных контролей каждой клеточной линии. Достоверность определялась с использованием парного теста t (* P -значение <0,05). ( G ) Клеточные DPC количественно определяли в клональных клетках HAP1 USP7 KO и соответствующих контрольных клетках WT, обработанных 75 мкМ формальдегида в течение 2 часов, используя анализ преципитации KCl / SDS. DPC измеряли как отношение сшитой ДНК к общей ДНК.Значения представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение трех технических повторов.
Следует отметить, что пока это исследование находилось на рассмотрении, было предложено, что SPRTN деубиквитилируется с помощью VCPIP1 (29). Кроме того, в недавнем препринте утверждается, что USP11 отвечает за деубиквитилирование SPRTN (30). Учитывая нашу идентификацию USP7, мы сравнили вклад всех трех ферментов в деубиквитилирование SPRTN. Ни VCPIP1, ни USP11 не индуцируют деубиквитилирование SPRTN при сверхэкспрессии, в отличие от USP7 (дополнительный рисунок S3B).VCPIP1 и USP11 слабо взаимодействуют с SPRTN в экспериментах по коиммунопреципитации, но показывают отсутствие (VCPIP1) или слабое (USP11) предпочтение SPRTN-Ub (дополнительный рисунок S3B). Опосредованное siRNA истощение VCPIP1 или USP11 не влияет на деубиквитилирование SPRTN в клетках DLD1, в то время как истощение USP7 влияет (дополнительный рисунок S3C). Кроме того, мы получили клетки HAP1 USP11 и VCPIP1 KO, которые проявляют чувствительность к формальдегиду, но не имеют дефектов в деубиквитилировании SPRTN (дополнительный рисунок S3D-E).
В заключение, в условиях, протестированных здесь, USP7, но не VCPIP1 или USP11, играет заметную роль в деубиквитилировании SPRTN в клетках. Наконец, чувствительность к формальдегиду и накопление DPC, наблюдаемые в клетках USP7 KO, свидетельствуют о том, что деубиквитилирование, хотя и не участвует в привлечении хроматина SPRTN, должно иметь важную функцию в репарации DPC. Поэтому мы дополнительно исследовали эффекты моноубиквитирования на протеазу SPRTN.
Моноубиквитилирование способствует деградации и авторасщеплению SPRTN
Моноубиквитилирование может приводить к протеасомной деградации за счет прайминга полиубиквитилирования (31,32).Таким образом, мы оценили, дестабилизирует ли моноубиквитилирование SPRTN, используя эксперименты с циклогексимид-чейзом. Действительно, эндогенный SPRTN-Ub имеет более короткий период полужизни, чем неубиквитилированный SPRTN, при этом деградация блокируется ингибированием протеасом (фигура 5A и дополнительная фигура S4A). На деградацию не влияет потеря USP7, что указывает на то, что деубиквитилирование не участвует в стабильности белка SPRTN в базовых условиях (дополнительный рисунок S4A). Ингибирование протеасомы приводит к накоплению полиубиквитилированных видов SPRTN, которые сильно уменьшаются в варианте SPRTN-UBZ *, что обеспечивает дополнительную поддержку моноубиквитилированию, индуцирующему деградацию, путем прайминга полиубиквитилирования (Рисунок 5B и дополнительный рисунок S4B).Кроме того, линейное слияние SPRTN с убиквитином (SPRTN-Ub ^LF, без двух C-концевых глицинов), которое, как предполагалось ранее, имитирует моноубиквитилирование, дестабилизирует весь пул SPRTN (рис. 5C) (21).
Рисунок 5.
Моноубиквитилирование способствует деградации и авторасщеплению SPRTN. ( A ) Стабильность эндогенного SPRTN определяли в эксперименте с циклогексимидом на клетках HeLa-T-REx Flp-In. Клетки инкубировали с циклогексимидом в течение указанного периода времени (с или без 2-часовой предварительной обработки ингибитором протеасом MG132) перед лизисом клеток и анализом вестерн-блоттингом.( B ) Полиубиквитилирование стабильно экспрессируемого доксициклин-индуцируемого YFP-SPRTN-Strep или YFP-SPRTN-UBZ * -Strep определяли в клетках HeLa-T-REx Flp-In после обработки ингибитором протеасом MG132 для указанного количества время до лизиса клеток и анализа вестерн-блоттингом. ( C ) Стабильность стабильно экспрессируемого индуцируемого доксициклином YFP-SPRTN-Strep или линейного слияния SPRTN-убиквитин (YFP-SPRTN-Ub ^LF) определяли в клетках HeLa-T-REx Flp-In с использованием циклогексимид- погоня за экспериментом.Клетки инкубировали в присутствии циклогексимида в течение указанного периода времени (с или без 2-часовой предварительной обработки ингибитором протеасом MG132) перед лизисом клеток и анализом вестерн-блоттингом. ( D ) Указанные варианты YFP-SPRTN-Strep или линейного слияния SPRTN-убиквитина (YFP-SPRTN-Ub ^LF) временно трансфицировали в клетки HeLa-T-REx Flp-In. Фрагменты авторасщепления SPRTN обогащали смолами для ловушек GFP с последующим вестерн-блоттингом против N-концевой YFP-метки.Вестерн-блоттинг клеточных лизатов против GAPDH служит в качестве контроля загрузки. Звездочками обозначены фрагменты автодробления. ( E ) Указанные варианты YFP-SPRTN-Strep были временно трансфицированы в клетки HeLa-T-REx Flp-In в комбинации с меченным флагом полноразмерным USP7 (WT или каталитически неактивный вариант CS) или пустым вектором. Фрагменты авторасщепления SPRTN обогащали смолами для ловушек GFP с последующим вестерн-блоттингом против N-концевой YFP-метки. Вестерн-блоттинг против GAPDH клеточных лизатов служит в качестве контроля загрузки.Звездочками обозначены фрагменты автодробления. ( F ) Клетки HAP1 обрабатывали увеличивающимся количеством формальдегида (FA, 0,25, 0,5, 1 и 2 мМ) в течение 2 часов (с или без 2-часовой предварительной обработки ингибитором убиквитин-активирующего фермента E1, как указано. ) перед лизисом клеток и анализом вестерн-блоттингом. Звездочками обозначены фрагменты автодробления. ( G ) Клетки HeLa-T-REx Flp-In обрабатывали ингибитором протеасом MG132 в течение указанного периода времени перед лизисом клеток и анализом вестерн-блоттингом.Звездочками обозначены фрагменты автодробления.
Рисунок 5.
Моноубиквитилирование способствует деградации и авторасщеплению SPRTN. ( A ) Стабильность эндогенного SPRTN определяли в эксперименте с циклогексимидом на клетках HeLa-T-REx Flp-In. Клетки инкубировали с циклогексимидом в течение указанного периода времени (с или без 2-часовой предварительной обработки ингибитором протеасом MG132) перед лизисом клеток и анализом вестерн-блоттингом. ( B ) Полиубиквитилирование стабильно экспрессируемого доксициклин-индуцируемого YFP-SPRTN-Strep или YFP-SPRTN-UBZ * -Strep определяли в клетках HeLa-T-REx Flp-In после обработки ингибитором протеасом MG132 для указанного количества время до лизиса клеток и анализа вестерн-блоттингом.( C ) Стабильность стабильно экспрессируемого индуцируемого доксициклином YFP-SPRTN-Strep или линейного слияния SPRTN-убиквитин (YFP-SPRTN-Ub ^LF) определяли в клетках HeLa-T-REx Flp-In с использованием циклогексимид- погоня за экспериментом. Клетки инкубировали в присутствии циклогексимида в течение указанного периода времени (с или без 2-часовой предварительной обработки ингибитором протеасом MG132) перед лизисом клеток и анализом вестерн-блоттингом. ( D ) Указанные варианты YFP-SPRTN-Strep или линейного слияния SPRTN-убиквитина (YFP-SPRTN-Ub ^LF) временно трансфицировали в клетки HeLa-T-REx Flp-In.Фрагменты авторасщепления SPRTN обогащали смолами для ловушек GFP с последующим вестерн-блоттингом против N-концевой YFP-метки. Вестерн-блоттинг клеточных лизатов против GAPDH служит в качестве контроля загрузки. Звездочками обозначены фрагменты автодробления. ( E ) Указанные варианты YFP-SPRTN-Strep были временно трансфицированы в клетки HeLa-T-REx Flp-In в комбинации с меченным флагом полноразмерным USP7 (WT или каталитически неактивный вариант CS) или пустым вектором. Фрагменты авторасщепления SPRTN обогащали смолами для ловушек GFP с последующим вестерн-блоттингом против N-концевой YFP-метки.Вестерн-блоттинг против GAPDH клеточных лизатов служит в качестве контроля загрузки. Звездочками обозначены фрагменты автодробления. ( F ) Клетки HAP1 обрабатывали увеличивающимся количеством формальдегида (FA, 0,25, 0,5, 1 и 2 мМ) в течение 2 часов (с или без 2-часовой предварительной обработки ингибитором убиквитин-активирующего фермента E1, как указано. ) перед лизисом клеток и анализом вестерн-блоттингом. Звездочками обозначены фрагменты автодробления. ( G ) Клетки HeLa-T-REx Flp-In обрабатывали ингибитором протеасом MG132 в течение указанного периода времени перед лизисом клеток и анализом вестерн-блоттингом.Звездочками обозначены фрагменты автодробления.
При проведении этих экспериментов мы отметили, что клетки, экспрессирующие SPRTN-Ub ^LF, отображают различные фрагменты белка, которые распознаются антителом, специфичным для N-концевой YFP-метки (рис. 5D). Эти фрагменты становятся еще более очевидными при обогащении смолами-ловушками GFP и соответствуют ранее описанным автокаталитическим фрагментам, наблюдаемым в клетках, которые экспрессируют WT SPRTN, но отсутствуют в клетках, экспрессирующих каталитически неактивный SPRTN-EQ (рис. 5D) (8,9).Эти результаты повышают вероятность того, что моноубиквитилирование SPRTN запускает усиленное авторасщепление фермента. В соответствии с этим, автоматическое расщепление неубиквитилированного варианта SPRTN-UBZ * практически невозможно обнаружить, если только он не слился линейно с убиквитином (SPRTN-UBZ * -Ub ^LF) (рис. 5D). Кроме того, деубиквитилирование SPRTN, индуцированное сверхэкспрессией USP7 ^WT, но не каталитически неактивного USP7 ^CS, приводит к снижению образования автокаталитических фрагментов SPRTN (фиг. 5E).Авторасщепление эндогенного SPRTN индуцируется воздействием формальдегида и более заметно при более низких концентрациях, в то время как деубиквитилирование наблюдается при более высоких концентрациях (рис. 5F) (8). Примечательно, что если моноубиквитилирование эндогенного SPRTN блокируется предварительной обработкой клеток ингибитором убиквитина E1, авторасщепление сильно снижается (рис. 5F). Интересно, что авторасщепление эндогенного SPRTN также увеличивается в клетках, которые были обработаны ингибиторами протеасом (рисунок 5G и дополнительный рисунок S4C и D).Это наблюдение обеспечивает поддержку модели, в которой моноубиквитилированный SPRTN либо разрушается протеасомой, либо подвергается авторасщеплению. В согласии с этим, короткий период полужизни SPRTN-Ub не зависит от каталитической активности фермента, и усечение SPRTN (SPRTN ^aa1-227), соответствующее самому короткому фрагменту, подвергнутому автоотщеплению, не является особенно нестабильным (дополнительный рисунок S4E-F). Взятые вместе, протеасомная деградация и аутодеклавация, по-видимому, являются независимыми исходами, индуцированными моноубиквитилированием.
Затем мы проверили, является ли усиление авторасщепления SPRTN моноубиквитилированием прямым влиянием на активность фермента. С этой целью мы произвели рекомбинантный SPRTN-Ub ^LF и сравнили его активность в отношении авторасщепления и расщепления субстрата с WT SPRTN. Действительно, SPRTN-Ub ^LF демонстрирует заметно увеличенное ДНК-зависимое автокаталитическое расщепление in vitro (фиг. 6A). Эффект особенно силен в присутствии дцДНК и в условиях с высоким содержанием соли.Напротив, расщепление гистона h2 или расщепление модельных субстратов DPC (флуоресцентно-меченные конъюгаты G-олигонуклеотид) существенно не увеличивается (фиг. 6A и B). Авторасщепление SPRTN происходит в транс-, причем одна молекула SPRTN расщепляет вторую (8,9). Каталитически неактивный вариант SPRTN-EQ с меткой Flag расщепляется более эффективно SPRTN-Ub ^LF, чем SPRTN WT. Это говорит о том, что модификации молекулы SPRTN, расщепляющей транс-, достаточно для усиления авторасщепления (рис. 6C).Эти данные in vitro демонстрируют, что усиленное авторасщепление SPRTN-Ub в клетках вызвано прямым влиянием модификации на активность SPRTN. Таким образом, мы пришли к выводу, что моноубиквитилирование отрицательно контролирует пул SPRTN не только за счет индукции протеасомной деградации в цис-, но также за счет запуска инактивации других молекул SPRTN через при авторасщеплении транс-.
Рисунок 6.
Моноубиквитилирование способствует авторасщеплению SPRTN в транс-.( A ) Рекомбинантный SPRTN или линейный гибрид SPRTN-убиквитин (SPRTN-Ub ^LF) (500 нМ) инкубировали только с гистоном h2 или в присутствии одно- (ss) вириона или двухцепочечного (ds ДНК RFI ФX174 (11,1 нМ) в течение 60 мин при 25 ° C. Концентрации соли были такими, как указано. Реакции анализировали с помощью SDS-PAGE с последующим вестерн-блоттингом и окрашиванием белком InstantBlue Coomassie. Количественная оценка результатов вестерн-блоттинга SPRTN и расщепления гистона h2: значения представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение четырех независимых экспериментов.( B ) Указанные конъюгаты модельного белка G-олигонуклеотида (25 нМ) инкубировали отдельно или в присутствии рекомбинантного SPRTN (6,25 нМ, WT или линейного слияния SPRTN-убиквитина (SPRTN-Ub ^LF)) в течение 2 ч при 25 ° C перед разделением на нативном PAGE. Правая панель, количественная оценка расщепления DPC: значения представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение трех независимых экспериментов. ( C ) Рекомбинантный каталитически неактивный Flag-SPRTN-EQ (500 нМ) инкубировали отдельно или в комбинации с активным SPRTN (500 нМ, WT или линейное слияние SPRTN-убиквитин (SPRTN-Ub ^LF)) в присутствии ДНК (ФX174 RFI дцДНК, 11.1 нМ) в течение 60 мин при 25 ° C. Концентрации соли были такими, как указано. Реакции подвергали SDS-PAGE с последующим окрашиванием белком InstantBlue Coomassie и вестерн-блоттингом.
Рис. 6.
Моноубиквитилирование способствует авторасщеплению SPRTN в транс-. ( A ) Рекомбинантный SPRTN или линейный гибрид SPRTN-убиквитин (SPRTN-Ub ^LF) (500 нМ) инкубировали только с гистоном h2 или в присутствии одно- (ss) вириона или двухцепочечного (ds ) RFI ФX174 ДНК (11.1 нМ) в течение 60 мин при 25 ° C. Концентрации соли были такими, как указано. Реакции анализировали с помощью SDS-PAGE с последующим вестерн-блоттингом и окрашиванием белком InstantBlue Coomassie. Количественная оценка результатов вестерн-блоттинга SPRTN и расщепления гистона h2: значения представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение четырех независимых экспериментов. ( B ) Указанные конъюгаты модельного белка G-олигонуклеотида (25 нМ) инкубировали отдельно или в присутствии рекомбинантного SPRTN (6,25 нМ, WT или линейного слияния SPRTN-убиквитина (SPRTN-Ub ^LF)) в течение 2 ч при 25 ° C перед разделением на нативном PAGE.Правая панель, количественная оценка расщепления DPC: значения представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение трех независимых экспериментов. ( C ) Рекомбинантный каталитически неактивный Flag-SPRTN-EQ (500 нМ) инкубировали отдельно или в комбинации с активным SPRTN (500 нМ, WT или линейное слияние SPRTN-убиквитин (SPRTN-Ub ^LF)) в присутствии ДНК (ФX174 RFI дцДНК, 11,1 нМ) в течение 60 мин при 25 ° C. Концентрации соли были такими, как указано. Реакции подвергали SDS-PAGE с последующим окрашиванием белком InstantBlue Coomassie и вестерн-блоттингом.
ОБСУЖДЕНИЕ
Выявленный здесь регуляторный переключатель убиквитина отличается от других известных типов событий моноубиквитилирования, происходящих во время поддержания генома. FANCD2 и FANCI убиквитилируются центральным комплексом анемии Фанкони сайт-специфическим образом при рекрутировании на хроматин во время репарации межцепочечных сшивок (33). PCNA сайт-специфически моноубиквитилирован в ответ на остановленный синтез ДНК, что способствует привлечению полимераз для синтеза трансфузии (34–37).Напротив, моноубиквитилирование SPRTN не запускается индукцией DPC, а вместо этого, по-видимому, является конститутивным процессом. Наши данные демонстрируют, что модификация может иметь два различных результата, оба из которых приводят к инактивации фермента (рис. 7). Во-первых, моноубиквитилирование запускает SPRTN в цис- для протеасомной деградации за счет стимулирования полиубиквитилирования. Во-вторых, он дополнительно снижает количество активного SPRTN, способствуя авторасщеплению транс-. Важно отметить, что для авторасщепления SPRTN необходимо присутствие ДНК in vitro , из чего следует, что запускаемое моноубиквитилированием автодробление в клетках специфически влияет на ДНК-связанные молекулы SPRTN.Если клетки сталкиваются с индукцией DPC, опосредованное USP7 деубиквитилирование, по-видимому, важно для остановки этой негативной регуляции с целью продления периода полужизни активного ДНК-связанного SPRTN. Воздействие формальдегида запускает широко распространенные события убиквитилирования в клетках (38). Таким образом, привлекательно предположить, что в присутствии DPC домен UBZ SPRTN взаимодействует со специфическими сигналами убиквитилирования. В свою очередь, это раскрыло бы моноубиквитилирование и, таким образом, позволило бы USP7 удалить модификацию. Хотя описанная здесь регуляция важна для контроля уровней белка SPRTN, она не участвует в привлечении SPRTN к хроматину.Это открытие дополнительно подтверждается тем фактом, что вариант синдрома RJALS SPRTN-ΔC сохраняет большую степень функции, несмотря на отсутствие UBZ и отсутствие моноубиквитилирования. В этом контексте будет интересно исследовать, вызваны ли фенотипы, наблюдаемые при RJALS, по крайней мере частично, потерей негативной регуляции SPRTN, а не только снижением способности репарации DPC. Примечательно, что рекрутирование SPRTN в УФ-индуцированные поражения (но не DPCs), как было показано, зависит от домена UBZ, потенциально указывая, что этот домен служит двойным целям (20–22).Однако то, как SPRTN рекрутируется в DPCs, остается спорным с доказательствами, указывающими на убиквитилирование или сигналы SUMOylation (39,40). Понимание того, как наличие поперечных связей передается ферментам репарации DPC, будет иметь решающее значение для принятия решения во время репарации DPC. Недавняя идентификация нескольких дополнительных протеаз, нацеленных на DPCs, подразумевает, что выбор пути репарации DPC является сложным клеточным процессом (13,39,41–45). В любом случае описанная здесь сложная негативная регуляция подчеркивает не только сложность репарации DPC, но и важность контроля потенциально токсичной протеолитической активности SPRTN.
Рисунок 7.
Регулирование SPRTN с помощью моноубиквитилирования и USP7. Предлагаемая модель регуляции SPRTN с помощью моноубиквитилирования и USP7-опосредованного деубиквитилирования. SPRTN подвергается конститутивному беспорядочному моноубиквитилированию своего C-концевого хвоста. Модификация защищена убиквитин-связывающим «цинковым пальцем» SPRTN (UBZ). Моноубиквитилирование влияет на SPRTN двояко. Он запускает SPRTN в цис- для протеасомной деградации, индуцируя полиубиквитилирование, а также запускает инактивацию, стимулируя авторасщепление других молекул SPRTN в транс-.USP7 снимает это ингибирование путем деубиквитилирования SPRTN после индукции перекрестных связей ДНК-белок (DPC).
Рисунок 7.
Регулирование SPRTN посредством моноубиквитилирования и USP7. Предлагаемая модель регуляции SPRTN с помощью моноубиквитилирования и USP7-опосредованного деубиквитилирования. SPRTN подвергается конститутивному беспорядочному моноубиквитилированию своего C-концевого хвоста. Модификация защищена убиквитин-связывающим «цинковым пальцем» SPRTN (UBZ). Моноубиквитилирование влияет на SPRTN двояко.Он запускает SPRTN в цис- для протеасомной деградации, индуцируя полиубиквитилирование, а также запускает инактивацию, стимулируя авторасщепление других молекул SPRTN в транс-. USP7 снимает это ингибирование путем деубиквитилирования SPRTN после индукции перекрестных связей ДНК-белок (DPC).
НАЛИЧИЕ ДАННЫХ
Данные доступны у соответствующего автора по разумному запросу.
ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ ДАННЫЕ
Дополнительные данные доступны в NAR Online.
БЛАГОДАРНОСТИ
Мы благодарим С. Панье, Г. Хьюитта и Р. Беллелли за обсуждения и комментарии к рукописи.
ФИНАНСИРОВАНИЕ
LMU — Программа стипендиального совета Китая [на S.Z.]; Фонд Питера и Траудла Энгельхорнов [Х.Л.]; Международная исследовательская школа Макса-Планка для молекулярных наук о жизни [в A.C.A., P.W.]; Европейский исследовательский совет [Стартовый грант ERC 801750 DNAProteinCrosslinks to J.S.]; Премия Альфрида Круппа для молодых преподавателей университетов, присужденная Альфредом Круппом фон Боленом и Halbach-Stiftung [J.С.]; Центр интегрированных белковых наук в Мюнхене (CIPSM) [Дж. С.]. Финансирование платы за открытый доступ: ERC [Стартовый грант 801750 DNAProteinCrosslinks].
Заявление о конфликте интересов . Ничего не объявлено.
ССЫЛКИ
1.
Накано
Т.
,
Миямото-Мацубара
М.
,
Шоулками
М.И.
,
Салем
A.M.
,
Pack
S.P.
,
Ishimi
Y.
,
Ide
H.
Транслокация и стабильность репликативных ДНК-геликаз при обнаружении перекрестных связей ДНК-белок
.
J. Biol. Chem.
2013
;
288
:
4649
—
4658
.2.
Nakano
T.
,
Ouchi
R.
,
Kawazoe
J.
,
Pack
S.P.
,
Makino
K.
,
Ide
РНК-полимеразы Т7, подкрепленные ковалентно захваченными белками, катализируют транскрипцию с высокой степенью подверженности ошибкам
.
J. Biol. Chem.
2012
;
287
:
6562
—
6572
.3.
Duxin
J.P.
,
Dewar
J.M.
,
Yardimci
H.
,
Walter
J.C.
Ремонт перекрестной сшивки ДНК-белок путем репликации
.
Ячейка
.
2014
;
159
:
346
—
357
.4.
Баркер
С.
,
Вайнфельд
М.
,
Мюррей
D.
ДНК-белковые сшивки: их индукция, репарация и биологические последствия
.
Mutat. Res.
2005
;
589
:
111
—
135
.5.
Stingele
J.
,
Bellelli
R.
,
Boulton
S.J.
Механизмы репарации ДНК-белковых сшивок
.
Nat. Rev. Mol. Cell Biol.
2017
;
18
:
563
—
573
.6.
Накано
T.
,
Xu
X.
,
Salem
A.M.H.
,
Шулками
М.И.
,
Ide
H.
Радиационно-индуцированные перекрестные связи ДНК-белок: механизмы и биологическое значение
.
Свободный Радич. Биол. Med.
2017
;
107
:
136
—
145
.7.
Stingele
J.
,
Schwarz
M.S.
,
Bloemeke
N.
,
Wolf
P.G.
,
Jentsch
S.
ДНК-зависимая протеаза, участвующая в репарации перекрестных связей ДНК-белок
.
Ячейка
.
2014
;
158
:
327
—
338
.8.
Stingele
J.
,
Bellelli
R.
,
Alte
F.
,
Hewitt
G.
,
Sarek
G.
,
S.
,
Цутакава
S.E.
,
Borg
A.
,
Kjaer
S.
,
Tainer
J.A.
et al. .
Механизм и регуляция репарации перекрестных связей ДНК-белок с помощью ДНК-зависимой металлопротеиназы SPRTN
.
Мол. Ячейка
.
2016
;
64
:
688
—
703
.9.
ВАЗ
Б.
,
Попович
М.
,
Ньюман
J.A.
,
Fielden
J.
,
Aitkenhead
H.
,
Halder
S.
,
Singh
A.N.
,
Vendrell
I.
,
Fischer
R.
,
Torrecilla
I.
et al. .
Металлопротеиназа SPRTN / DVC1 управляет репликационно-связанной репарацией перекрестных связей ДНК-белок
.
Мол. Ячейка
.
2016
;
64
:
704
—
719
.10.
Lopez-Mosqueda
J.
,
Maddi
K.
,
Prgomet
S.
,
Kalayil
S.
,
Marinovic-Terzic
I.
,
Дикич
I.
SPRTN представляет собой ДНК-связывающую металлопротеиназу млекопитающих, которая разрешает перекрестные связи ДНК-белок
.
Элиф
.
2016
;
5
:
e21491
.11.
Mórocz
M.
,
Zsigmond
E.
,
Tóth
R.
,
Enyedi
M.Z.
,
Pintér
L.
,
Haracska
L.
ДНК-зависимая протеазная активность человеческого Spartan облегчает репликацию ДНК
, содержащей сшивки ДНК.
Nucleic Acids Res.
2017
;
45
:
3172
—
3188
.12.
Reinking
H.K.
,
Hofmann
K.
,
Stingele
J.
Функция и эволюция протеаз, сшивающих ДНК-белок, Wss1 и SPRTN
.
Восстановление ДНК (Amst.)
.
2020
;
88
:
102822
—
102822
. 13.
Ларсен
N.B.
,
Гао
А.O.
,
Sparks
J.L.
,
Gallina
I.
,
Wu
R.A.
,
Mann
M.
,
Raschle
M.
,
Walter
JC
,
Duxin
JP
Репликационно-связанная репарация перекрестных связей ДНК-белок с помощью экстрактов SPRTN и протеина xenopus
.
Мол. Ячейка
.
2019
;
73
:
574
—
588
.14.
Sparks
J.L.
,
Chistol
G.
,
Gao
A.O.
,
Raschle
M.
,
Larsen
N.B.
,
Mann
M.
,
Duxin
J.P.
,
Walter
J.C.
Геликаза CMG обходит перекрестные связи ДНК-белок для облегчения их восстановления
.
Ячейка
.
2019
;
176
:
167
—
181
.15.
Maskey
R.S.
,
Ким
M.S.
,
Бейкер
D.J.
,
Childs
B.
,
Malureanu
L.A.
,
Jeganathan
K.B.
,
Machida
Y.
,
van Deursen
J.M.
,
Machida
Y.J.
Спартанский дефицит вызывает геномную нестабильность и прогероидные фенотипы
.
Nat. Commun.
2014
;
5
:
5744
.16.
Lessel
D.
,
Vaz
B.
,
Halder
S.
,
Lockhart
PJ
,
Marinovic-Terzic
I.
,
000 J. Lopez
,
Филипп
M.
,
Sim
JC
,
Smith
KR
,
Oehler
J.
et al. .
Мутации в SPRTN вызывают раннее начало гепатоцеллюлярной карциномы, геномную нестабильность и прогероидные особенности
.
Nat. Genet.
2014
;
46
:
1239
—
1244
. 17.
Ruijs
M.W.G.
,
van Andel
R.N.J.
,
Oshima
J.
,
Madan
K.
,
Nieuwint
A.W.M.
,
Aalfs
C.M.
Атипичный прогероидный синдром: неизвестный дефект гена геликазы
.
г. J. Med. Genet. А
.
2003
;
116A
:
295
—
299
.18.
Maskey
R.S.
,
Flatten
K.S.
,
Sieben
C.J.
,
Peterson
K.L.
,
Бейкер
D.J.
,
Nam
H.-J.
,
Ким
M.S.
,
Smyrk
T.C.
,
Кодзима
Y.
,
Machida
Y.
et al. .
Спартанская недостаточность вызывает накопление комплексов расщепления топоизомеразы 1 и туморогенез
.
Nucleic Acids Res.
2017
;
45
:
4564
—
4576
.19.
Reinking
H.K.
,
Канг
H.S.
,
Götz
M.J.
,
Li
H.Y.
,
Kieser
A.
,
Zhao
S.
,
Acampora
A.C.
,
Weickert
P.
,
Fessler
E.
,
L JT.
et al. .
Структурно-специфическое расщепление ДНК-белковых сшивок протеазой SPRTN
.
Мол. Ячейка
.
2020
;
80
:
102
—
113
.20.
Centore
R.C.
,
Yazinski
S.A.
,
Tse
A.
,
Zou
L.
Spartan / C1orf124, считыватель убиквитилирования PCNA и регулятор ответа на повреждение ДНК, индуцированного УФ-излучением
.
Мол. Ячейка
.
2012
;
46
:
625
—
635
. 21.
Mosbech
A.
,
Gibbs-Seymour
I.
,
Kagias
K.
,
Thorslund
T.
,
Beli
P.
,
Pov ,
Nielsen
SV
,
Smedegaard
S.
,
Sedgwick
G.
,
Lukas
C.
et al. .
DVC1 (C1orf124) представляет собой адаптер p97, нацеленный на повреждение ДНК, который способствует убиквитин-зависимым ответам на блоки репликации
.
Nat. Struct. Мол. Биол.
2012
;
19
:
1084
—
1092
.22.
Дэвис
E.J.
,
Lachaud
C.
,
Appleton
P.
,
Macartney
T.J.
,
Натке
I.
,
Rouse
J.
DVC1 (C1orf124) рекрутирует протеин-сегрегазу p97 на участки повреждения ДНК
.
Nat. Struct. Мол. Биол.
2012
;
19
:
1093
—
1100
. 23.
Hyer
M.L.
,
Милхоллен
M.A.
,
Ciavarri
J.
,
Fleming
P.
,
Traore
T.
,
Sappal
D.
,
Huck
Huck
,
Shi
J.
,
Gavin
J.
,
Brownell
J.
et al. .
Низкомолекулярный ингибитор фермента, активирующего убиквитин, для лечения рака
.
Nat. Med.
2018
;
24
:
186
—
193
. 24.
Cao
J.
,
Wu
L.
,
Zhang
S.M.
,
Lu
M.
,
Cheung
W.K.
,
Cai
W.
,
Gale
M.
,
Xu
Q.
,
Yan
Q.
Простая и эффективная индуцируемая платформа CRISPR / Cas9 с улучшенной специфичностью для множественный ген, нацеленный на
.
Nucleic Acids Res.
2016
;
44
:
e149
. 25.
Житкович
А.
,
Коста
М.
Простой и чувствительный анализ для обнаружения перекрестных связей ДНК-белок в интактных клетках и in vivo
.
Канцерогенез
.
1992
;
13
:
1485
—
1489
. 26.
Hoeller
D.
,
Crosetto
N.
,
Blagoev
B.
,
Raiborg
C.
,
Tikkanen
R.
,
Wagner Кованец
K.
,
Breitling
R.
,
Mann
M.
,
Stenmark
H.
et al. .
Регулирование убиквитин-связывающих белков путем моноубиквитинирования
.
Nat. Cell Biol.
2006
;
8
:
163
—
169
. 27.
Woelk
T.
,
Oldrini
B.
,
Maspero
E.
,
Confalonieri
S.
,
Cavallaro
E.
,
Diore
,
Polo
S.
Молекулярные механизмы сопряженного моноубиквитинирования
.
Nat. Cell Biol.
2006
;
8
:
1246
—
1254
. 28.
Hoeller
D.
,
Hecker
C.M.
,
Wagner
S.
,
Rogov
V.
,
Dotsch
V.
,
Dikic
I.
E3-независимое моноубиквитинирование убиквитин-связывающих белков
.
Мол. Ячейка
.
2007
;
26
:
891
—
898
.29.
Huang
J.
,
Zhou
Q.
,
Gao
M.
,
Nowsheen
S.
,
Zhao
F.
,
Kim
,
Zhu
Q.
,
Kojima
Y.
,
Yin
P.
,
Zhang
Y.
et al. .
Тандемное деубиквитинирование и ацетилирование sprtn способствует репарации перекрестных связей ДНК-белок и защищает от старения
.
Мол. Ячейка
.
2020
;
79
:
824
—
835
.30.
Perry
M.
,
Kollala
SS
,
Biegert
M.
,
Su
G.
,
Kodavati
M.
,
Mallard
N.
,
Holbrook
A.
,
Ghosal
G.
USP11 деубиквитинирует моноубиквитинированный SPRTN для восстановления перекрестных связей ДНК-белок
.
2020
; https://doi.org/10.1101/2020.06.30.180471.31.
Koegl
M.
,
Hoppe
T.
,
Schlenker
S.
,
Ulrich
H.D.
,
Mayer
T.U.
,
Jentsch
S.
Новый фактор убиквитинирования, E4, участвует в сборке мультиубиквитиновой цепи
.
Ячейка
.
1999
;
96
:
635
—
644
.32.
Braten
O.
,
Livneh
I.
,
Ziv
T.
,
Admon
A.
,
Kehat
I.
,
Caspi
Gonen
H.
,
Bercovich
B.
,
Godzik
A.
,
Jahandideh
S.
et al. .
Многие белки с уникальными характеристиками расщепляются протеасомой 26S после моноубиквитинирования
.
PNAS
.
2016
;
113
:
E4639
—
E4647
. 33.
Ceccaldi
R.
,
Sarangi
P.
,
D’Andrea
AD
Путь к анемии Фанкони: новые игроки и новые функции
.
Nat. Rev. Mol. Cell Biol.
2016
;
17
:
337
—
349
. 34.
Молдавский
Г.-Л.
,
Pfander
B.
,
Jentsch
S.
PCNA, маэстро репликационной вилки
.
Ячейка
.
2007
;
129
:
665
—
679
0,35.
Биенко
м.
,
Зеленый
C.M.
,
Crosetto
N.
,
Rudolf
F.
,
Zapart
G.
,
Coull
B.
,
Kannouche
P.
, 9000 2 G.
,
Peter
M.
,
Lehmann
A.R.
et al. .
Убиквитин-связывающие домены в полимеразах Y-семейства регулируют синтез трансмесий
.
Наука
.
2005
;
310
:
1821
—
1824
,36.
Stelter
P.
,
Ulrich
H.D.
Контроль спонтанного и индуцированного повреждениями мутагенеза с помощью SUMO и конъюгации убиквитина
.
Природа
.
2003
;
425
:
188
—
191
0,37.
Плоский
B.S.
,
Видал
A.E.
,
Fernandez de Henestrosa
A.R.
,
McLenigan
M.P.
,
McDonald
J.P.
,
Mead
S.
,
Woodgate
R.
Контроль субклеточной локализации ДНК-полимераз йота и эта посредством взаимодействия с убиквитином
.
EMBO J.
2006
;
25
:
2847
—
2855
0,38.
Ortega-Atienza
S.
,
Rubis
B.
,
McCarthy
C.
,
Zhitkovich
A.
Формальдегид является сильнодействующим фактором транскрипции протеотоксического шока. и lys48-связанное полиубиквитинирование белков
.
г. J. Pathol.
2016
;
186
:
2857
—
2868
.39.
Borgermann
N.
,
Ackermann
L.
,
Schwertman
P.
,
Hendriks
I.A.
,
Thijssen
K.
,
Liu
J.C.
,
Lans
H.
,
Nielsen
M.L.
,
Mailand
N.
SUMOylation способствует защитным ответам на перекрестные связи ДНК-белок
.
EMBO J.
2019
;
38
:
e101496
.40.
Fielden
J.
,
Wiseman
K.
,
Torrecilla
I.
,
Li
S.
,
Hume
S.
,
Chiang S.
С.
,
Ruggiano
A.
,
Narayan Singh
A.
,
Freire
R.
,
Hassanieh
S.
et al. .
TEX264 координирует p97- и SPRTN-опосредованное разделение аддуктов топоизомераза 1-ДНК
.
Nat. Commun.
2020
;
11
:
1274
.41.
Бхаргава
V.
,
Goldstein
C.D.
,
Russell
L.
,
Xu
L.
,
Ahmed
M.
,
Li
W.
,
Casey
A.
,
Servage
Kollipara
R.
,
Picciarelli
Z.
et al..
GCNA сохраняет целостность генома и фертильность у видов
.
Dev. Ячейка
.
2020
;
52
:
38
—
52
.42.
Докшин
Г.А.
,
Дэвис
G.M.
,
Sawle
AD
,
Eldridge
M.D.
,
Nicholls
P.K.
,
Gourley
T.E.
,
Romer
K.A.
,
Molesworth
L.W.
,
Tatnell
H.R.
,
Ozturk
A.R.
et al. .
GCNA взаимодействует со спартаном и топоизомеразой II для регулирования стабильности генома
.
Dev. Ячейка
.
2020
;
52
:
53
—
68
. 43.
Serbyn
N.
,
Noireterre
A.
,
Bagdiul
I.
,
Доска
M.
,
Michel
A.H.
,
Loewith
R.
,
Kornmann
B.
,
Stutz
F.
Аспарагиновая протеаза ddi1 способствует репарации перекрестных связей ДНК-белок в дрожжах
.
Мол. Ячейка
.
2019
;
77
:
1066
—
1079
. 44.
Свобода
М.
,
Конвалинка
J.
,
Trempe
J.F.
,
Grantz Saskova
K.
Дрожжевые протеазы Ddi1 и Wss1 обе участвуют в реакции репликации ДНК на стресс
.
Восстановление ДНК (Amst.)
.
2019
;
80
:
45
—
51
. 45.
Кодзима
Y.
,
Machida
Y.
,
Palani
S.
,
Caulfield
T.R.
,
Радиски
E.S.
,
Kaufmann
S.H.
,
Мачида
Y.J.
FAM111A защищает репликационные вилки от белковых препятствий через свой трипсиноподобный домен
.
Nat. Commun.
2020
;
11
:
1318
.
© Автор (ы) 2020. Опубликовано Oxford University Press от имени Nucleic Acids Research.
Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/), которая разрешает неограниченное повторное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии, что оригинал работа правильно процитирована.
границ | Изменение микроглии с реактивного на возрастной фенотип со временем в культуре
Введение
Микроглия — первая линия защиты от травм головного мозга. В здоровом мозге микроглия активно исследует окружающую паренхиму посредством динамического движения процессов (Nimmerjahn et al., 2005) и сохраняется в относительно спокойном состоянии, отчасти благодаря специфическим сигналам, поступающим от нейронов и астроцитов (Cardona et al., 2006). ; Lyons et al., 2007). При травме головного мозга или изменениях гомеостаза центральной нервной системы (ЦНС) микроглия способна приобретать разнообразные и сложные фенотипы, что позволяет им участвовать в цитотоксическом ответе, иммунной регуляции и разрешении травм. Классический провоспалительный фенотип M1 является цитотоксическим и выделяет провоспалительные цитокины, в то время как поляризация M2 способствует нейропротекции за счет высвобождения противовоспалительных цитокинов и факторов роста (Chhor et al., 2013; Evans et al., 2013). Эти переходные фенотипы могут оказывать благотворное или деструктивное действие в зависимости от стимулов, их продолжительности и среды, с которой они сталкиваются (Schwartz et al., 2006). Таким образом, баланс между фенотипами M1 и M2 можно рассматривать как желаемую терапевтическую цель.
Возрастные расстройства ЦНС связаны с хронической и прогрессирующей потерей нейронов, но также с хроническим легким нейровоспалением с участием активированной / примированной микроглии (Maezawa et al., 2011; Williamson et al., 2011).Эти клетки показали переключение с фенотипа M2 на M1 с возрастом и прогрессированием заболевания (Solito and Sastre, 2012; Varnum and Ikezu, 2012). Однако другие исследования утверждают, что нейровоспаление присутствует только на ранних стадиях болезни Альцгеймера (БА), когда в последнее время исчезает (Wojtera et al., 2012), и вместо этого микроглия становится стареющей / дистрофической (Graeber and Streit, 2010) и менее чувствительны к стимуляции с возрастом (Njie et al., 2012; Streit and Xue, 2012). Дисморфические характеристики стареющей микроглии предполагают, что вместо того, чтобы поддерживать сверхактивированное состояние, микроглия может проявлять пониженную способность к нормальной реакции на травму.Действительно, снижение миграции (Damani et al., 2011), клиренса (Li, 2013) и выработки нейротрофических факторов (Ma et al., 2013), а также неспособность перейти от провоспалительного состояния к противовоспалительному регуляции повреждений и восстановления наблюдались в стареющей микроглии (Norden and Godbout, 2013) и связаны со старением (Streit and Xue, 2012). Эти изменения в микроглии потенциально способствуют повышенной восприимчивости и нейродегенерации в зависимости от возраста. Соответственно, нестероидные противовоспалительные препараты (НПВП) были успешными только при введении до развития нейродегенерации (Weggen et al., 2001). При введении на более поздних стадиях заболевания они оказались вредными (Martin et al., 2008), подтверждая, что микроглия может переключаться с реактивного фенотипа на невосприимчивый по мере прогрессирования БА и других возрастных нарушений ЦНС. Сдерживание стареющей микроглии может еще больше ослабить и без того сниженные нейропротективные свойства клетки при удалении агрегатов внеклеточного белка. Эти изменения нейропротекторных свойств микроглии потенциально будут способствовать усилению нейродегенерации и восприимчивости с возрастом и выявят необходимость адекватных экспериментальных моделей для отслеживания изменений в производительности микроглии в соответствии со старением клеток.
В большинстве работ, направленных на оценку нейродегенеративной сети, связанной со старением, использовались культуры микроглии, полученные из раннего постнатального мозга, которые отличаются от взрослых или старых (Harry, 2013). Недавно было проведено несколько исследований по сравнению поведения микроглии, выделенной от животных в разном возрасте. В этих исследованиях молодые и старые микроглии были изолированы с использованием метода на основе Percol (von Bernhardi et al., 2011; Njie et al., 2012) или отчетливо выделены с использованием метода мягкой трипсинизации для эмбриональной / неонатальной микроглии и метода на основе Percol. для взрослой и пожилой микроглии (Lai et al., 2013). Кроме того, эти клетки анализировали либо через 24–48 часов после выделения (Njie et al., 2012; Lai et al., 2013), либо после трипсинизации при хранении в культуре в течение нескольких недель в присутствии кондиционированной среды, содержащей повышенные уровни митогенов. (фон Бернхарди и др., 2011). Такие методы могут способствовать активации микроглии и искажать трансляцию результатов культивирования, поскольку было высказано предположение, что микроглии может потребоваться некоторое время в культуре для восстановления ее состояния покоя (Cristóvão et al., 2010). Более того, нет средств для выделения дегенерирующей микроглии для экспериментов (Njie et al., 2012), если только более устойчивые микроглии выживут после процедуры изоляции. Тем не менее, гипотеза старения микроглии во время старения и связанных с ней нейродегенеративных заболеваний стала ключевой детерминантой (Luo et al., 2010). Доказано, что старение астроцитов и нейронов in vitro связано с различным ответом клеток на стимулы, причем более молодые клетки демонстрируют повышенную реактивность по сравнению с более старыми (Falcão et al., 2005, 2006). Кроме того, было показано, что повторная стимуляция линии клеток микроглии BV2 липополисахаридом (ЛПС) приводит к старению клеток, подтверждая идею о том, что стойкое нейровоспаление может в конечном итоге способствовать фенотипу старения микроглии (Yu et al., 2012). Поэтому мы решили изолировать микроглию от новорожденных мышей и культуральных клеток с 2 дней in vitro (DIV) до 16 DIV, аналогично тому, что мы ранее делали с нейронами и астроцитами, и изучить связанные со старением различия в характеристиках функционального ответа, связанных с на «молодые» и «пожилые» фенотипы микроглии.Мы оценили изменения в морфологии микроглии, активацию сигнального пути ядерного фактора каппа-B (NF-κB), экспрессию Toll-подобных рецепторов (TLR), фагоцитарную способность и миграционную способность, а также гибель клеток, профилирование воспалительных микроРНК (miRNA), аутофагию. и ассоциированная со старением β-галактозидаза (SA-β-gal) в культурах первичных кортикальных клеток мышей, поддерживаемых до 16 DIV.
Материалы и методы
Животные
Уход за животными соответствовал рекомендациям Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (Директива Совета 86/609 / EEC) и национального закона 1005/92 (правила защиты экспериментальных животных).Все процедуры с животными были одобрены институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию. Были приложены все усилия, чтобы свести к минимуму количество используемых животных и их страдания.
Первичная культура микроглии
Смешанные глиальные культуры получали из мышей CD1 в возрасте 1-2 дней, как описано ранее (McCarthy and de Vellis, 1980), с небольшими модификациями (Gordo et al., 2006). Клетки (4 × 10 ⁵ клеток / см ²) высевали на непокрытые 12-луночные планшеты для тканевых культур (с 18 мм покровными стеклами) или 75-см колбы для культивирования ² в культуральной среде [DMEM-Ham’s F-12 среда с добавлением 2 мМ L -глютамина, 1 мМ пирувата натрия, незаменимых аминокислот 1 ×, 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% раствора антибиотика-антимикотика] и поддерживалась при 37 ° C в увлажненной атмосфера 5% CO ₂.
Microglia выделяли, как описано ранее Saura et al. (2003). Вкратце, через 21 день в смешанной культуре микроглию получали мягкой трипсинизацией раствором трипсин-ЭДТА, разведенным 1: 3 в DMEM-Ham’s F12 в течение 45-60 минут. В результате трипсинизации отслоился верхний слой клеток, содержащий все астроциты, тогда как микроглия оставалась прикрепленной ко дну лунки. Среду, содержащую отделенные клетки, удаляли и добавляли исходную смешанную среду, кондиционированную глией.
Смешанные культуры выдерживали в культуре в течение 21 дня для достижения максимального выхода и чистоты культур. Фактически, загрязнение астроцитами и нейронами составляло менее 2 и 0%, соответственно, по оценке иммуноцитохимического окрашивания первичным антителом против GFAP и MAP-2, соответственно, с последующим введением видоспецифичного флуоресцентно меченного вторичного антитела (Silva et al. др., 2010).
Характеристика микроглии в дни культуры
После легкой трипсинизации прикрепленные клетки на 18-миллиметровых покровных стеклах без покрытия поддерживали в культуре до достижения 2, 10 или 16 DIV для характеристики, при этом среду заменяли каждые 4 дня.Характеристика микроглии сначала была проведена с учетом морфологии клеток и активации NF-κB в эти три точки времени, а затем только на 2 и 16 DIV для дополнительных свойств, связанных с миграционной способностью, фагоцитарной способностью, дифференциальной реакционной способностью клеток и маркерами клеточного старения.
Морфологический анализ клеток
Для морфологического анализа клетки фиксировали в течение 20 минут свежеприготовленным 4% (мас. / Об.) Параформальдегидом в фосфатно-буферном солевом растворе (PBS) и выполняли стандартный иммуноцитохимический метод с использованием первичных антител против Iba-1 (кролик, 1 : 250; Wako Pure Chemical Industries Ltd, Осака, Япония) и вторичный козий анти-кролик Alexa Fluor 594 (1: 1000; Invitrogen Corporation, Карлсбад, Калифорния, США).Для определения общего количества клеток ядра микроглии окрашивали красителем Hoechst 33258. Флуоресценцию визуализировали с помощью камеры AxioCam HRm, адаптированной к микроскопу AxioSkope ^® (Zeiss). Пары U.V. и изображения красной флуоресценции десяти случайных микроскопических полей (исходное увеличение: 400 ×) были получены для каждого образца. Чтобы количественно охарактеризовать морфологию микроглии, мы использовали функцию измерения частиц в ImageJ (1.47v, США), чтобы автоматически измерить 2D-площадь, периметр и диаметр Фере отдельных клеток микроглии.(Максимальный) диаметр Ферета, мера длины ячейки, представляет собой наибольшее расстояние между любыми двумя точками по периметру ячейки. Мы также оценили индекс трансформации, впервые определенный Fujita et al. (1996) как [периметр клетки (мкм)] ² / 4π [площадь клетки (² мкм)], который классифицирует статус ветвления микроглии. Клетка с длинными отростками и небольшой сомой показывает большой индекс, который зависит от формы клетки, но не зависит от размера клетки.
Обнаружение активации NF-κB
Для иммунофлуоресцентного обнаружения ядерной транслокации NF-κB клетки фиксировали, как указано выше, и выполняли стандартный непрямой иммуноцитохимический метод с использованием поликлонального кроличьего антитела к субъединице NF-κB p65 (1: 200; Santa Cruz Biotechnology ^®, CA , США) в качестве первичного антитела и антикроличьего Cy2 в качестве вторичного антитела (1: 1000; GE Healthcare, Chalfont St.Джайлз, Великобритания). Ядра микроглии окрашивали красителем Hoechst 33258. Флуоресценцию визуализировали и регистрировали, как указано выше. NF-κB-положительные ядра идентифицировали путем локализации окрашивания субъединицы NF-κB p65 исключительно в ядре, и подсчитывали общее количество клеток для определения процента NF-κB-положительных ядер в каждой группе DIV клеток.
Определение гибели клеток
Мы использовали конъюгированный с фикоэритрином аннексин V (аннексин V-PE) и 7-аминоактиномицин D (7-AAD; Guava Nexin ^® Reagent, # 4500-0450, Millipore) для определения процента жизнеспособных, раннеапоптотических и клетки с поздним апоптозом / некрозом — методом проточной цитометрии.После инкубации прилипшую микроглию собирали трипсинизацией и добавляли к клеткам, присутствующим в инкубационной среде. После центрифугирования клетки ресуспендировали в PBS, содержащем 1% бычьего сывороточного альбумина, окрашивали аннексином V-PE и 7-AAD, следуя инструкциям производителя, и анализировали на проточном цитометре Guava easyCyte 5HT (программный модуль Guava Nexin ^®, Millipore). как описано ранее (Barateiro et al., 2012). С помощью этого анализа можно выделить три популяции клеток: жизнеспособные клетки (отрицательные по аннексину V-PE и 7-AAD), клетки с ранним апоптозом (положительные по аннексину V-PE и отрицательные по 7-AAD) и поздние стадии апоптоза или мертвые клетки ( аннексин V-PE и 7-AAD положительный).
Оценка миграции микроглии
Анализы миграции клеток проводили в 48-луночной камере Бойдена с микрохемотаксисом (Neuro Probe, Gaithersburg, MD, USA), как описано ранее (Miller and Stella, 2009), с небольшими модификациями. Нижние лунки, заполненные АТФ (10 мкМ), известным хемоаттрактантом миграции микроглии, служили положительным контролем. Поликарбонатные мембраны диаметром 8 мкм с обработкой поверхности поливинилпирролидоном (ПВП) уравновешивали в контрольной среде, и после установки камеры в каждую верхнюю лунку добавляли 50 мкл суспензии клеток, содержащей 2 × 10 ⁴ клеток.После 6 ч инкубации в инкубаторе CO ₂ при 37 ° C для миграции микроглии мембрану фиксировали холодным метанолом и клетки окрашивали 10% Гимза в PBS. Немигрированные клетки на верхней стороне мембраны удаляли с помощью салфетки для фильтров. Скорость миграции определяли путем подсчета клеток на нижней поверхности мембраны в 10 полях микроскопа, покрывающих всю лунку, с использованием камеры Leica DFC490, адаптированной к микроскопу AxioSkope HBO50. Для каждого эксперимента анализировали не менее трех лунок на каждое условие.
Оценка фагоцитарных свойств микроглии
Для оценки фагоцитарной способности первичных культур микроглии клетки, собранные при 2 и 16 DIV, инкубировали с 0,0025% (мас. / Мас.) 1 мкм флуоресцентными латексными шариками (Sigma Chemical Co., Сент-Луис, Миссури, США) в течение 75 мин при 37 ° C и фиксируют свежеприготовленным 4% (мас. / об.) параформальдегидом в PBS. Микроглию окрашивали на Iba-1, ядра контрастировали с помощью красителя Hoechst, и флуоресценцию визуализировали и регистрировали, как указано выше. Подсчитывали количество проглоченных шариков на клетку.Результаты представлены как среднее количество проглоченных шариков на клетку и как процент клеток, которые фагоцитировали <5, 5–10 или> 10 шариков.
Определение дополнительных характеристик реактивной способности микроглии
Мы использовали несколько маркеров для оценки реактивной способности микроглии, таких как концентрация глутамата и активация матриксной металлопротеиназы (MMP) -2 и MMP-9 во внеклеточной среде, вместе с экспрессией TLR-2, TLR-4, miR-124 и miR-155.
Содержание
глутамата в среде, полученной из культур микроглии, определяли, как описано ранее (Silva et al., 2012), путем адаптации набора L -глутаминовой кислоты (Roche) с использованием 10-кратного уменьшения объема. Реакцию проводили в 96-луночном микропланшете, и оптическую плотность измеряли при 490 нм. Калибровочная кривая использовалась для каждого анализа. Все образцы и стандарты анализировали в двух экземплярах и использовали среднее значение.
Обнаружение активности ММП выполняли, как упоминалось ранее (Silva et al., 2010). Аликвоты культурального супернатанта анализировали зимографией SDS-PAGE в гелях 0,1% желатина и 10% акриламида в невосстанавливающих условиях. После электрофореза гели промывали в течение 1 ч 2,5% Triton X-100 (в 50 мМ Трис pH 7,4; 5 мМ CaCl ₂; 1 мкМ ZnCl ₂) для удаления SDS и ренатурации видов ММП в геле. . Затем гели инкубировали в проявляющем буфере (50 мМ Трис pH 7,4; 5 мМ CaCl ₂; 1 мкМ ZnCl ₂) в течение ночи для индукции лизиса желатина.Для анализа активности ферментов гели окрашивали 0,5% кумасси бриллиантовым синим R-250 и обесцвечивали 30% этанолом / 10% уксусной кислотой / H ₂ О. Активность желатиназы, определяемая в виде белой полосы на синем фоне, была количественно оценивается компьютерным анализом изображений и нормализуется по общему клеточному белку.
Определение экспрессии мРНК TLR-2 и TLR-4 было выполнено с помощью ПЦР в реальном времени, как обычно в нашей лаборатории (Barateiro et al., 2013). Тотальную РНК экстрагировали из микроглии с использованием TRIzol ^® (LifeTechnologies) в соответствии с инструкциями производителя.Суммарную РНК определяли количественно с использованием спектрофотометра Nanodrop ND-100 (NanoDrop Technologies, Уилмингтон, Делавэр, США). Аликвоты 0,5 мкг общей РНК обрабатывали ДНКазой I и затем обратно транскрибировали в кДНК с использованием праймеров oligo-dT и обратной транскриптазы SuperScript II в рекомендуемых условиях. Количественную ПЦР в реальном времени (qRT-PCR) проводили с использованием β-актина в качестве эндогенного контроля для нормализации уровня экспрессии факторов транскрипции TLR-2 и TLR-4. В качестве праймеров использовали следующие последовательности: TLR-2 смысловой 5′-TGCTTTCCTGCTGAAGATTT-3 ‘и антисмысловой 5′-TGTACCGCAACAGCTTCAGG-3′; TLR-4 смысловой 5’-ACCTGGCTGGTTTACACGTC-3 ‘и антисмысловой 5′-GTGCCAGAGACATTGCAGAA-3′; β-актин смысловой 5’-GCTCCGGCATGTGCAA-3 ‘и антисмысловой 5′-AGGATCTTCATGAGGTAGT-3’.qRT-PCR выполняли в системе 7300 Real time PCR System (Applied Biosystems) с использованием смеси SYBR Green qPCR Master Mix (Thermo Scientific). ПЦР выполняли в 96-луночных планшетах, причем каждый образец проводили в трех экземплярах, и для каждого амплификата был включен контроль без матрицы. qRT-PCR выполняли в оптимизированных условиях: 94 ° C в течение 3 минут, затем 40 циклов при 94 ° C в течение 0,15 минут, 62 ° C в течение 0,2 минут и 72 ° C в течение 0,15 минут. Чтобы проверить специфичность амплификации, сразу после протокола амплификации был проведен анализ кривой плавления.Неспецифические продукты ПЦР ни в коем случае не обнаружены. Относительные концентрации мРНК рассчитывали с использованием модификации Pfaffl уравнения ΔΔCT (CT, номер цикла, при котором флуоресценция проходит пороговый уровень обнаружения) с учетом эффективности отдельных генов. Результаты были нормализованы по β-актину в том же образце, и исходное количество матрицы в каждом образце было определено как относительное выражение по формуле 2-ΔΔCT. ΔCT представляет собой значение, полученное для каждого образца как разность между средним значением CT каждого гена и средним значением CT β-актина.ΔΔCT одного образца — это разница между его значением ΔCT и ΔCT образца, выбранного в качестве эталона, в нашем случае двух DIV-ячеек.
Экспрессия miR-124 и miR-155, которая была связана с фенотипом активации микроглии, была выполнена с помощью qRT-PCR. Тотальную РНК экстрагировали из первичных культур микроглии с использованием набора для изоляции miRCURY ^TM — клетки (Exiqon) в соответствии с рекомендациями производителя для культивируемых клеток. Вкратце, после лизиса клеток общую РНК адсорбировали на матрицу из диоксида кремния, промывали рекомендованными буферами и элюировали 35 мкл воды, свободной от РНКазы, центрифугированием.После количественного определения РНК преобразование кДНК для количественного определения миРНК было выполнено с помощью универсального набора для синтеза кДНК (Exiqon) с использованием 5 нг общей РНК в соответствии со следующим протоколом: 60 мин при 42 ° C с последующей тепловой инактивацией обратной транскриптазы в течение 5 мин при 95 ° С. qRT-PCR выполняли с использованием системы обнаружения последовательностей Applied Biosystems 7300 и 96-луночных планшетов. Для количественной оценки miRNA использовали универсальную систему ПЦР микроРНК miRCURY LNA ^TM (Exiqon) в сочетании с предварительно разработанными праймерами (Exiqon) для miR-124, miR-155 и SNORD110 (контрольный ген).Условия реакции включали активацию / денатурацию полимеразы и определение фактора скважины при 95 ° C в течение 10 минут с последующими 50 циклами амплификации при 95 ° C в течение 10 секунд и 60 ° C в течение 1 минуты (скорость линейного изменения 1,6 ° / с. ). Изменение укладки miRNA по отношению к 2 DIV клеткам определяли методом Pfaffl, принимая во внимание различную эффективность амплификации miRNA во всех экспериментах. Эффективность усиления для каждой мишени определялась по формуле: E = 10 ^{(-1 / S)} — 1, где S — наклон полученной стандартной кривой.
Оценка старения микроглии
Старение микроглии оценивали путем определения активности SA-β-gal, экспрессии miR-146a и способности подвергаться аутофагии. Активность микроглии SA-β-gal определяли с использованием набора для анализа клеточного старения (Millipore) в соответствии с инструкциями производителя. Ядра микроглии контрастировали гематоксилином. Для каждого образца были получены светлопольные микроскопические изображения 10 случайных микроскопических полей. Подсчитывали количество окрашенных бирюзой микроглии (SA-β-gal-позитивных клеток) для определения процента стареющих клеток.
Для подтверждения статуса старения микроглии также оценивали экспрессию связанной со старением miR-146a с помощью qRT-PCR. Тотальную РНК экстрагировали и экспрессию miR-146a анализировали с использованием предварительно сконструированных праймеров (Exiqon) для miR-146a и SNORD110 (контрольный ген), как описано выше.
Аутофагию определяли как с помощью иммуноцитохимии пунктата, связанного с микротрубочками-белком легкой цепи-3 (LC3), так и с помощью вестерн-блоттинга полос LC3 и Beclin-1. Для иммуноцитохимии клетки фиксировали, как указано выше, и выполняли стандартный иммуноцитохимический метод с использованием первичных антител, индуцированных против белка LC3 (кролик, 1: 500; Cell Signaling Technology Inc., Массачусетс, США) и вторичное козье антитело против кролика Alexa Fluor 488 (1: 1000; Invitrogen Corporation, CA, USA). Для определения общего количества клеток ядра микроглии окрашивали красителем Hoechst 33258. Визуализировали флуоресценцию и получали изображения, как указано выше. Метод основан на повышенной локализации аутофагосом LC3 при индуцировании аутофагии. Таким образом, точечная флуоресценция, производимая окрашиванием LC3, обеспечивает чувствительный и специфический индикатор аутофагии (Aoki et al., 2008). Подсчитывали клетки микроглии, представляющие пунктат LC3, и определяли процентное содержание клеток, положительных по пунктуат LC3, относительно общей микроглии.Обнаружение LC3-II, который связан с аутофагическими пузырьками (Kabeya et al., 2000), и полос Beclin-1, как обычно, обрабатывали вестерн-блоттингом в нашей лаборатории (Barateiro et al., 2012). Клетки промывали ледяным PBS, лизировали в буфере, содержащем 20 мМ Трис-HCl (pH 7,5), 150 мМ NaCl, 1 мМ Na2EDTA, 1 мМ этиленгликольтетрауксусную кислоту, 1% (об. / Об.) Triton X-100. 2,5 мМ пирофосфата натрия, 1 мМ β-глицерофосфата, 1 мМ Na3VO4, 1 мкг / мл лейпептина и 1 мМ фенилметилсульфонилфторида и обрабатывали ультразвуком в течение 20 с.Лизат центрифугировали при 14000 g в течение 10 минут при 4 ° C, супернатанты собирали и хранили при -80 ° C. Концентрации белка определяли с помощью анализа белка BioRad (BioRad). Экстракты клеток, содержащие равные количества белка (50 мкг), разделяли электрофорезом в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия и переносили на нитроцеллюлозную мембрану. Мембраны блокировали 5% обезжиренным молоком, инкубировали с первичным антителом в течение ночи при 4 ° C [кроличьи анти-LC3B (1: 1000; # 2775, Cell Signaling), мышиные анти-Beclin-1 (1: 500; # MABC34, MerckMillipore) или мышиные анти-β-актин (1: 5,000; Sigma)], а затем с вторичным антителом, меченным пероксидазой хрена, в течение 1 ч при комнатной температуре.После интенсивных промывок иммунореактивные полосы были обнаружены LumiGLO ^® (Cell Signaling, Беверли, Массачусетс, США) и визуализированы авторадиографией с Hyperfilm ECL. Результаты были нормализованы по экспрессии β-актина и выражены как кратность по сравнению с клетками, обработанными носителем.
Статистический анализ
Существенные различия между оцениваемыми параметрами были определены с помощью двустороннего теста Стьюдента t , выполненного на основе равной и неравной дисперсии, в зависимости от обстоятельств.Сравнение более чем двух групп (морфология микроглии, активация NF-κB) было выполнено с помощью дисперсионного анализа с использованием GraphPad Prism 5 (GraphPad Software Inc., Сан-Диего, Калифорния, США) с последующими множественными сравнениями с коррекцией Bonferroni post hoc . Значение p менее 0,05 считалось статистически значимым.
Результаты
In vitro Старение изменяет морфологию микроглии на более разветвленную форму клеток
Фенотипические изменения в микроглии часто сопровождаются морфологической трансформацией, которая широко используется для классификации различных состояний активации.В общем, разветвленная покоящаяся микроглия переходит в активированное состояние, демонстрируя более крупные сомы и более короткие, более грубые цитоплазматические процессы, прогрессирующие до полной амебоидной морфологии (Fujita et al., 1996; Kozlowski and Weimer, 2012). Интересно, что микроглия, выделенная от взрослых и старых животных, обнаруживает склонность к приобретению более разветвленной морфологии с более толстыми и обширными отростками (Lai et al., 2013), что указывает на менее активированный фенотип с возрастом. Итак, мы начали с характеристики морфологии микроглии на 2, 10 и 16 DIV после иммунного мечения клеточно-специфическим маркером Iba-1.Как показано на рисунке 1, во время культивирования клеток можно наблюдать различные морфологические формы микроглии. Клетки микроглии на 2 DIV были почти исключительно амебовидными, наиболее часто проявляя яйцевидную форму с несколькими клетками, имеющими веретенообразную форму (рис. 1А). На 10 DIV микроглия демонстрирует более гетерогенную морфологию с увеличенным количеством клеток, демонстрирующих разветвленную морфологию, несущих обычно один или два больших отростка или одну большую ламеллиподию вместе с более крупными амебоидными формами (Рисунок 1B).Культуры микроглии на 16 DIV все еще демонстрировали отдельные поляризованные популяции, показывающие палочковидную микроглию, биполярную микроглию с более короткими отростками и остаточные амебоидные клетки (рис. 1C). Чтобы количественно оценить влияние возраста на морфологию микроглии, мы измерили площадь, периметр и максимальный диаметр микроглии по Ферету (Рисунки 1D – F). В соответствии с преобразованием амебоидной формы в разветвленные формы микроглии, площадь, периметр и максимальный диаметр Ферета значительно увеличились на 16 DIV (~ 2.0-, ~ 1,6- и ~ 1,6-кратное соответственно, p <0,05). Анализ значения индекса трансформации, безразмерного числа, которое отражает степень расширения процесса, выявил континуум фенотипов микроглии между амебоидной и разветвленной морфологиями (рис. 1G). В то время как более молодые культуры с преобладающей амебоидной формой микроглии демонстрируют низкий индекс трансформации, более старые культуры с более гетерогенным морфологическим репертуаром, включающие клетки с амебоидной и разветвленной морфологией, демонстрируют повышенный индекс трансформации (~ 1.6-кратный, p <0,05).
РИСУНОК 1. Морфология микроглии изменяется от амебоидной до более разветвленной по мере старения клеток в культуре. Клетки микроглии выдерживали в культуре в течение 2, 10 и 16 дней. in vitro (DIV), иммуноокрашивали на Iba-1 и анализировали их морфологию. (A) На 2 DIV микроглия была амебовидной с яйцевидной формой (стрелка), и только некоторые из них имели разветвленную биполярную морфологию (наконечник стрелки). (B) На 10 DIV микроглия становится более гетерогенной с большим количеством клеток, представляющих разветвленную морфологию (наконечник стрелки), несущих одну большую ламеллиподию (*) и некоторые более крупную амебовидную форму (наконечник стрелки). (C) В клетках 16 DIV обнаружены отдельные поляризованные популяции, включая разветвленную палочковидную микроглию (наконечник стрелки), биполярную микроглию с более короткими отростками (*) и остаточные амебоидные клетки (стрелка). Значения площади микроглии (D) , периметра (E) и диаметра Фере (F) измеряли с использованием компьютерной программы ImageJ; Значения индекса трансформации (G) рассчитывали как [периметр ячейки (мкм)] ² / 4π [площадь ячейки (мкм ²)].Культуры, n = 4 на группу. Post hoc тест Бонферрони, * p <0,05 и ** p <0,01 по сравнению с 2 клетками DIV. Каждое значение представляет собой среднее значение ± SEM. Масштабная линейка равна 50 мкм.
In vitro Старение снижает активацию микроглии NF-κB
Микроглия выполняет ключевые функции, связанные с иммунной системой, участвуя в производстве противовоспалительных соединений и трофических факторов, фагоцитируя нефункциональные клетки и дебрис, а также высвобождая провоспалительные цитокины, в зависимости от стимулов.Продукция нескольких цитокинов во время процесса активации микроглии связана с активацией индуцибельного фактора транскрипции NF-κB (O’Neill and Kaltschmidt, 1997). Чтобы выяснить, могут ли морфологические изменения микроглии во время культивирования быть связаны с состоянием активации клеток, мы исследовали трансактивацию NF-κB в моменты времени, используемые для оценки морфологических изменений. После иммунного связывания микроглии для субъединицы p65 NF-κB мы определили количество NF-κB-положительных ядер в качестве индикатора его активации (рис. 2).Наши результаты показывают, что микроглия экспрессирует максимальную активацию NF-κB на 2 DIV, значительно снижаясь после этого и достигая минимальных уровней на 16 DIV (~ 0,4 раза по сравнению с 2 DIV, p <0,01). Эти результаты подтверждают предыдущие данные по морфологии клеток и подтверждают, что микроглия очень реактивна на 2 DIV, но снижает их профиль активации до минимального состояния на 16 DIV. Таким образом, чтобы установить, что микроглия на этих стадиях in vitro может быть связана с активированными (2 DIV) и возрастными невосприимчивыми клетками (16 DIV), мы дополнительно исследовали несколько маркеров, которые были связаны с возрастными изменениями в клетках. динамическое поведение микроглии.
РИСУНОК 2. Активация NF-κB снижается по мере старения микроглии в культуре. Клетки микроглии выдерживали в культуре в течение 2, 10 и 16 дней in vitro (DIV), иммуноокрашивали на ядерный фактор каппа-B (NF-κB; зеленый), а их ядра окрашивали красителем Hoechst (синий). (A) Типичные изображения на 2, 10 и 16 DIV. (B) Подсчитывали клетки, несущие NF-κB-положительные ядра, и результаты выражали в столбиках графика как среднее значение ± стандартная ошибка среднего. Культуры, n = 4 на группу. Post hoc тест Бонферрони, * p <0,05 и ** p <0,01 по сравнению с 2 клетками DIV. Масштабная линейка равна 50 мкм.
Возрастная микроглия демонстрирует способность к остаточной миграции
Микроглия, направленная миграция к регионам повреждения, также известная как хемотаксис, является свойством, которое, по-видимому, больше связано с классически (M1) и альтернативно активированной микроглией (M2a; Lively and Schlichter, 2013). Было показано, что высвобождение хемотаксических молекул при повреждении головного мозга, таких как АТФ, участвует в привлечении микроглии к участкам поражения (Miller and Stella, 2009; Kettenmann et al., 2011). Тем не менее, сообщалось, что микроглия реагирует на АТФ независимо от своего состояния активации (Lively and Schlichter, 2013). Таким образом, мы оценили способность микроглии 2 и 16 DIV мигрировать к 10 мкМ АТФ. Как показано на фиг. 3, микроглия 16 DIV обнаружила слабую способность к миграции на АТФ по сравнению с 2 клетками DIV (~ 0,1 раза, p <0,01). Это открытие указывает на 2 DIV популяции реактивной микроглии, способной мигрировать в локальное повреждение мозга, в отличие от старых клеток, которые теряют способность к инвазии.
РИСУНОК 3. Способность микроглии к миграции снижается по мере старения клеток в культуре. Клетки микроглии выдерживали в культуре в течение 2 и 16 дней in vitro (DIV), а затем оценивали хемотаксическую миграцию клеток до 10 мкМ АТФ с использованием метода камеры Бойдена. Репрезентативные изображения 2 (A) и 16 (B) микроглии DIV, которые мигрировали в сторону АТФ, визуализировали путем окрашивания по Гимзе. Подсчитывали количество мигрировавших клеток и результаты выражали в виде столбцов графика как среднее ± SEM (C) .Культуры, n = 4 на группу. t -тест, ** p <0,01 по сравнению с 2 клетками DIV. Масштабная линейка равна 50 мкм.
Возрастная микроглия демонстрирует пониженную фагоцитарную способность
Микроглия считается профессиональными фагоцитами ЦНС, функцией, которая имеет решающее значение для развития мозга, а также при патологии и регенерации (Kettenmann et al., 2011). Поэтому, основываясь на предыдущих результатах, мы предположили, что старение в культуре также может оказывать неблагоприятное воздействие на фагоцитарные свойства микроглии.Как и ожидалось, микроглия 16 DIV показала сниженную способность поглощения по сравнению с 2 клетками DIV (фигура 4A). Действительно, среднее количество шариков, фагоцитируемых каждой микроглиальной клеткой, заметно снижалось с 2 до 16 DIV (~ 0,5 раза, p <0,01). Кроме того, мы наблюдали, что стареющая микроглия функционирует менее эффективно, чем клетки 2 DIV, на основании увеличения количества клеток, поглощающих небольшое количество гранул ( p <0,01) вместе со сниженной способностью переваривать 5 или более гранул ( р <0.05; Рисунок 4B). В совокупности эти данные предполагают, что in vitro старение микроглии, полученной от новорожденных мышей, изменяет их динамическое поведение на более инертный или невосприимчивый фенотип, совместимый с невосприимчивыми / стареющими клетками.
РИСУНОК 4. Фагоцитарная способность микроглии снижается по мере старения клеток в культуре. Клетки микроглии выдерживали в культуре в течение 2 и 16 дней in vitro , а затем подвергали воздействию флуоресцентных шариков для измерения их фагоцитарной способности.Подсчитывали количество фагоцитированных гранул на клетку (A) и количество фагоцитирующих микроглию <5, 5-10 и> 10 гранул (B) , и результаты выражали в столбцах графика как среднее значение ± стандартная ошибка среднего. Культуры, n = 4 на группу. t -тест и post hoc тест Бонферрони, * p <0,05 и ** p <0,01 по сравнению с 2 клетками DIV.
Микроглия сохраняет жизнеспособность в течение
in vitro Старения
Учитывая наши предыдущие результаты, мы задавались вопросом, была ли потеря функции микроглии в результате старения in vitro следствием снижения жизнеспособности клеток.Таким образом, мы оценили гибель клеток микроглии с помощью проточной цитометрии после окрашивания аннексином V-PE и 7-AAD, чтобы дифференцировать общее количество клеток (прикрепленных плюс отслоившихся) на жизнеспособные, ранние апоптотические и поздние апоптотические / некротические клетки. Как показано в таблице 1, мы не наблюдали различий в гибели клеток между микроглией 2 и 16 DIV, подтверждая, что изменения в ответе стареющей микроглии не связаны со снижением жизнеспособности, а скорее происходят из-за переключения клеточного фенотипа и его свойств.
ТАБЛИЦА 1. Жизнеспособность культивирования микроглии.
Дополнительные характеристики реактивной способности микроглии снижены в старых клетках
Поскольку микроглия 16 DIV продемонстрировала пониженную способность реагировать на хемотаксические сигналы и фагоцитировать внеклеточные частицы, особенности, которые не были связаны с потерей выживаемости клеток (таблица 1), мы затем решили оценить, будет ли микроглия, выдержанная в культуре, также представлять дополнительные маркеры. пониженной реактивной способности.Было показано, что глутамат высвобождается активированной микроглией (Noda et al., 1999; Barger et al., 2007; Takaki et al., 2012), поэтому мы решили оценить внеклеточное содержание глутамата. Как показано на Фигуре 5A, микроглия 16 DIV показала, что высвобождает более низкие уровни глутамата в культуральную среду, чем клетки 2 DIV (~ 0,7 раза, p <0,01). Интересно, что при оценке активации MMP-2 и MMP-9 во внеклеточной среде мы подтвердили, что влияние старения также было известным (рис. 5B).Действительно, мы наблюдали заметное увеличение MMP-2 (~ 2,2 раза, p <0,05) и снижение MMP-9 (~ 0,6 раза, p <0,05) в стареющей микроглии по сравнению с 2 DIV. клетки. Опять же, экспрессия TLR-2 и TLR-4, которая связана с активацией микроглии (Banks and Robinson, 2010; Liu et al., 2012), очень сильно снизилась в микроглии 16 DIV (~ 0,4 раза, p < 0,01, рис. 5С). Недавно было показано, что иммунная регуляция miR-124 подавляет активацию микроглии (Пономарев и др., 2011) в отличие от miR-155, которая, как было показано, играет провоспалительную роль в микроглии (Cardoso et al., 2012), связана с фенотипом M1 (Ponomarev et al., 2013) и имеет повышенную активность. регулируется при активации (Lu et al., 2011). Подтверждая предыдущие данные, снижение экспрессии как miR-124, так и miR-155 в микроглии 16 DIV по сравнению с 2 клетками DIV (~ 0,5 и 0,4 раза, соответственно, p <0,01, рис. 5D) еще раз подтверждает, что клетки становятся невосприимчивыми / стареющими при поддержании в культуре.
РИСУНОК 5. Дополнительные характеристики реактивной способности микроглии снижены в старых клетках. Клетки микроглии выдерживали в культуре 2 и 16 дней in vitro (DIV). (A) Уровни внеклеточного глутамата определяли с использованием коммерческого набора. (B) Активность матричных металлопротеиназ (MMP) -2 и MMP-9 оценивали с помощью желатиновой зимографии. Экспрессию Toll-подобного рецептора (TLR) -2 и TLR-4 (C) , а также микроРНК (miR) -124 и miR-155 (D) оценивали с помощью ПЦР в реальном времени.Результаты представлены в виде столбцов графика как среднее ± стандартная ошибка среднего. Культуры, n = 4 на группу. t -тест, * p <0,05 и ** p <0,01 по сравнению с 2 ячейками DIV.
16 DIV Microglia Show Common Markers of Senescence
Было описано, что стареющая микроглия становится дисфункциональной и менее эффективной в своих нейропротекторных эффектах во время старения в человеческом мозге и при БА (Streit and Xue, 2012; Krabbe et al., 2013). Основное предложение настоящего исследования состояло в том, чтобы получить экспериментальную модель, способную воспроизводить невосприимчивую / стареющую микроглию, которую можно было бы использовать для изучения пагубных эффектов старения и связанных с ней нейродегенеративных заболеваний.Поэтому мы решили оценить, проявляет ли выдержанная in vitro микроглия in vitro типичные признаки клеточного старения. Фенотип старения был связан с изменениями клеточной морфологии, повышенной активностью SA-β-gal, необратимым повреждением ДНК, хромосомной нестабильностью и измененным воспалительным секретомом (Sikora et al., 2011). Совсем недавно появились сообщения о новых биомаркерах возрастного старения, включая повышенную экспрессию miR-146a в старых макрофагах (Jiang et al., 2012) и снижение способности подвергаться аутофагии (Ma et al., 2011). Количественный анализ активности SA-β-gal показал, что процент положительно окрашенных клеток заметно увеличился с 2 до 16 DIV (~ 2,5 раза, p <0,01), как показано на фигурах 6A, B. Точно так же мы заметили значительное повышение экспрессии miR-146a по мере старения клеток в культуре (~ 2,3 раза, p <0,05, рис. 6C). Наконец, мы оценили аутофагическую способность с помощью иммуноокрашивания LC3. Как можно видеть на Фигуре 7A, 2 клетки DIV отображали повышенное количество точечных клеток LC3 по сравнению с микроглией 16 DIV.Подсчет LC3-положительных клеток подтвердил, что уменьшенное количество 16 клеток DIV подвергалось аутофагии (~ 0,7 раза, p <0,05, фигура 7B). Затем мы оценили экспрессию LC3-II, которая образуется в результате липидирования LC3-I во время аутофагии (Kabeya et al., 2000), и дополнительно определили белок Beclin-1, который, как было установлено, играет центральную роль в таком процессе (Kang et al., 2011) методом вестерн-блоттинга (рисунки 7C, D). Наши результаты ясно показывают, что LC3-II и Beclin-1 заметно снижены в микроглии 16 DIV по сравнению с 2 клетками DIV (~ 0.В 4 и ~ 0,3 раза соответственно, p <0,01), что подтверждает снижение аутофагии со стороны стареющей микроглии.
РИСУНОК 6. Микроглия, выдержанная в культуре, демонстрирует признаки старения, включая повышенную активность связанной со старением β-галактозидазы (SA-β-gal) и экспрессию микроРНК (miR) -146a. Клетки микроглии выдерживали в культуре 2 и 16 дней in vitro (DIV). Активность SA-β-gal определяли с использованием коммерческого набора. (A) Репрезентативные изображения микроглии 2 и 16 DIV, показывающие окрашивание SA-β-gal. (B) Подсчитывали SA-β-gal-положительных клеток и результаты выражали в столбцах графика как среднее значение ± стандартная ошибка среднего. (C) Экспрессию miR-146a оценивали с помощью ПЦР в реальном времени. Результаты представлены в виде столбцов графика как среднее ± стандартная ошибка среднего. Культуры, n = 4 на группу. t -тест, * p <0,05 и ** p <0,01 по сравнению с 2 ячейками DIV. Масштабная линейка равна 20 мкм.
РИСУНОК 7. Микроглия, выдержанная в культуре, демонстрирует пониженную аутофагическую способность. Клетки микроглии выдерживали в культуре в течение 2 и 16 дней. in vitro (DIV), иммуноокрашивали на LC3, и общие клеточные лизаты анализировали на присутствие LC3-II и Beclin-1. (A) Репрезентативные изображения микроглии 2 и 16 DIV, показывающие точки LC3. (B) Подсчитывали клетки, отображающие точки LC3, и результаты выражали в столбиках графика как среднее значение ± стандартная ошибка среднего. (C) Экспрессию белков LC3-II / LC3-I и Beclin-1 оценивали с помощью вестерн-блоттинга, и денситометрический анализ данных (D) представлен на столбиках графика как среднее значение ± стандартная ошибка среднего. Культуры, n = 4 на группу. t -тест, * p <0,05 и ** p <0.01 против 2 DIV ячеек. Масштабная линейка равна 20 мкм.
В целом, наши данные показывают, что первичная микроглия, полученная от новорожденных детенышей мыши, в первую очередь свидетельствует об увеличении реактивной способности, переходящей в безответственные / стареющие клетки при сохранении в культуре. Старые клетки демонстрируют пониженную способность активироваться, мигрировать и фагоцитозировать параллельно с маркерами клеточного старения. Следовательно, эта модель in vitro может быть очень полезной при использовании реактивности микроглии и невосприимчивости к стимулам, соответственно.Кроме того, изменения в сигнатуре miRNA микроглии могут оказаться ценным подспорьем в оценке ключевой роли микроглии как детерминанты возрастных нарушений ЦНС и в модуляции динамических свойств микроглии.
Обсуждение
Эксперименты в этом исследовании были проведены для изучения возрастных различий динамических функциональных профилей неонатальной микроглии в возрасте в культуре от 2 DIV до 16 DIV. Здесь мы показываем, что микроглия, выделенная из неонатальных детенышей, свидетельствует о маркерах реактивной способности в ранней культуре, изменяя свой фенотип вдоль культуры in vitro на менее чувствительные клетки, которые представляют биомаркеры старения и профилирование микроРНК, характерное для дезактивации микроглии.В совокупности наши результаты показывают, что старение микроглии может быть воспроизведено in vitro с использованием долговременных культур мышей, которые могут быть использованы в качестве модели для оценки эффективности микроглии при возрастных расстройствах, поскольку схожие характеристики, такие как клетки мышей, свидетельствуют о том, что микроглия человека (Torres-Platas et al., 2014).
Первичные неонатальные культуры микроглии мышей обладают тем преимуществом, что они более точно представляют их аналоги in situ по сравнению с иммортализованными клетками, хотя при изолированном выращивании отсутствуют нормальные микросреды ЦНС (Ni and Aschner, 2010).Действительно, первичная культивированная микроглия не является иммортализованной онкогеном и дифференцируется в смешанных глиальных культурах перед выделением. Описанный здесь протокол дает происхождение культур микроглии, чистота которых превышает 97%, и была использована в качестве модели для активированной резидентной микроглии ЦНС (Carson et al., 1998; Schmid et al., 2009) и для получения поляризованных фенотипов M1 и M2 (Jang и др., 2013). Действительно, ранее предполагалось, что процесс изоляции является достаточным стимулом для индукции активации микроглии (Cristóvão et al., 2010). Существует много споров о том, являются ли неонатальная микроглия менее (Moussaud and Draheim, 2010) или более реактивной, чем взрослые (Christensen et al., 2014) и старые клетки (Njie et al., 2012). Расхождения также существуют в научном сообществе, основанном на исследованиях, которые рассматривают сверхактивацию микроглии и повышенное высвобождение провоспалительных цитокинов с возрастом и нейродегенеративными заболеваниями (для обзора см. Wong, 2013; Mosher and Wyss-Coray, 2014), в отличие от других, свидетельствующих о дистрофии. микроглия и старение (Streit et al., 2004; Streit and Xue, 2013), снижение фагоцитоза (Floden and Combs, 2011; Li, 2013), снижение реактивности на стимуляцию (Damani et al., 2011; Njie et al., 2012), замедленный ответ на экзогенный АТФ и снижение микроглиального процесса. подвижность (Hefendehl et al., 2014). Такие противоречивые результаты могут быть вызваны разными экспериментальными наборами и условиями. Более того, большинство данных было получено из экспериментальных моделей с использованием LPS-индуцированной активации микроглии, когда хорошо известно, что лишь небольшое количество может проникать в паренхиму мозга (Banks and Robinson, 2010).Следовательно, эффекты периферической иммуностимуляции внутривенно введенной дозой ЛПС являются косвенными, и некоторые из них опосредованы клетками, составляющими ГЭБ. Другой важный аспект, который следует учитывать, заключается в том, что НПВП были успешными только при введении до развития нейродегенерации (Weggen et al., 2001). При введении на более поздних стадиях заболевания они оказались вредными (Martin et al., 2008). Эти данные могут лежать в основе первой провоспалительной стадии нейродегенеративных заболеваний, связанных с нейровоспалением, с последующим переключением на дисфункциональную нейродегенерацию, связанную с потерей динамических свойств микроглии.Действительно, ни типичные воспалительные, ни противовоспалительные фенотипы не были идентифицированы при терминальной стадии бокового амиотрофического склероза (Никодемова и др., 2013) и микроглиальной дистрофии, связанной с их старением (Flanary, 2005), а также с возрастом и болезнью головного мозга. (Lopes et al., 2008).
Отсутствие знаний о молекулярных механизмах, участвующих в старческой дисфункции микроглии, и о том, как это связано с повышенной индивидуальной уязвимостью к нейродегенеративным заболеваниям, препятствовало разработке эффективной терапии для предотвращения или даже остановки дегенеративного процесса в сети ЦНС.Основные проблемы для исследования таких механизмов определяются текущими моделями микроглии in vitro, с использованием клеточных линий, первичной микроглии, выделенной из новорожденных мышей, и выделения ex vivo из мозга взрослых и пожилых людей. Первые модели не подходят для исследования нейродегенеративных заболеваний, при которых старение имеет решающее значение, поскольку критически важны долгосрочные эксперименты с культурой, а последняя предоставляет только определенные подмножества микроглии, которые сопротивляются процедуре изоляции (Moussaud and Draheim, 2010; von Bernhardi et al. ., 2011) или которые разделены на основе этапов иммуномагнитной сортировки клеток (Cardona et al., 2006). Однако смешанные популяции микроглии могут сосуществовать в ЦНС, и было показано, что они развиваются в культуре (Szabo and Gulya, 2013; Gertig and Hanisch, 2014). Кроме того, функциональность микроглии у взрослых и старых животных плохо сохраняется, урожай низок, и клетки подвергаются обширной гибели клеток, что приводит к активации выжившей популяции (von Bernhardi et al., 2011). Модель in vitro , которую мы разработали для определения старения микроглии в первичной культуре, вероятно, использовалась для выявления связанных со старением изменений в фибробластах на молекулярном уровне (Chen et al., 2009). Наконец, мы не использовали культивирование микроглии с астроцитами, чтобы избежать сложных взаимодействий между этими клетками (Tanaka et al., 1999), которые были бы недостатком для оценки естественной зрелости и старения микроглии. Следовательно, создание четко определенных стабильных культур in vitro , свежевыделенных от новорожденных мышей, и характеристика фенотипа микроглии с течением времени в культуре может обеспечить преимущества по сравнению с другими методами определения модификаций динамики стареющих микроглии и терапевтических подходов для восстановления функциональности микроглии.
Морфология микроглии изменилась во время сохранения in vitro от почти исключительной круглой амебоидной формы до различных поляризованных популяций, включая увеличенное количество разветвленных клеток. Соответственно, смешанные первичные глиальные культуры эмбриональных крыс ранее показали существование клеток с амебоидной морфологией на ранних стадиях дифференцировки in vitro , которая изменилась на смешанные популяции амебоидных и разветвленных морфологий клеток в более старых культурах (Сабо и Гуля , 2013).Интересно, что данные микроглии, выделенной от животных разного возраста, также подтверждают такие находки, поскольку взрослые микроглии имеют более разветвленную морфологию, в отличие от амебоидной формы эмбриональной и неонатальной микроглии (Lai et al., 2013). Это согласуется с данными in vivo , указывающими на то, что вторгшиеся неонатальные микроглии имеют преобладающую округлую морфологию, которая со временем дифференцируется в исследуемый фенотип, характеризующийся небольшой сомой и сильно разветвленными отростками (Hanisch and Kettenmann, 2007).Наши состарившиеся культуры микроглии, помимо разветвленных и амебоидных клеток, также представляли клетки биполярной формы и более короткие крупные отростки. Морфологические признаки старения микроглии с возрастом наблюдались in vivo, и определялись как аномальные морфологические признаки, такие как укороченные, узловатые, узловатые или фрагментированные цитоплазматические отростки, а также потеря мелких разветвлений и образование сфероидальных опухолей (Streit et al., 2004 ). Следовательно, мы предполагаем, что такие клетки с укороченными отростками представляют микроглию с меньшей способностью становиться реактивной и должны включать соответствующую популяцию стареющей микроглии.
Морфологические изменения стареющей микроглии in vitro происходили параллельно со снижением трансактивации NF-κB. Хорошо известно, что этот фактор транскрипции обнаруживается по всей цитоплазме, перемещаясь в ядро после активации, запуская транскрипцию генов-мишеней, таких как провоспалительные цитокины (O’Neill and Kaltschmidt, 1997). Следовательно, максимальная активация NF-κB через 2 дня после выделения согласуется с воспалительным фенотипом, который смещается в дезактивированную микроглию вместе со временем в культуре.Интересно, что хотя мы показали снижение активации NF-κB на 16 DIV, активация этого фактора транскрипции была связана с процессом старения. Недавний отчет показал, что активация NF-κB гипоталамической микроглии, способствующая остаточному воспалительному статусу, необходима для системного старения (Zhang et al., 2013). Тем не менее, заметное подавление NF-κB наблюдалось также в культивируемых стареющих фибробластах WI-38 человека (Helenius et al., 1996). Учитывая, что активаторы сигнального пути NF-κB являются детерминантами воспаления и процесса старения (Balistreri et al., 2013) и что воспаление ЦНС присутствует на ранних стадиях возрастных расстройств, таких как БА, но исчезает по мере прогрессирования заболевания (Streit et al., 2009), наша стареющая микроглия in vitro может представлять собой дистрофический и невосприимчивый фенотип, функции прогрессивно снижаются, как это недавно наблюдалось у мышей с AD-подобной патологией (Krabbe et al., 2013).
Уменьшение миграции, наблюдаемое для 16 клеток DIV, согласуется с недавними данными, показывающими, что стареющая микроглия становится менее динамичной с более медленными острыми реакциями и более низкой скоростью подвижности отростков (Damani et al., 2011). Здесь мы измерили АТФ-индуцированный хемотаксис микроглии, который происходит через пуринергические рецепторы P2X4R и P2Y12R (Ohsawa et al., 2007). Интересно, что даже с учетом того, что экспрессия P2X4R в микроглии не зависит от возраста, экспрессия P2Y12R изменяется с возрастом животных, увеличиваясь до максимума в 6-8 месяцев и снижаясь после этого до чрезвычайно низких уровней в 13-15 месяцев (Lai et al. , 2013). Таким образом, возможно, что наша состарившаяся микроглия демонстрирует пониженную экспрессию пуринергических рецепторов, что может быть причиной пониженной способности мигрировать к АТФ.Более того, поскольку было продемонстрировано, что хемоаттрактантный белок-1 моноцитов (MCP-1), продуцируемый нижестоящей активацией NF-κB, участвует в миграции микроглии (Deng et al., 2009), на основе возрастного снижения NF-κB ядерная транслокация, которую мы наблюдали, разумно полагать, что MCP-1-зависимый путь миграции также может быть затронут.
Фагоцитоз имеет решающее значение для поддержания тканевого гомеостаза и баланса врожденного иммунитета за счет поглощения как чужеродных патогенов, так и аутологичных апоптотических клеток (Napoli and Neumann, 2009).Инфекционные патогены фагоцитируются через TLR или рецепторы комплемента, чтобы вызвать высвобождение провоспалительных цитокинов (Napoli and Neumann, 2009), в то время как апоптотические клетки или клеточные остатки интернализуются через рецепторы фосфатидилсерина, интегрины или TREM2, чтобы запустить иммуносупрессивную передачу сигналов с высвобождением антибиотиков. -воспалительные цитокины (Li, 2012). Во время старения клиренс как чужеродных патогенов, так и аутологичных апоптотических клеток снижается и связан с иммуностарением (Li, 2013).Соответственно, микроглия от старых мышей также усваивает меньше пептида амилоида-β (Aβ), чем микроглия новорожденных или молодых мышей (Njie et al., 2012), подтверждая наши выводы о том, что микроглия 16 DIV имеет пониженную способность к фагоцитозу, возможно, из-за проявление стареющего фенотипа. Интересно, что микроглиальные клетки, поддерживаемые в смешанных первичных нейронально-глиальных совместных культурах, как было показано, фагоцитируют больше в амебоидной форме, чем в разветвленной форме, свойство, которое снижается во время культивирования (Szabo and Gulya, 2013).В согласии с этим, мы наблюдали сдвиг к более разветвленному фенотипу со старением клеток, что сопровождалось снижением фагоцитарной способности.
Было показано, что активированная микроглия высвобождает повышенные уровни глутамата (Noda et al., 1999; Barger et al., 2007; Takaki et al., 2012). Однако несколько исследований показали более низкую концентрацию глутамата у пожилых людей по сравнению с более молодыми людьми (Kaiser et al., 2005; Sailasuta et al., 2008; Chang et al., 2009) и зависимое от возраста снижение высвобождения глутамата у мышей. (Минкявичене и др., 2008). Это открытие согласуется с пониженным уровнем глутамата, который мы получили в старых клеточных культурах. Сходным образом повышенная активация MMP-2, которую мы наблюдали в микроглии 16 DIV, была идентифицирована в стареющих клетках (Liu and Hornsby, 2007; Lu et al., 2009; Malaquin et al., 2013). Что касается ММП-9, между авторами есть разногласия. Некоторые указывают на повышение активности с возрастом (Simpson et al., 2013), а другие — на снижение (Bonnema et al., 2007; Paczek et al., 2008), как мы получили. Кроме того, мы думаем, что заметное снижение экспрессии, которое мы получили на 16 DIV микроглии для TLR-2 и TLR-4 (0.В 5 и 0,4 раза соответственно) по сравнению с 2 клетками DIV, без сомнения, определяют, что микроглия 16 DIV будет менее способна реагировать на иммуностимуляцию LPS. Фактически, TLR-4, который имеет решающее значение для распознавания LPS, а также TLR-2, который также распознает некоторые виды LPS, являются индукторами активации микроглии, ведущей к продукции провоспалительных цитокинов (Banks and Robinson, 2010; Liu et al. , 2012). Любопытно, что опосредованное подавлением TLR-4 подавление экспрессии TNF-α и IL-1β также сопровождается подавлением NF-κB (Yao et al., 2013).
MicroRNAs представляют собой многочисленный класс высоко эволюционно консервативных малых некодирующих РНК, которые участвуют в посттранскрипционном молчании генов, регулируя разнообразные биологические процессы (Ambros, 2004). miR-146a впервые была связана с врожденным иммунным ответом в качестве регулятора отрицательной обратной связи в передаче сигналов TLR (Taganov et al., 2006), а позднее была вовлечена в возрастную дисфункцию макрофагов (Jiang et al., 2012). Наши результаты ясно показали, что стареющая микроглия экспрессирует повышенные уровни miR-146a, таким образом подтверждая их стареющий фенотип.Интересно, что экспрессия miR-146a, которая была связана с несколькими нейродегенеративными расстройствами (Sinha et al., 2011; Jiang et al., 2013), была обнаружена повышенной у пожилых мышей (Jiang et al., 2012; Olivieri et al. , 2013), в спинномозговой жидкости пациентов с БА (Alexandrov et al., 2012) и индуцироваться в микроглии при Aβ и воспалительном заражении (Li et al., 2011). Таким образом, наша старая микроглия in vitro воспроизводит связанный со старением фенотип, встречающийся при распространенных заболеваниях позднего возраста.Более того, снижение miR-124 и miR-155, что выявило отрицательную корреляцию с возрастом (Fichtlscherer et al., 2010; Noren Hooten et al., 2010; Smith-Vikos and Slack, 2012), параллельно с повышенной экспрессией miR-146a. , дополнительно подтверждают, что микроглия 16 DIV в основном представляет собой стареющую микроглию. Кроме того, полученный в этих клетках восстановленный miR-124, связанный с M2a-альтернативно активированным состоянием (Freilich et al., 2013) и подавляющий воспаление (Prinz and Priller, 2014), усиливает их покоящийся / стареющий фенотип.Напротив, преобладающая амебоидная морфология вместе с повышенной активацией NF-κB, миграцией клеток, фагоцитозом и более высокими уровнями экспрессии miR-155 в микроглии 2 DIV, по сравнению со старыми клетками, указывает на то, что в основном представлены клетки с стрессом. / реактивный фенотип. Действительно, было показано, что сильная повышающая регуляция экспрессии miR-155 играет провоспалительную роль в микроглии (Cardoso et al., 2012) и управляет фенотипом M1 (Ponomarev et al., 2013), подтверждая стрессовые свойства Культивированные клетки 2 DIV.
В настоящее время измененная морфология и повышенная активность SA-β-gal постоянно задержанных в росте клеток считаются маркерами клеточного старения (Sikora et al., 2011). Соответственно, микроглия 16 DIV показала заметное увеличение активности SA-β-gal по сравнению с 2 клетками DIV. Активность SA-β-gal также была связана с параметрами, не связанными со старением, такими как контактное ингибирование и сывороточное голодание (Severino et al., 2000). Тем не менее, как видно из изображений Iba-1, наша культура микроглии не достигла слияния и не культивировалась в условиях сывороточного голодания, что свидетельствует о том, что повышение активности SA-β-gal является результатом стареющего фенотипа.В самом деле, снижение миграции микроглии, фагоцитарная способность, активация NF-κB и повышенная SA-β-gal, как мы здесь наблюдали, были указаны как отличительные признаки старения микроглии и клеточного старения (Mosher and Wyss-Coray, 2014).
Некоторые нейродегенеративные заболевания характеризуются образованием внутриклеточных белковых агрегатов в пораженных участках мозга, что указывает на сбой в системе деградации белков (McCray and Taylor, 2008). Аутофагия — это вызванный стрессом катаболический процесс, ответственный за деградацию долгоживущих белков и поврежденных органелл (Levine and Klionsky, 2004), который, как было показано, снижается с возрастом (Bergamini, 2006) и определяет продолжительность жизни клеток и индивидуумов (Juhasz et al. ., 2007). Исследование, в котором использовались мыши с ускоренным старением, склонные к 8, модели старения и старческого слабоумия на грызунах, показало снижение аутофагической активности при старении с длительными аутофагосомами и повышенную экспрессию LC3 (Ma et al., 2011). Соответственно, пораженные нейроны с аномальными аутофагосомами (Lee, 2009) и нарушенной аутофагией (Komatsu et al., 2006) наблюдались при нейродегенерации. Мы показали, что микроглия 16 DIV демонстрирует пониженное количество точечных LC3, что указывает на пониженное образование аутофагосом.Это открытие было дополнительно подтверждено снижением, которое мы также наблюдали в экспрессии Beclin-1 в старых клетках. Beclin-1, как известно, вмешивается от образования аутофагосом к созреванию аутофагосом / эндосом, но также имеет другие дополнительные функции (Kang et al., 2011). Интересно, что недавно считалось, что Beclin-1 необходим для эффективного фагоцитоза и должен уменьшаться в микроглии, выделенной из мозга AD (Lucin et al., 2013), что объясняет снижение фагоцитарной способности наших 16 клеток DIV и такое нарушение. у мышей с AD-подобной патологией (Krabbe et al., 2013).
Стоит упомянуть, что микроглия 2 и 16 DIV по-разному реагирует на некоторые протестированные нейротоксины, как мы и предполагали. Мы использовали неконъюгированный билирубин, который, как ранее было показано, индуцирует высвобождение провоспалительных цитокинов TNF-α и интерлейкина (IL) -1β из астроцитов и микроглии в концентрациях, аналогичных тем, которые индуцируются 10 нг / мл LPS (Fernandes et al., 2004; Gordo et al., 2006; Brites et al., 2009) и Aβ в концентрации 50 нМ, концентрация, которая, как было показано, запускает активацию микроглии (Maezawa et al., 2011). Сначала тест был направлен на экспрессию высокоподвижного группового бокса-белка-1 (HMGB1), медиатора воспаления, прямо коррелированного с активацией белка NK-κB (Rovina et al., 2013). Оба стимула усиливали экспрессию клеточного HMGB1 в микроглии 2 DIV (увеличение на 80 и 100% для билирубина и Aβ, соответственно; результаты не показаны), не затрагивая 16 клеток DIV. Далее, аналогично тому, что мы получили для HMGB1, повышающая регуляция уровней мРНК экспрессии IL-18 способна вызывать более сильный воспалительный ответ, чем IL-1β (Alboni et al., 2010) снова была связана с молодой / реактивной микроглией, обработанной билирубином (увеличение на 60% по сравнению с контролем) или Aβ (увеличение на> 100% по сравнению с контролем) (данные не показаны), но никаких изменений в старых клетках замечено не было.
В целом, мы демонстрируем, что микроглия, выделенная из новорожденных мышей и сохраняющая in vitro в долгосрочных культурах, переключается с активированного / реактивного фенотипа на клетки, демонстрирующие изменения, похожие на старение. Наши результаты показывают, что состаренная in vitro микроглия изменяет свою морфологию на более разветвленную, со сниженной базальной активацией NF-κB, нарушением миграции и фагоцитарной способности, низкой экспрессией TLR-2 и TLR-4, а также снижением MMP- 9 и отток глутамата.Это исследование является первым, которое предоставило сигнатуру воспаления-миРНК для старения микроглии в первичных культурах. Клетки продемонстрировали снижение экспрессии miR-155 и miR-124, снижение аутофагической способности и повышение экспрессии miR-146a и активности SA-β-gal, что согласуется с существованием стареющих клеток на 16 DIV в культуре. В заключение, учитывая фенотипические изменения, наблюдаемые для молодой / реактивной и невосприимчивой / стареющей микроглии во время культивирования, модель in vitro старения микроглии может представлять интерес для оценки того, как различные сигналы могут по-разному изменять функциональные возможности клеток в отдельных популяциях микроглии. и связать возрастной возраст с риском нейродегенеративных заболеваний и других возрастных явлений.
Заявление о конфликте интересов
Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.
Благодарности
Эта работа была поддержана FEDER (Программа COMPETE) и Национальными фондами (FCT — Fundação para a Ciência ea Tecnologia — проект PEst-OE / SAU / UI4013 / 2011-2013, и PTDC / SAU-FAR / 118787/2010 Доре Brites), приз Edgar Cruz e Silva 2012 от Grupo de Estudo do Envelhecimento Cerebral e Demência Доре Бритес и грант от Universidade de Lisboa / Fundação Amadeus Dias Аделаиде Фернандес.Мы благодарим доктора Ану Л. Кардозу и доктора Марию К. Педросо де Лима за их техническую поддержку и советы по определению микроРНК, а также Андре Фредерико, Джоану Родригес и Джоану Серрано за техническую помощь. Финансирующая организация не играла никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.
Список литературы
Александров П. Н., Дуа П., Хилл Дж. М., Бхаттачарджи С., Чжао Ю. и Лукив В. Дж. (2012). микроРНК (miRNA) в спинномозговой жидкости (CSF) и внеклеточной жидкости (ECF) при болезни Альцгеймера (AD). Внутр. J. Biochem. Мол. Биол. 3, 365–373.
Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст
Аоки, Х., Кондо, Й., Алдапе, К., Ямамото, А., Ивадо, Э., Йокояма, Т. и др. (2008). Мониторинг аутофагии в глиобластоме с помощью антитела против изоформы B легкой цепи 3 белка, ассоциированного с микротрубочками человека. Autophagy 4, 467–475.
Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Балистрери, К. Р., Кандоре, Г., Аккарди, Г., Колонна-Романо, Г., и Лио, Д. (2013). Активаторы пути NF-kappaB как потенциальные биомаркеры старения: мишени для новых терапевтических стратегий. Immun. Старение 10, 24. doi: 10.1186 / 1742-4933-10-24
Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Баратейро А., Мирон В. Е., Сантос С. Д., Релвас Дж. Б., Фернандес А., Френч-Констан, К. и др. (2013). Неконъюгированный билирубин ограничивает дифференцировку олигодендроцитов и миелинизацию аксонов. Мол. Neurobiol. 47, 632–644.DOI: 10.1007 / s12035-012-8364-8
Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Баратейро А., Ваз А. Р., Сильва С. Л., Фернандес А. и Бритес Д. (2012). ER стресс, митохондриальная дисфункция и активация кальпаина / JNK вовлечены в гибель клеток-предшественников олигодендроцитов из-за неконъюгированного билирубина. Neuromolecular Med. 14, 285–302. DOI: 10.1007 / s12017-012-8187-9
Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Баргер, С.В., Гудвин, М. Е., Портер, М. М., и Беггс, М. Л. (2007). Высвобождение глутамата из активированной микроглии требует окислительного взрыва и перекисного окисления липидов. J. Neurochem. 101, 1205–1213. DOI: 10.1111 / j.1471-4159.2007.04487.x
Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Бергамини, Э. (2006). Аутофагия: механизм восстановления клеток, который замедляет старение и возрастные заболевания и может быть усилен фармакологически. Мол. Аспекты Мед. 27, 403–410.DOI: 10.1016 / j.mam.2006.08.001
Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Боннема Д. Д., Уэбб К. С., Пеннингтон В. Р., Страуд Р. Э., Леонарди А. Е., Кларк Л. Л. и др. (2007). Влияние возраста на металлопротеиназы матрикса плазмы (ММП) и тканевый ингибитор металлопротеиназ (ТИМП). J. Card. Неудача. 13, 530–540. DOI: 10.1016 / j.cardfail.2007.04.010
Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Бритес, Д., Фернандес, А., Фалькао, А.С., Гордо, А.С., Силва, Р.Ф., и Брито, М.А. (2009). Биологические риски неврологических нарушений, связанных с гипербилирубинемией. J. Perinatol. 29 (Дополнение 1), S8 – S13. DOI: 10.1038 / JP.2008.214
Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Кардона А. Э., Хуанг Д., Сассе М. Э. и Рансохофф Р. М. (2006). Выделение мышиных микроглиальных клеток для анализа РНК или проточной цитометрии. Нац. Protoc. 1, 1947–1951.DOI: 10.1038 / nprot.2006.327
Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Кардосо, А. Л., Гедес, Дж. Р., Перейра де Алмейда, Л., и Педросо де Лима, М. К. (2012). miR-155 модулирует опосредованный микроглией иммунный ответ, подавляя SOCS-1 и способствуя выработке цитокинов и оксида азота. Иммунология 135, 73–88. DOI: 10.1111 / j.1365-2567.2011.03514.x
Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Карсон, М.Дж., Рейли, К. Р., Сатклифф, Дж. Г., и Ло, Д. (1998). Зрелая микроглия напоминает незрелые антигенпрезентирующие клетки. Glia 22, 72–85. DOI: 10.1002 / (SICI) 1098-1136 (199801) 22: 1 <72 :: AID-GLIA7> 3.0.CO; 2-A
Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Чен Й., Йоханссон Э., Фан Й., Шерцер Х. Г., Василиу В., Неберт Д. В. и др. (2009). Раннее начало старения происходит, когда фибробласты лишены субъединицы модификатора глутамат-цистеинлигазы. Свободный Радик.Биол. Med. 47, 410–418. DOI: 10.1016 / j.freeradbiomed.2009.05.003
Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Чхор В., Ле Шарпантье Т., Лебон С., Оре, М. В., Селадор, И. Л., Жоссеран, Дж. И др. (2013). Характеристика маркеров фенотипа и нейронотоксического потенциала поляризованной первичной микроглии in vitro. Brain Behav. Иммун. 32, 70–85. DOI: 10.1016 / j.bbi.2013.02.005
Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Кристенсен, Л.Б., Вудс, Т. А., Кармоди, А. Б., Кауги, Б., и Петерсон, К. Э. (2014). Возрастные различия в нейровоспалительных ответах, связанных с различным профилем регуляторных маркеров микроглии новорожденных. J. Нейровоспаление 11, 70. DOI: 10.1186 / 1742-2094-11-70
Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Cristóvão, A.C., Saavedra, A., Fonseca, C.P., Campos, F., Duarte, E.P., и Baltazar, G. (2010). Микроглия брюшной части среднего мозга крысы со временем восстанавливает состояние покоя in vitro: дайте микроглии отдохнуть перед работой. J. Neurosci. Res. 88, 552–562. DOI: 10.1002 / jnr.22219
Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Дамани, М. Р., Чжао, Л., Фонтейнхас, А. М., Амарал, Дж., Фарисс, Р. Н., и Вонг, В. Т. (2011). Возрастные изменения динамического поведения микроглии. Ячейка старения 10, 263–276. DOI: 10.1111 / j.1474-9726.2010.00660.x
Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Дэн, Ю. Ю., Лу, Дж., Линг, Э.А., и Каур, К. (2009). Моноцитарный хемоаттрактантный белок-1 (MCP-1), продуцируемый сигнальным путем NF-kappaB, опосредует миграцию амебоидной микроглии в перивентрикулярном белом веществе у гипоксических новорожденных крыс. Глия 57, 604–621. DOI: 10.1002 / glia.20790
Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Эванс, М. К., Коуч, Ю., Сибсон, Н., и Тернер, М. Р. (2013). Воспаление и сосудисто-нервные изменения при боковом амиотрофическом склерозе. Мол.Клетка. Neurosci. 53, 34–41. DOI: 10.1016 / j.mcn.2012.10.008
Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Фалькао, А.С., Фернандес, А., Брито, М.А., Силва, Р.Ф.М., и Брайтс, Д. (2005). Вызванная билирубином воспалительная реакция, высвобождение глутамата и гибель клеток кортикальных астроцитов крыс усиливаются в более молодых клетках. Neurobiol. Дис. 20, 199–206. DOI: 10.1016 / j.nbd.2005.03.001
Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Фалькао, А.С., Фернандес А., Брито, М. А., Сильва, Р. Ф. М., и Брайтс, Д. (2006). Иммуностимулирующие эффекты и токсичность, вызванные билирубином, зависят от типа нервных клеток и состояния созревания. Acta Neuropathol. 112, 95–105. DOI: 10.1007 / s00401-006-0078-4
Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Фернандес, А., Сильва, Р. Ф., Фалькао, А. С., Брито, М. А., и Бритес, Д. (2004). Производство цитокинов, высвобождение глутамата и гибель клеток в культивируемых астроцитах крыс, обработанных неконъюгированным билирубином и ЛПС. J. Neuroimmunol. 153, 64–75. DOI: 10.1016 / j.jneuroim.2004.04.007
Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Fichtlscherer, S., De Rosa, S., Fox, H., Schwietz, T., Fischer, A., Liebetrau, C., et al. (2010). Циркулирующие микроРНК у пациентов с ишемической болезнью сердца. Circ. Res. 107, 677–684. DOI: 10.1161 / CIRCRESAHA.109.215566
Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Фрейлих, Р. В., Вудбери, М. Э., Икезу, Т. (2013). Интегрированные профили экспрессии мРНК и миРНК в поляризованной первичной мышиной микроглии. PLoS ONE 8: e79416. DOI: 10.1371 / journal.pone.0079416
Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Fujita, H., Tanaka, J., Toku, K., Tateishi, N., Suzuki, Y., Matsuda, S., et al. (1996). Влияние GM-CSF и обычных добавок на разветвление микроглии в культуре: морфометрическое исследование. Glia 18, 269–281.DOI: 10.1002 / (SICI) 1098-1136 (199612) 18: 4 <269 :: AID-GLIA2 <3.0.CO; 2-T
Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Гордо, А.С., Фалькао, А.С., Фернандес, А., Брито, М.А., Силва, Р.Ф., и Бритес, Д. (2006). Неконъюгированный билирубин активирует и повреждает микроглию. J. Neurosci. Res. 84, 194–201. DOI: 10.1002 / jnr.20857
Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Hefendehl, J. K., Neher, J. J., Suhs, R.Б., Косака, С., Скодрас, А., Джакер, М. (2014). Гомеостатическое и вызванное повреждениями поведение микроглии в стареющем мозге. Ячейка старения 13, 60–69. DOI: 10.1111 / acel.12149
Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Хелениус, М., Ханнинен, М., Лехтинен, С. К., и Салминен, А. (1996). Изменения, связанные со старением и репликативным старением в регуляции фактора транскрипции ядерного фактора-каппа B. Biochem. J. 318 (Pt 2), 603–608.
Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст
Jang, E., Lee, S., Kim, J. H., Seo, J. W., Lee, W. H., Mori, K., et al. (2013). Секретируемый белок липокалин-2 способствует поляризации микроглии M1. FASEB J. 27, 1176–1190. DOI: 10.1096 / fj.12-222257
Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Jiang, M., Xiang, Y., Wang, D., Gao, J., Liu, D., Liu, Y., et al. (2012). Нарушение экспрессии miR-146a способствует возрастной дисфункции макрофагов. Ячейка старения 11, 29–40. DOI: 10.1111 / j.1474-9726.2011.00757.x
Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Jiang, W., Zhang, Y., Meng, F., Lian, B., Chen, X., Yu, X., et al. (2013). Идентификация активного фактора транскрипции и путей регуляции miRNA при болезни Альцгеймера. Биоинформатика 29, 2596–2602. DOI: 10.1093 / биоинформатика / btt423btt423
Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Юхас, Г., Эрди, Б., Сасс, М., и Нойфельд, Т. П. (2007). Atg7-зависимая аутофагия способствует здоровью нейронов, устойчивости к стрессу и долголетию, но не обязательна для метаморфоза у дрозофилы. Genes Dev. 21, 3061–3066. DOI: 10.1101 / gad.1600707
Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Кабея Ю., Мидзусима Н., Уэно Т., Ямамото А., Кирисако Т., Нода Т. и др. (2000). LC3, гомолог дрожжевого Apg8p у млекопитающих, после процессинга локализуется в мембранах аутофагосом. EMBO J. 19, 5720–5728. DOI: 10.1093 / emboj / 19.21.5720
Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Кайзер, Л. Г., Шафф, Н., Кэшдоллар, Н., и Вайнер, М. В. (2005). Связанные с возрастом изменения концентрации глутамата и глутамина в нормальном мозге человека: исследование 1H MR-спектроскопии на 4 T. Neurobiol. Старение 26, 665–672. DOI: 10.1016 / j.neurobiolaging.2004.07.001
Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Komatsu, M., Вагури, С., Чиба, Т., Мурата, С., Ивата, Дж., Танида, И. и др. (2006). Потеря аутофагии в центральной нервной системе вызывает нейродегенерацию у мышей. Природа 441, 880–884. DOI: 10.1038 / nature04723
Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Козловски К., Веймер Р. М. (2012). Автоматизированный метод количественной оценки морфологии микроглии и применение для продольного мониторинга состояния активации in vivo. PLoS ONE 7: e31814. DOI: 10.1371 / journal.pone.0031814
Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Краббе, Г., Галле, А., Матяш, В., Ринненталь, Дж. Л., Эом, Г. Д., Бернхардт, У. и др. (2013). Функциональное нарушение микроглии совпадает с отложением бета-амилоида у мышей с альцгеймероподобной патологией. PLoS ONE 8: e60921. DOI: 10.1371 / journal.pone.0060921
Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Лай, А.Ю., Дибал, К.Д., Армитидж, Г.А., Виншип И. Р., Тодд К. Г. (2013). Отчетливые профили активации в микроглии разного возраста: систематическое исследование на изолированных эмбриональных и старых культурах микроглии. Неврология 254, 185–195. DOI: 10.1016 / j.neuroscience.2013.09.010
Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Левин Б., Клионски Д. Дж. (2004). Развитие путем самопереваривания: молекулярные механизмы и биологические функции аутофагии. Dev. Cell 6, 463–477.DOI: 10.1016 / S1534-5807 (04) 00099-1
Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Ли, Ю. Ю., Цуй, Дж. Г., Дуа, П., Пог, А. И., Бхаттачарджи, С., и Лукив, В. Дж. (2011). Дифференциальная экспрессия регулируемых miRNA-146a воспалительных генов в первичных нервных, астроглиальных и микроглиальных клетках человека. Neurosci. Lett. 499, 109–113. DOI: 10.1016 / j.neulet.2011.05.044
Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Лю Д., и Хорнсби, П. Дж. (2007). Стареющие фибробласты человека увеличивают ранний рост опухолей ксенотрансплантата за счет секреции матриксной металлопротеиназы. Cancer Res. 67, 3117–3126. DOI: 10.1158 / 0008-5472.CAN-06-3452
Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Лайвли С., Шлихтер Л. К. (2013). Состояние активации микроглии регулирует миграцию и роль растворяющих матрикс ферментов в инвазии. J. Нейровоспаление 10, 75. DOI: 10.1186 / 1742-2094-10-75
Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Лопес, К. О., Спаркс, Д. Л., и Стрейт, В. Дж. (2008). Дистрофия микроглии в головном мозге пожилых людей и при болезни Альцгеймера связана с иммунореактивностью ферритина. Глия 56, 1048–1060. DOI: 10.1002 / glia.20678
Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Лу К., Хуанг Х., Чжан Х., Ренш К., Цао К., Накаяма К. И. и др. (2011). miR-221 и miR-155 регулируют развитие дендритных клеток человека, апоптоз и продукцию IL-12 посредством нацеливания на p27kip1, KPC1 и SOCS-1. Кровь 117, 4293–4303. DOI: 10.1182 / кровь-2010-12-322503
Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Лу, Х. Х., Чен, Л. К., Ченг, С. Ю., Хунг, С. Л., Лин, С. С., и Чанг, К. В. (2009). Обработанные экстрактом ореха ареки фибробласты десен модулируют инвазивность полиморфно-ядерных лейкоцитов за счет продукции MMP-2. J. Oral Pathol. Med. 38, 79–86. DOI: 10.1111 / j.1600-0714.2008.00717.x
Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Лучин, К.M., O’Brien, C.E., Bieri, G., Czirr, E., Mosher, K. I., Abbey, R.J., et al. (2013). Микроглиальный беклин 1 регулирует перенос ретромеров и фагоцитоз и нарушается при болезни Альцгеймера. Нейрон 79, 873–886. DOI: 10.1016 / j.neuron.2013.06.046
Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Лайонс, А., Даунер, Э. Дж., Кротти, С., Нолан, Ю. М., Миллс, К. Х. и Линч, М. А. (2007). Взаимодействие с рецептором лиганда CD200 модулирует активацию микроглии in vivo и in vitro: роль IL-4. J. Neurosci. 27, 8309–8313. DOI: 10.1523 / JNEUROSCI.1781-07.2007
Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Ма, К., Цян, Дж., Гу, П., Ван, Ю., Гэн, Ю., и Ван, М. (2011). Связанные с возрастом изменения аутофагии в мозге мышей с ускоренным старением мышей с предрасположенностью 8 (SAMP8). Exp. Геронтол. 46, 533–541. DOI: 10.1016 / j.exger.2011.02.006
Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Ма, В., Кожокару, Р., Gotoh, N., Gieser, L., Villasmil, R., Cogliati, T., et al. (2013). Изменения экспрессии генов в стареющей микроглии сетчатки: связь с функциями поддержки микроглии и регуляция активации. Neurobiol. Старение 34, 2310–2321. DOI: 10.1016 / j.neurobiolaging.2013.03.022
Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Маэдзава И., Зимин П. И., Вульф Х. и Джин Л. В. (2011). Олигомер белка амилоида-бета при низких наномолярных концентрациях активирует микроглию и вызывает нейротоксичность микроглии. J. Biol. Chem. 286, 3693–3706. DOI: 10.1074 / jbc.M110.135244
Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Malaquin, N., Vercamer, C., Bouali, F., Martien, S., Deruy, E., Wernert, N., et al. (2013). Старые фибробласты усиливают ранние кожные канцерогенные явления через паракринную ось MMP-PAR-1. PLoS ONE 8: e63607. DOI: 10.1371 / journal.pone.0063607
Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Мартин, Б.K., Szekely, C., Brandt, J., Piantadosi, S., Breitner, J. C., Craft, S., et al. (2008). Когнитивная функция с течением времени в испытании противовоспалительной профилактики болезни Альцгеймера (ADAPT): результаты рандомизированного контролируемого испытания напроксена и целекоксиба. Arch. Neurol. 65, 896–905. DOI: 10.1001 / archneur.2008.65.7.nct70006
Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Маккарти, К. Д., и де Веллис, Дж. (1980). Приготовление отдельных культур астроглиальных и олигодендроглиальных клеток из ткани головного мозга крыс. J. Cell Biol. 85, 890–902. DOI: 10.1083 / jcb.85.3.890
Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Миллер А. М. и Стелла Н. (2009). Миграция микроглиальных клеток, стимулируемая АТФ и C5a, включает различные молекулярные механизмы: количественное определение миграции с помощью нового метода в ближней инфракрасной области. Глия 57, 875–883. DOI: 10.1002 / glia.20813
Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Минкявичене, Р., Ихалайнен, Дж., Мальм, Т., Матилайнен, О., Кекса-Гольдштейн, В., Гольдштейн, Г. и др. (2008). Связанное с возрастом снижение стимулированного высвобождения глутамата и везикулярных переносчиков глутамата у трансгенных мышей и мышей дикого типа APP / PS1. J. Neurochem. 105, 584–594. DOI: 10.1111 / j.1471-4159.2007.05147.x
Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Муссо, С., Драхейм, Х. Дж. (2010). Новый метод выделения микроглии из взрослых мышей и их культивирования в течение длительного периода времени. J. Neurosci. Методы 187, 243–253. DOI: 10.1016 / j.jneumeth.2010.01.017
Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Ни, М., и Ашнер, М. (2010). Первичная микроглия новорожденных крыс: выделение, культивирование и избранные применения. Curr. Protoc. Toxicol. Глава. 12, Блок 12.17. DOI: 10.1002 / 0471140856.tx1217s43
Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Никодемова М., Смолл А. Л., Смит С.М., Митчелл, Дж. С., Уоттерс, Дж. Дж. (2013). Спинальная, но не кортикальная микроглия приобретает атипичный фенотип с высоким уровнем VEGF, галектина-3 и остеопонтина и притупляет воспалительные реакции у крыс с БАС. Neurobiol. Дис. doi: 10.1016 / j.nbd.2013.11.009 [Epub ahed of print].
Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., and Helmchen, F. (2005). Покоящиеся микроглиальные клетки являются высокодинамичными наблюдателями паренхимы головного мозга in vivo. Наука 308, 1314–1318. DOI: 10.1126 / science.1110647
Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Нджие, Э. Г., Белен, Э., Стассен, Ф. Р., Стейнбуш, Х. У., Борчелт, Д. Р., Страйт, В. Дж. (2012). Ex vivo культуры микроглии из мозга молодых и старых грызунов выявляют возрастные изменения функции микроглии. Neurobiol. Старение 33, 195 e191 – e112. DOI: 10.1016 / j.neurobiolaging.2010.05.008
Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Нода, М., Наканиши Х. и Акаике Н. (1999). Высвобождение глутамата из микроглии через переносчик глутамата усиливается бета-амилоидным пептидом. Неврология 92, 1465–1474. DOI: 10.1016 / S0306-4522 (99) 00036-6
Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Норден, Д. М., и Годбаут, Дж. П. (2013). Обзор: микроглия пожилого мозга: настроена на активацию и устойчива к регуляции. Neuropathol. Прил. Neurobiol. 39, 19–34. DOI: 10.1111 / j.1365-2990.2012.01306.x
Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Норен Хутен, Н., Абдельмохсен, К., Гороспе, М., Эджиогу, Н., Зондерман, А. Б., и Эванс, М. К. (2010). Паттерны экспрессии микроРНК показывают дифференциальную экспрессию генов-мишеней с возрастом. PLoS ONE 5: e10724. DOI: 10.1371 / journal.pone.0010724
Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Осава, К., Ирино, Ю., Накамура, Ю., Акадзава, К., Иноуэ, К., и Косака, С.(2007). Участие рецепторов P2X4 и P2Y12 в АТФ-индуцированном хемотаксисе микроглии. Глия 55, 604–616. DOI: 10.1002 / glia.20489
Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
O’Neill, L.A., и Kaltschmidt, C. (1997). NF-каппа B: важный фактор транскрипции для функции глиальных и нейрональных клеток. Trends Neurosci. 20, 252–258. DOI: 10.1016 / S0166-2236 (96) 01035-1
Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Пачек, Л., Михальска В. и Бартломейчик И. (2008). Активность трипсина, эластазы, плазмина и ММР-9 в сыворотке крови в процессе старения человека. Возраст Старение 37, 318–323. DOI: 10.1093 / старение / afn039
Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Пономарев, Э. Д., Веремейко, Т., Бартенева, Н., Кричевский, А. М., Вайнер, Х. Л. (2011). MicroRNA-124 способствует покою микроглии и подавляет EAE, дезактивируя макрофаги через путь C / EBP-alpha-PU.1. Нац. Med. 17, 64–70. DOI: 10.1038 / Нм.2266
Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Пономарев, Э. Д., Веремейко, Т., Вайнер, Х. Л. (2013). МикроРНК являются универсальными регуляторами дифференцировки, активации и поляризации микроглии и макрофагов в нормальной и больной ЦНС. Глия 61, 91–103. DOI: 10.1002 / glia.22363
Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Сайласута, Н., Эрнст, Т., и Чанг, Л. (2008). Региональные различия и влияние возраста и пола на концентрацию глутамата в мозге человека. Magn. Резон. Imaging 26, 667–675. DOI: 10.1016 / j.mri.2007.06.007
Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Шмид, К. Д., Мельхиор, Б., Масек, К., Пунтамбекар, С. С., Даниэльсон, П. Э., Ло, Д. Д. и др. (2009). Дифференциальная экспрессия генов в микроглии и макрофагах, активированных LPS / IFNgamma: in vitro по сравнению с in vivo. J. Neurochem. 109 (Приложение 1), 117–125. DOI: 10.1111 / j.1471-4159.2009.05984
Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Северино, Дж., Аллен, Р. Г., Балин, С., Балин, А., и Кристофало, В. Дж. (2000). Является ли окрашивание бета-галактозидазой маркером старения in vitro и in vivo? Exp. Cell Res . 257, 162–171. DOI: 10.1006 / excr.2000.4875
Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Силва, С.Л., Ваз, А.R., Barateiro, A., Falcao, A. S., Fernandes, A., Brito, M. A., et al. (2010). Особенности билирубин-индуцированной реактивной микроглии: от фагоцитоза до воспаления. Neurobiol. Дис. 40, 663–675. DOI: 10.1016 / j.nbd.2010.08.010
Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Силва, С. Л., Ваз, А. Р., Диогенес, М. Дж., Ван Ройен, Н., Себастьян, А. М., Фернандес, А. и др. (2012). Нарушение роста невритов и гибель клеток из-за неконъюгированного билирубина опосредуются NO и глутаматом, модулируются микроглией и предотвращаются гликурсодезоксихолевой кислотой и интерлейкином-10. Нейрофармакология 62, 2398–2408. DOI: 10.1016 / j.neuropharm.2012.02.002
Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Симпсон, Дж. Л., Макдональд, В. М., Бейнс, К. Дж., Орео, К. М., Ван, Ф., Хансбро, П. М. и др. (2013). Влияние возраста, курения в прошлом и тяжести заболевания на TLR2, нейтрофильное воспаление и уровни MMP-9 при ХОБЛ. Медиаторы воспаления. 2013, 462934. DOI: 10.1155 / 2013/462934
Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Streit, W.Дж., Браак, Х., Сюэ, К. С., Бехманн, И. (2009). Дистрофические (стареющие), а не активированные клетки микроглии связаны с патологией тау-белка и, вероятно, предшествуют нейродегенерации при болезни Альцгеймера. Acta Neuropathol. 118, 475–485. DOI: 10.1007 / s00401-009-0556-6
Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Таганов, К. Д., Болдин, М. П., Чанг, К. Дж., И Балтимор, Д. (2006). NF-kappaB-зависимая индукция микроРНК miR-146, ингибитора, нацеленного на сигнальные белки врожденных иммунных ответов. Proc. Natl. Акад. Sci. США 103, 12481–12486. DOI: 10.1073 / pnas.0605298103
Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Такаки Дж., Фухимори К., Миура М., Судзуки Т., Секино Ю. и Сато К. (2012). L-глутамат, высвобождаемый из активированной микроглии, подавляет экспрессию астроцитарного транспортера L-глутамата при нейровоспалении: гипотеза «сговора» для увеличения концентрации внеклеточного L-глутамата при нейровоспалении. J. Нейровоспаление 9, 275.DOI: 10.1186 / 1742-2094-9-275
Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Танака Дж., Току К., Саканака М. и Маэда Н. (1999). Морфологическая дифференциация клеток микроглии в культуре: участие нерастворимых факторов, происходящих из астроцитов. Neurosci. Res. 34, 207–215. DOI: 10.1016 / S0168-0102 (99) 00041-3
Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Торрес-Платас, С.Г., Комо, С., Рачальски, А., Бо, Г. Д., Кручану, К., Турецки, Г. и др. (2014). Морфометрическая характеристика фенотипов микроглии в коре головного мозга человека. J. Нейровоспаление 11, 12. DOI: 10.1186 / 1742-2094-11-12
Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Варнум М. М., Икезу Т. (2012). Классификация фенотипов активации микроглии на нейродегенерацию и регенерацию в мозге при болезни Альцгеймера. Arch. Иммунол. Ther. Exp. (Warsz) 60, 251–266.DOI: 10.1007 / s00005-012-0181-2
Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
фон Бернхарди, Р., Тихауэр, Дж., И Евгенин-фон Бернхарди, Л. (2011). Пролиферирующая культура старой микроглии для изучения нейродегенеративных заболеваний. J. Neurosci. Методы 202, 65–69. DOI: 10.1016 / j.jneumeth.2011.08.027
Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Вегген, С., Эриксен, Дж. Л., Дас, П., Саги, С. А., Ван, Р., Петрзик, К.U., et al. (2001). Подмножество НПВП снижают амилоидогенный Abeta42 независимо от активности циклооксигеназы. Природа 414, 212–216. DOI: 10.1038 / 35102591
Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Уильямсон Л. Л., Шолар П. В., Мистри Р. С., Смит С. Х. и Бильбо С. Д. (2011). Микроглия и память: модуляция ранней инфекцией. J. Neurosci. 31, 15511–15521. DOI: 10.1523 / JNEUROSCI.3688-11.2011
Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Войтера, М., Собоу Т., Клошевска И., Либерски П. П., Браун Д. Р. и Сикорска Б. (2012). Экспрессия иммуногистохимических маркеров на микроглии при болезни Крейтцфельдта-Якоба и болезни Альцгеймера: морфометрическое исследование и обзор литературы. Folia Neuropathol. 50, 74–84.
Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст
Яо, Л., Кан, Э. М., Лу, Дж., Хао, А., Дхин, С. Т., Каур, К. и др. (2013). Toll-подобный рецептор 4 опосредует активацию микроглии и продукцию медиаторов воспаления в головном мозге новорожденных крыс после гипоксии: роль TLR4 в гипоксической микроглии. J. Нейровоспаление 10, 23. DOI: 10.1186 / 1742-2094-10-23
Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Yu, H. M., Zhao, Y. M., Luo, X. G., Feng, Y., Ren, Y., Shang, H., et al. (2012). Повторная стимуляция липополисахаридом вызывает клеточное старение в клетках BV2. Нейроиммуномодуляция 19, 131–136. DOI: 10.1159 / 000330254
Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Чжан, Г., Ли, Дж., Пуркаястха, С., Tang, Y., Zhang, H., Yin, Y., et al. (2013). Гипоталамическое программирование системного старения с участием IKK-beta, NF-kappaB и GnRH. Природа 497, 211–216. DOI: 10.1038 / природа12143
Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст
Призыв к дополнительным исследованиям из Персидского залива
Вступление: Ожирение стало эпидемией в Персидском заливе, при этом ожирение широко распространено, согласно последнему отчету Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), согласно которому регион Персидского залива является странами с самым высоким уровнем ожирения в группе более 30%.Это исследование направлено на изучение публикаций по бариатрической хирургии и сравнение их с другими странами с высоким уровнем распространенности ожирения в мире.
Методы: Был проведен обзор литературы по бариатрической хирургии, опубликованный с самого раннего обнаруженного года публикации до марта 2016 года с использованием SCOPUS, PubMed, Ovid и Google Scholar. Отдельные статьи оценивались по типам хирургии, предоперационным мероприятиям, названиям журналов, авторам и исходам.Данные были проанализированы с использованием библиотеки Endnote и SPSS. Ключевые слова, использованные при поиске: «Бариатрическая хирургия», «Персидский залив», «Кувейт», «Катар», «Саудовская Аравия», «Объединенные Арабские Эмираты», «Оман», «США», «Австралия», «вес». хирургия потери »,« рукавная резекция желудка »,« обходной желудочный анастомоз »,« желудочный бандаж »,« мини-желудочный обходный анастомоз »,« билиропанкреатическое отведение »,« дуоденальное переключение »и« внутрижелудочный баллон ». Были включены оригинальные документы, систематические обзоры и отчеты о случаях.
Полученные результаты: Согласно нашему обзору, рукавная резекция желудка оказалась самой популярной из опубликованных процедур в Персидском заливе, тогда как в США был самый высокий процент операций обходного желудочного анастомоза, а в Австралии — аналогичные показатели, когда дело дошло до обходного желудочного анастомоза и бандажа.Количество исследований из Саудовской Аравии, Кувейта, ОАЭ, Бахрейна, Катара и Омана составило 70, 44, 20, 7, 6 и 0 соответственно. Средний импакт-фактор опубликованных статей составил 2,53 +/- 1,76 SD. Большинство публикаций было опубликовано в журналах «Хирургия ожирения» (29%), «Хирургия ожирения и родственных заболеваний» (5%) и «Хирургическая эндоскопия» (5%).
Заключение: В Персидском заливе самый высокий процент выполненных бариатрических процедур, а также самая высокая распространенность ожирения.Однако у них меньше всего публикаций и исследований по сравнению с их западными аналогами; поэтому необходимы дополнительные исследования и публикации в регионе Персидского залива, а также возможность создания регионального регистра, чтобы иметь возможность иметь хороший обзор бариатрической хирургии в регионе.
Ключевые слова: Арабский залив; Бариатрической хирургии; Публикации по бариатрической хирургии; Сотрудничество; Желудочный бандаж; Обходной желудочный анастомоз; Внутрижелудочный баллон; Лапароскопическая рукавная гастрэктомия; Ожирение; Процедуры; Рассмотрение.

Разное