Продажа квадроциклов, снегоходов и мототехники
second logo
Пн-Чт: 10:00-20:00
Пт-Сб: 10:00-19:00 Вс: выходной

+7 (812) 924 3 942

+7 (911) 924 3 942

Содержание

Презентация новой Лады Vesta. г. Новочебоксарск

На прошлой неделе в г. Новочебоскарск прошла презентация абсолютно новой модели авто, обсуждение которой уже давно идет среди наших жителей, а также специалистов автомобильной отрасли. Это новое авто, ставшее релизом нашей родной торговой марки Lada создано, чтобы осуществить перевород в отношении авто, производства отечественного автопрома.

Новый автомобиль, как отмечают создатели, с ходу удивит размерами, т.к. является достаточно крупным, и может посоревноваться в габаритах с более дорогими марками зарубежного производства. это — средний класс, и производители поставили перед собой тезис, что «размер имеет значение». Такой «конь» придется по душе людям, предпочитающим масштаб, простор и богатство. Богатство авто — не только благородные материалы, использованные в производстве Lada Vesta, но и множество возможностей базовой комплектации автомобиля.

Проектировщики Lada презентовали вместе с этим автомобилем принципиально новую платформу BC, которую, как они уверяют, планируют использовать в производстве будущих автомобилей.

Представитель компании уверяют, что с новым автомобилем российский потребитель получит именно то, что хочет от современного автомобиля. Новые модели Lada меняются, становятся лучше, и имеют амбициозные планы идти не просто в ногу со временем, но и обгонять конкурентов не только по цене, как это было раньше.

Презентация происходила онлайн, и все необходимое оборудование для нее было предоставлено компанией Гефест Проекция. Рекомендуем вам посмотреть видеоотчет с этого мероприятия. Приобретайте автомобиль Lada, а также, пользуйтесь услугами компании Гефест проекция в организации ваших выставочных, презентационных и просто развлекательных мероприятий.

Презентация Lada Vesta Sport (все отличия от обычной версии)

Презентация Lada Vesta Sport (все отличия от обычной версии)


Lada Vesta Sport - флагман модельного ряда LADA Vesta. В спортивном седане применены новые технические решение, всего было сделано 228 изменений. Все главные преимущества были собраны в одной презентации, которая предназначена для демонстрации клиентам в дилерский центрах LADA.

Дизайн (экстерьер)

LADA Vesta Sport унаследовала облик концепт-кара Vesta Sport Concept, впервые показанного на Московском международном автосалоне в 2016 году.

Директор дизайн-центра LADA Стив Маттин:

Яркий и спортивный дизайн LADA Vesta Sport представляет собой своеобразную энергетическую оболочку, вобравшую в себя одновременно страсть и адреналин, переданные через мощный темперамент автомобиля.


Основной элемент ДНК в дизайне LADA, ''ИКС - графика'', отображенная в переднем бампере, претерпела легкие изменения. Его трапециевидная форма, расширяющаяся в нижней части, акцентируется хромированными матовыми вставками в виде бумерангов. Пластиковые детали, внутри которых расположены передние противотуманные фары, были намеренно увеличены в размерах. Эти элементы теперь слегка выступают за габариты самого бампера и еще сильнее подчеркивают динамичный облик LADA Vesta Sport, визуально расширяя ее габариты.

Зеркала заднего вида LADA Vesta Sport получили черные глянцевые накладки, и теперь выполнены в едином цветовом решении с фальш-радиаторной решеткой.

Дизайн заднего бампера LADA Vesta Sport выглядит скульптурно и экспрессивно. В первую очередь его подчеркивают контрастные черные фальш-вентиляционные вставки по бокам, внутри которых расположены датчики помощи парковки. Эти элементы визуально расширяют облик автомобиля в задней части. В декоративную накладку по центру нижней части бампера интегрированы хромированные сдвоенные выхлопные трубы. Для снижения подъемной силы на крышке багажника установлен интегрированный спойлер, размер и форма которого были тщательно подобраны в ходе аэродинамических испытаний автомобиля в собственной лаборатории в Тольятти. Дополнительный LED стоп-сигнал также является неотъемлемой частью спойлера.

Передние крылья новой формы изготовлены из пластика. Это облегчает кузов, позволяет расширить колею и оставаться более чистыми боковинами кузова, несмотря на применение более широких колес.

Автомобиль получил оригинальные 17-дюймовые колесные диски с низкопрофильной резиной, а также аэродинамические накладки на пороги. Для обеспечения более спортивного поведения машины на дороге ее клиренс был уменьшен на 16 мм и теперь составляет 162 мм, что визуально добавило силуэту стремительности.

Дизайн (интерьер)

Красный цвет в интерьере сочетается с черными элементами. Черная глянцевая отделка воздуховодов. Черная глянцевая отделка воздуховодов гармонично сочетается с красной подсветкой панели приборов, являющейся элементом новой графики, разработанной специально для LADA Vesta Sport. Тема черного глянца продолжена в материалах дверных ручек, а на приборной панели и дверях использованы декоративные вставки под »карбон».

Спортивный характер автомобиля усиливается за счет применения черного цвета в отделке потолка и стоек внутри автомобиля. Подобный подход создает цветовой баланс во всем интерьере и применяется на контрасте с красным цветом.


Передние кресла с ярко выраженной боковой поддержкой получили специальную отделку: красные вставки на сиденьях из материала типа алькантара с нанесенной на них »ИКС-графикой» соседствуют с орнаментом »под карбон» на экокоже с красной контрастной отстрочкой. Взаимное дополнение четырех типов материала и текстур, использованных в отделке, добавляет интерьеру контрастности и неповторимости. На спинках сидений под подголовниками вышит логотип Vesta Sport.

Рулевое колесо обтянуто мягкой перфорированной черной экокожей, с красной меткой «нулевой зоны» - как на гоночных болидах.

Аналогичные решения использованы в оформлении рукоятки МКПП и рычага стояночного тормоза: экокожа прострочена красной нитью, что улучшает эргономику, способствует надежному хвату.


Комфорт и безопасность

Система электронного контроля устойчивости (ESC) получила спортивные настройки: теперь электронный помощник срабатывает позже. Критичные значения ускорений, возникающих при прохождении поворота, увеличены на 35% для пологих и 50% для поворотов углом более 90 градусов. Это позволяет водителю с опытом спортивного стиля вождения пройти извилистую трассу с управляемым скольжением.

Кроме того, на Lada Vesta Sport ESC можно отключить полностью (на стандартных Lada Vesta ESC, даже будучи отключенной, автоматически активируется на скорости 50 км/ч).


Функция подсветки поворотов. Впервые в LADA введена функция подсветки поворотов: при вождении в темное время суток в зависимости от направления поворота включается левая или правая противотуманные фары.

Аэродинамика

Серия испытания в аэродинамической трубе АвтоВАЗа позволили сформировать оригинальные характеристики Lada Vesta Sport.

Улучшены температурные режимы двигателя. Кроме того, благодаря продувке моторного отсека температура воздуха на впуске не превышает 40 градусов - это способствует более эффективному наполнению цилиндров.

Задний спойлер - полный аналог спойлера, применяемого на гоночном автомобиле класса «Супер-продакшн».

Аэродинамика колесных дисков проработана для более эффективного охлаждения тормозных механизмов.

Подъемная сила на передней оси снижена с 33 до 7,8 кг.

Подъемная сила на задней оси снижена с 22,2 до 11,6 кг.

Шасси

Стойка передняя:

- диаметр штока увеличен с 20 до 22 мм. - диаметр рабочего цилиндра увеличен с 30 до 32 мм. - наружный диаметр корпуса стойки увеличен с 48 до 58 мм.

Амортизатор задний:

- диаметр штока увеличен с 12,4 до 14 мм. - внутренний диаметр рабочего цилиндра увеличен с 27 до 30 мм. - наружный диаметр корпуса увеличен с 40,9 до 45 мм.

Специализированные настройки шасси Lada Vesta позволили создать новый характер автомобиля. Острая управляемость сочетается с достаточной плавностью хода, формируя впечатление крепко сбитого, надежного автомобиля, который предназначен для динамического движения по асфальту любого качества.

Стойки и задние амортизаторы увеличенной размерности обеспечивают надежное и качественное демпфирование и стабильные характеристики необходимые для спортивной короткоходной подвески. Более крупные корпуса стоек и амортизаторов позволяют повысить объем рабочей жидкости, улучшить теплоотвод, увеличить срок службы клапанов.

Силовой агрегат

На Lada Vesta Sport применен мотор LADA 21179 объемом 1,8 л., прошедший форсировку с помощью хорошо зарекомендовавших себя в автоспорте технологий. При этом двигатель сохранил присущую атмосферным моторам с чугунным блоком цилиндров надежность, ремонтопригодность и умеренную требовательность к обслуживанию.


В двигателе Lada Vesta Sport применена перенастроенная система регулировки фаз газораспределения, а также:

- новые распределительные фалы с измененным профилем (увеличен подъем кулачков).

- оригинальные калибровки контроллера.

Купить Lada Vesta


В Мурманске состоится презентация новой LADA Granta

Новости | 30 08 2018, 14:44 | СеверПост

НА ПРАВАХ РЕКЛАМЫ


В Мурманске состоится презентация новой  LADA Granta - по-настоящему народного автомобиля, заслужившего признание тысяч автовладельцев. Амбициозный дизайн, непревзойдённая практичность, безопасность и комфорт по доступной цене. Это лишь малая часть достоинств новой LADA Granta,утверждают производители.

В Мурманске презентация новой LADA Granta состоится в ближайшее воскресенье 2 сентября в 14.00 в развлекательном комплексе «Огни Мурманска» на парковке рядом с кафе «Бочонок».

«Мы подготовили интересную развлекательную программу для детей и взрослых: соревнования на надувных аттракционах, подвижные игры, вкусные угощения. Все гости смогут принять участие в розыгрыше большого приза (автомобильный гаджет), а также получить  тематические подарки  от LADA», сообщают организаторы презентации.

Все желающие смогут пройти тест-драйв на LADA XRAY, LADA Vesta SW Crossи и New LADA Granta (открыта предварительная запись).

Подробности можно узнать в LADA ОЛИМП АВТО: пр.Кольский д. 110  тел. (8152) 69-02-70 (доб.1) сайт: https://olimp-avto.lada.ru,  группа ВК https://vk.com/lada_murmansk

Партнёр презентации:  Автомобильные охранные и телематические комплексы «Pandora/Pandect».  


Читайте также на СеверПост:  
В Мурманске произошло ДТП с участием полицейского автомобиля








Новости Лада (АвтоВАЗ) – Страница 164

На базе универсала Lada Largus создадут автомобиль для инвалидов24 мая 2016, 03:08Появилась информация о том, что АвтоВАЗ разрабатывает специальный автомобиль для инвалидов. Машина будет базироваться на платформе универсала Lada Largus.

Комплекс окраски АВТОВАЗа признан одним из лучших в Renault-Nissan23 мая 2016, 03:11Появилась информация о том, что комплекс покраски кузовов для платформы В0 на АвтоВАЗе признан одним из самых совершенных в альянсе Renault-Nissan.

В Израиле возобновятся продажи автомобилей Lada19 мая 2016, 03:04Официальный импортер автомобилей концерна Renault-Nissan – компания Carasso Motors – сообщила о своем намерении вернуть на авторынок Израиля продукцию российского бренда Lada.

«АвтоВАЗ» выпустит женскую версию Lada Kalina Sport17 мая 2016, 03:12Появилась информация о том, что дочернее предприятие российского гиганта АвтоВАЗ – Lada Sport – занято разработкой специальной «дамской» версии одной из спортивных моделей Lada, которая должна будет заинтересовать женскую целевую аудиторию.

Хэтчбек Lada XRay вошел в ТОП-20 самых популярных автомобилей РФ14 мая 2016, 03:06Согласно результатам продаж за апрель на российском автомобильном рынке, новый высокий хетчбэк Lada Xray попал в ТОП-15 наиболее популярных моделей, заняв 13-е место с показателем в 2.2 тыс. экземпляров.

Автостат: Продажи автомобилей АвтоВАЗ выросли впервые за два года11 мая 2016, 03:10Российский автомобильный гигант АвтоВАЗ в апреле 2016 года смог реализовать на отечественном рынке 24. 6 тысяч своих автомобилей. Это на 8% больше, чем за тот же месяц прошлого года.

Сотрудники АвтоВАЗа приступили к работе после майских каникул11 мая 2016, 03:04Производственные мощности компании АвтоВАЗ возобновили работу после длительных «каникул», которые продолжались с 29 апреля по 9 мая текущего года включительно.

Впервые за последние 1,5 года выросли продажи «АвтоВАЗа»05 мая 2016, 03:04Продажи автомобилей марки Lada в апреле этого года выросли в годовом сравнении. Такую информацию распространил руководитель одного из дилерских центров марки, ссылаясь на официальное письмо от автопроизводителя.

«АвтоВАЗ» планирует обновить Lada Kalina и Granta30 апреля 2016, 03:04Появилась информация о том, что в ближайшее время АвтоВАЗ запустит рестайлинг своих самых продаваемых моделей – Lada Granta и Kalina. Об этом сообщает российское издание «АвтоСреда» со ссылкой на собственные источники в отечественной компании.

«Заряженные» LADA оснастят роботизированной трансмиссией к лету29 апреля 2016, 03:10Компания Lada Sport, которая является дочерним предприятием АвтоВАЗа, наладит в начале лета текущего года производство спортивных моделей Lada с роботизированной коробкой передач.

Презентация новой модели LADA XRAY Cross поразила гостей чудесами природы и техники

3 ноября «Кострома-Лада-Сервис» объявил старт продаж кроссовера – LADA XRAY Cross.

3 ноября 2018 года дилерский центр «Кострома-Лада-Сервис» провел презентацию и объявил старт продаж новой модели кроссовера – LADA XRAY Cross, - сообщает корреспондент портала К1NEWS.RU

Гости окунулись в уникальную атмосферу "города-леса", где каждый желающий смог поучаствовать в мастер-классе по приготовлению венских и гонконгских вафель, пройти мастер-классы по изготовлению деревянных магнитов, сыграть в игры виртуальной реальности и выиграть призы. 

Для желающих были организованы тест-драйвы нового автомобиля.

А первых покупателей ждал приятный сюрприз - дополнительное оборудование в подарок от дилерского центра "Кострома-Лада-Сервис".

"Кострома-Лада-Сервис" показала воочию среду новой модели кроссовера LADA XRAY Cross.  Автомобиля способного подарить свободу не только в свершении новых открытий, но и бросить вызов неожиданным приключениям в любой среде.

Модель семейства Cross отличается атрибутами, присущими внедорожникам, и с точки зрения дизайна, и в плане технической составляющей. Она получила не только модный внешний вид и отличную управляемость, но и богатый набор нового оборудования, высокий уровень комфорта и проходимости.

Особый статус и внедорожные возможности LADA XRAY Cross подчеркиваются его дизайном. Развитый пластиковый обвес не только защищает эмаль кузова, но и формирует брутальный и стремительный облик.

«Дорожный просвет машины достиг рекордных для LADA 215 мм. Расширенная колея и специально разработанные 17-дюймовые колеса с шинами Continental так же внесли свой вклад в крепкий, уверенный стиль автомобиля. Для LADA XRAY Cross разработаны особые настройки силового агрегата и системы контроля устойчивости (ESC). Специальный селектор LADA Ride Select на панели приборов позволяет активировать алгоритмы работы шасси для преодоления снега, песка и грязи, а также спортивный режим для динамичного и безопасного вождения», - рассказал продавец-консультант «Кострома-Лада-Сервис» Сергей ЛЕБЕДЕВ.

Особое внимание при разработке LADA XRAY Cross уделено эргономике. На кроссовере введен обогрев руля, внедрена регулировка рулевого колеса по вылету, разработаны передние сиденья с развитой боковой поддержкой. С целью повышения функциональности спинка переднего пассажирского сиденья в сложенном состоянии вместе со спинкой заднего дивана образуют ровную площадку. 

LADA XRAY Cross выпускается в трех основных комплектациях – Classic, Comfort и Luxe, для которых доступны два пакета опций. 

Контакты: 

Адрес: г.Кострома,  ул. 2-я Волжская 14

Телефон:  41-61-41

Последние новости рубрики

18:40, 08 июня 2021

В Костроме проведены переговоры с учебными комбинатами о подготовке водителей электротранспорта. Об этом сообщает транспортное управление. В настоящее время обучиться…

17:30, 08 июня 2021

На улицах Костромы взяли пробы асфальта после выполнения работ в рамках нацпроекта «Безопасные и качественные дороги». Результаты оказались удовлетворительными. Исследование…

08:30, 08 июня 2021

В Костромской области состоится региональный турнир по вылову брошенных орудий лова и мусора «Чистые озера». Об этом сообщает Охотуправление ДПР…

Презентация новой LADA Granta — ШоуТайм, Рязань

Презентацию новой LADA Granta мы провели в пятницу 14 сентября 2018 года на улице Почтовой. Вот как это было:

Какие площадки и активности мы предложили гостям мероприятия? Для самых маленьких — мастер-класс по разукрашиванию в технике эбру. Дети с удовольствием разукрашивали листики, сердечки и лого LADA:

Для гостей постарше работал наш онлайн-тест на знание преимуществ и особенностей новой LADA Granta. Гости попадали в онлайн-тест с помощью qr-кодов, размещенных на банерах мероприятия. Те, кто правильно ответил на вопросы теста, получали призы в режиме реального времени.

Сейчас, когда мероприятие закончилось, пройти наш тест можете и вы! Жмите вот сюда, и не забывайте посмотреть правильные ответы в самом конце.

Кроме того, каждый желающий мог сфотографироваться в нашей фотозоне и через некоторое время получить свою фотографию на магните.

 

Призы, предоставленные заказчиком, разыгрывались и с помощью нашего знаменитого лототрона, одного из самых больших в Рязани:

В целом же получилось весело, динамично и атмосферно!

Посмотреть backstage этого мероприятия

Фото Дмитрия Вороширина

Немного истории наших взаимоотношений с брендом LADA: две презентации Vesta и презентация X-RAY

С чего мы начинаем подготовку любого мероприятия?

Как всё организовать, пошаговая инструкция.

Пример того, как работает хорошая идея при относительно небольшом бюджете.
Выбрать артиста на праздник в любой город центра России.
Пятнадцать бесплатных идей для проведения юбилея — здесь.
Если вы любите праздники в стилистике СССР — вам сюда и сюда.
Основные заблуждения заказчиков при организации мероприятий мы систематизировали тут.

Наш тимбилдинг.
Как мы устроены.
Как узнать, что мы вам не подходим…

 

В Удмуртии прошла презентация новой модели «Лада Гранта» ВИДЕО

14.05.2014 — 18:53 1249 просмотров

A A A

В Удмуртии сегодня прошла презентация новой модели «Лада Гранта». Пример того, как работают привлеченные инвестиции. Ижевский автозавод стал единственным предприятием Автоваза, где будут выпускать модель в кузове лифтбек.

В этом цехе Ижевского автозавода собирают новую модель «Лада Гранта Лифтбек». В таком кузове автомобиль будут выпускать только в Удмуртии. До презентации остаются считанные минуты. Руководство Автоваза и ИжАвто рассказывают исполняющему обязанности Главы республики, что в первом квартале рабочих мест на предприятии стало больше.

Александр Соловьёв благодарит и рабочих завода и инвестора за то, что предприятие работает, увеличивает объемы производства. Сегодня на ИжАвто собирают 40 автомобилей в год на каждого работающего. Цель — поднять производительность до 60 машин. И новая модель «Лады Гранта» должна внести свой вклад в это развитие.

Бу Инге Андерссон, президент ОАО «Автоваз»: «Мы будем и дальше работать над качеством наших автомобилей. Сегодня в России порядка 15 млн приверженцев марки «Лада». Среди них большой процент лояльных именно к «Ладе Гранта». Для них мы представляем сегодня новую модель. Мы рассчитываем, что её потребителями станут те приверженцы марки, кто рассматривает «Ладу Гранта Лифтбек» как замену автомобилю «Лада Самара».

Михаил Рябов, директор Ижевского автомобильного завода: «Если говорить о лифтбэке, то для нас это, прежде всего, серьёзная ответственность, потому что, как сказал г-н Андерсон, высокие ставки на этот автомобиль. И мы, естественно, должны быть, прежде всего, конкурентоспособными».

С мая автозавод серьёзно увеличил объемы производства. 3 300 машин в мае против 800 в апреле. В 2014-м запланирован выпуск 47 000 лифтбеков. Через 4 месяца ИжАвто запускает в производство первую модель «Ниссана», в январе будущего года — вторую. В 2015-м с конвейера сойдет «Рено». Таковы планы.

Тест-драйвы новой модели начнутся завтра по всей России. Руководство Удмуртии, между тем, ставит задачу перед Правительством: создать в республике кластер автокомпонентов и локализовать производство комплектующих.

Моя Удмуртия

Хотите поделиться этой новостью?

Читайте также:

PPT - презентация PowerPoint с переносом энергии резонанса флуоресценции (FRET) | бесплатно скачать

PowerShow.com - ведущий веб-сайт для обмена презентациями и слайд-шоу. Независимо от того, является ли ваше приложение бизнесом, практическими рекомендациями, образованием, медициной, школой, церковью, продажами, маркетингом, онлайн-обучением или просто для развлечения, PowerShow. com - отличный ресурс. И, что лучше всего, большинство его интересных функций бесплатны и просты в использовании.

Вы можете использовать PowerShow.com, чтобы найти и загрузить примеры онлайн-презентаций PowerPoint ppt практически на любую тему, которую вы можете вообразить, чтобы вы могли узнать, как улучшить свои собственные слайды и презентации бесплатно.Или используйте его, чтобы найти и загрузить высококачественные практические презентации PowerPoint ppt с иллюстрированными или анимированными слайдами, которые научат вас делать что-то новое, также бесплатно. Или используйте его для загрузки собственных слайдов PowerPoint, чтобы вы могли поделиться ими со своими учителями, классом, студентами, руководителями, сотрудниками, клиентами, потенциальными инвесторами или всем миром. Или используйте его для создания действительно крутых слайд-шоу из фотографий - с двухмерными и трехмерными переходами, анимацией и музыкой на ваш выбор - которыми вы можете поделиться со своими друзьями в Facebook или в кругах Google+. Это тоже бесплатно!

За небольшую плату вы можете получить лучшую в отрасли конфиденциальность в Интернете или публично продвигать свои презентации и слайд-шоу с высокими рейтингами. Но в остальном это бесплатно. Мы даже преобразуем ваши презентации и слайд-шоу в универсальный формат Flash со всей их оригинальной мультимедийной красотой, включая анимацию, эффекты перехода 2D и 3D, встроенную музыку или другой звук или даже видео, встроенное в слайды. Все бесплатно. Большинство презентаций и слайд-шоу на PowerShow.com доступны для просмотра, многие даже можно бесплатно загрузить. (Вы можете выбрать, разрешить ли людям загружать ваши оригинальные презентации PowerPoint и слайд-шоу из фотографий за плату или бесплатно или вовсе.) Зайдите на PowerShow.com сегодня - БЕСПЛАТНО. Здесь действительно есть что-то для каждого!

презентации бесплатно. Или используйте его, чтобы найти и загрузить высококачественные практические презентации PowerPoint ppt с иллюстрированными или анимированными слайдами, которые научат вас делать что-то новое, также бесплатно. Или используйте его для загрузки собственных слайдов PowerPoint, чтобы вы могли поделиться ими со своими учителями, классом, студентами, руководителями, сотрудниками, клиентами, потенциальными инвесторами или всем миром.Или используйте его для создания действительно крутых слайд-шоу из фотографий - с двухмерными и трехмерными переходами, анимацией и музыкой на ваш выбор - которыми вы можете поделиться со своими друзьями в Facebook или в кругах Google+. Это тоже бесплатно!

За небольшую плату вы можете получить лучшую в отрасли конфиденциальность в Интернете или публично продвигать свои презентации и слайд-шоу с высокими рейтингами. Но в остальном это бесплатно. Мы даже преобразуем ваши презентации и слайд-шоу в универсальный формат Flash со всей их оригинальной мультимедийной красотой, включая анимацию, эффекты перехода 2D и 3D, встроенную музыку или другой звук или даже видео, встроенное в слайды.Все бесплатно. Большинство презентаций и слайд-шоу на PowerShow.com можно бесплатно просматривать, многие даже можно бесплатно загрузить. (Вы можете выбрать, разрешить ли людям загружать ваши оригинальные презентации PowerPoint и слайд-шоу из фотографий за плату или бесплатно или вовсе.) Зайдите на PowerShow.com сегодня - БЕСПЛАТНО. Здесь действительно есть что-то для каждого!

Введение в технологию флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET) и ее применение в биологических науках

Автор : Пол Хелд, Ph.D, Отдел приложений, BioTek Instruments

Флуоресцентный резонансный перенос энергии (FRET) - физическое явление, впервые описанное более 50 лет назад, которое сегодня все чаще используется в биомедицинских исследованиях и открытии лекарств. FRET основан на зависящей от расстояния передаче энергии от молекулы-донора к молекуле-акцептору. Из-за своей чувствительности к расстоянию FRET использовался для исследования молекулярных взаимодействий. FRET - это безызлучательная передача энергии от молекулы-донора к молекуле-акцептору.Молекула-донор - это краситель или хромофор, который первоначально поглощает энергию, а акцептор - это хромофор, которому впоследствии передается энергия. Это резонансное взаимодействие происходит на расстояниях, превышающих межатомные расстояния, без преобразования в тепловую энергию и без каких-либо столкновений молекул. Передача энергии приводит к уменьшению интенсивности флуоресценции донора и времени жизни возбужденного состояния, а также к увеличению интенсивности излучения акцептора. Пару молекул, которые взаимодействуют таким образом, что возникает FRET, часто называют парой донор / акцептор.

Несмотря на то, что на FRET влияет множество факторов, основных условий, которые должны быть соблюдены для возникновения FRET, относительно немного. Молекулы донора и акцептора должны находиться в непосредственной близости друг от друга (обычно 10–100 Å). Спектр поглощения или возбуждения акцептора должен перекрывать спектр излучения флуоресценции донора (рис. 1). Степень их перекрытия называется спектральным интегралом перекрытия (J). Ориентации диполей донорного и акцепторного переходов должны быть примерно параллельны.Если предположить, что донорно-акцепторные пары совместимы, наиболее важным элементом, необходимым для возникновения FRET, является близость пар. Фёрстер продемонстрировал, что эффективность процесса (E) зависит от обратного шестого расстояния между донором и акцептором (см. Уравнение 1). [1]

Уравнение 1. E = Ro 6 / (Ro 6 + r 6 )

Где Ro - расстояние Ферстера, на котором передается половина энергии, а r - фактическое расстояние между донором и акцептором.Расстояние, на котором передача энергии эффективна на 50%, называется радиусом Ферстера (Ro). Величина Ro зависит от спектральных свойств донора и акцептора. Расстояние Ферстера от 20 до 90 Å наиболее полезно для изучения биологических макромолекул. Эти расстояния сопоставимы с диаметрами многих белков, толщиной биологических мембран и расстояниями между сайтами на мультисубъединичных белках. Любой процесс, который влияет на скорость передачи энергии, позволяет количественно оценить процесс.В результате FRET часто называют спектроскопической линейкой. Обратите внимание, что расстояние Ферстера (Ro) зависит от ряда факторов, включая квантовый выход флуоресценции донора в отсутствие акцептора (fd), показатель преломления раствора (n), дипольную угловую ориентацию каждой молекулы. (k2) и спектральный интеграл перекрытия донора и акцептора (J). См. Уравнение 2.

Уравнение 2. Ro = 9,78 x 10 3 (n -4 * fd * k 2 * J) 1/6 Å

Рисунок 1.Схематическое изображение интеграла перекрытия спектров

В качестве примера влияния расстояния на эффективность передачи энергии можно использовать некоторые произвольные числа для расстояния Ферстера (Ro) и фактического расстояния (r). Если Ro произвольно задан равным 1 (Ro = 1), и расстояние между донором и акцептором также равно 1, тогда r = Ro, и уравнение эффективности будет E = 1 6 / (1 6 + 1 6 ), что равно 0.5 (т.е. 50%). Эта половина максимального значения и есть то, что определяется как расстояние Фёрстера. Если расстояние в 10 раз меньше (например, r = 0,1Ro), то E = 1 6 / (1 6 + 0,1 6 ) = 0,999999, что значительно эффективнее. Однако, если расстояние между донором и акцептором в 10 раз больше (т.е. r = 10Ro), то E = 1 6 / (1 6 + 10 6 ) = 0,0000001. Эта чрезвычайная чувствительность к расстоянию - это то, что позволяет использовать FRET для экспериментов с приближением.

Обычно донорная и акцепторная части различаются, и в этом случае FRET можно обнаружить по появлению флуоресценции акцептора или по тушению донорной флуоресценции. Зонд-донор всегда представляет собой флуоресцентную молекулу. Обратите внимание, что люминесцентные молекулы ведут себя как флуоресцентные молекулы в отношении своего излучения. При соответствующем возбуждении его электроны перескакивают из основного состояния (So) на более высокий колебательный уровень. Очень быстро (в течение пикосекунд) эти электроны распадаются на самые низкие колебательные уровни (S1) и, в конечном итоге, распадаются (в течение наносекунд) обратно в состояние So, и излучается фотон света.Когда выполняются условия для возникновения FRET, затухание флуоресценции донора и передача энергии акцептору будут конкурировать за спад энергии возбуждения. При резонансной передаче энергии фотон НЕ излучается, а энергия передается молекуле-акцептору, электроны которой, в свою очередь, возбуждаются, как описано для молекулы-донора. При последующем возврате в основное состояние излучается фотон (рис. 2).

Рис. 2. Схематическое изображение состояний колебательной энергии электрона, возникающих во время FRET.

Измерение

Обнаружение и количественное определение FRET, безусловно, может быть выполнено множеством различных способов. Поскольку FRET может приводить как к уменьшению флуоресценции молекулы донора, так и к увеличению флуоресценции акцептора, может быть выполнено определение метрики соотношения двух сигналов. Преимущество этого метода заключается в том, что измерение взаимодействия не зависит от абсолютной концентрации датчика.Поскольку не все акцепторные части являются флуоресцентными, их можно использовать в качестве средств для гашения флуоресценции. В этих случаях те взаимодействия, которые приводят к тому, что флуоресцентная донорная молекула приближается к такой молекуле, могут привести к потере сигнала. И наоборот, реакции, устраняющие близость флуоресцентного донора и тушителя, могут привести к увеличению флуоресценции. Одним из таких примеров могут быть анализы протеазы. Эти анализы обычно включают флуоресцентный фрагмент на одном конце и гасящую молекулу на другом конце, разделенные пептидом, содержащим последовательность расщепления протеазой.

Некоторые примеры

Генетически кодируемые флуоресцентные красители, такие как зеленый флуоресцентный белок (GFP) и родственные молекулы синего, голубого, желтого и красного цветов, обеспечивают способность выполнять FRET in vitro, особенно в живых клетках [2]. Эти белки образуют пары FRET друг с другом, а также с обычными красителями. Они могут быть связаны с другими белками генетически или ковалентно, но при этом сохранять свою флуоресцентную способность. Эти красители могут быть генетическими элементами, которые могут быть связаны с другими генами с образованием химерных белков.Эти химерные белки содержат GFP (или связанный с ним флуоресцентный белковый элемент) и предполагаемый связывающий домен. С различными химерными белками (один донор и один акцептор) можно исследовать белок-белковые взаимодействия. Только тогда, когда пары донор / акцептор взаимодействуют посредством белок-белковых взаимодействий, возникает FRET. (Рисунок 3)

Рис. 3. Схематическое изображение взаимодействия двух различных флуоресцентных белковых химер. Белок-белковые взаимодействия между белками, помеченными A и B, приводят к тому, что синий флуоресцентный белок и зеленый флуоресцентный белок находятся на достаточно близком расстоянии, чтобы обеспечить возникновение FRET.В этом примере возбуждение синего флуоресцентного белка приводит к испусканию флуоресценции зеленым флуоресцентным белком.

Органические цианиновые красители Cy3, Cy5, Cy5.5 и Cy7, которые излучают в красном диапазоне (> 550 нм), обладают рядом преимуществ. Их диапазон излучения таков, что часто снижается фоновая флуоресценция. Кроме того, большие расстояния (> 100 Å) могут быть измерены в результате высоких коэффициентов экстинкции и хороших квантовых выходов. Даже донорно-акцепторные пары с разделенными спектрами излучения (т.е. низкий интеграл перекрытия) приводят к приемлемым расстояниям Фёрстера. Например, Cy3, который излучает максимум на 570 нм, и Cy5, который излучает на 670 нм, имеют расстояние Ферстера> 50 Å. Большое расстояние между парами позволяет измерять излучение акцептора в результате FRET без помех от излучения донора. Кроме того, эти молекулы могут быть связаны непосредственно с определенными участками в синтетически полученных нуклеиновых кислотах, что позволяет использовать FRET для оценки отжига нуклеиновых кислот.

Рисунок 4.Схематическое изображение FRET, возникающего между флуоресцентными фрагментами Cy3 и Cy5 при отжиге меченых олигонуклеотидов.

В примере, изображенном на фиг. 4, два комплементарных олигонуклеотида РНК помечены Cy3 и Cy5 соответственно. Когда эти меченые молекулы не отжигаются (рис. 4A), возбуждение РНК-олигонуклеотида, меченного Cy3, светом с длиной волны 540 нм приводит только к испусканию света Cy3 с длиной волны 590 нм, в то время как комплементарная РНК-олиго, меченная Cy5, не излучает любой свет с длиной волны 590 нм или его истинная длина волны излучения 680 нм.Однако, когда двум олигонуклеотидам позволяют отжигаться, непосредственная близость молекул позволяет происходить переносу FRET. Это приводит к испусканию света с длиной волны 680 нм, когда отожженная молекула возбуждается светом с длиной волны 540 нм. Обратите внимание, что не все излучение Cy3 на длине волны 590 нм теряется, но значительная его часть теряется.

Рис. 5. Схематическая диаграмма активности FRET, используемой ВСП

Зонды с датчиками напряжения

(VSP) - это технология анализа на основе флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET), используемая для обнаружения лекарств с высокопроизводительным ионным каналом.Донор FRET представляет собой связанный с мембраной кумарин-фосфолипид (CC2-DMPE), который связывается только с внешней стороной клеточной мембраны. Акцептор FRET представляет собой мобильный, отрицательно заряженный, гидрофобный оксонол [либо DiSBAC 2 (3), либо DiSBAC 4 (3)], который будет связываться с любой стороной плазматической мембраны в ответ на изменения мембранного потенциала (рис. 5). В ВСП используется зависимость от расстояния. FRET может иметь место только тогда, когда акцептор DISBAC 2 (3) расположен на внешней стороне клеточной мембраны.Покоящиеся клетки обладают относительно отрицательным потенциалом, поэтому два зонда связываются с внешней стороной клеточной мембраны, что приводит к эффективному FRET. Возбуждение донорного зонда CC2-DMPE (при ~ 400 нм) генерирует сильный красный сигнал флуоресценции (при ~ 590 нм) от зонда-акцептора оксонола. Когда мембранный потенциал становится более положительным, как это происходит при деполяризации клеток, оксонольный зонд быстро перемещается (в субсекундном временном масштабе) на другую сторону мембраны (рис. 5). Таким образом, каждый оксонольный зонд «чувствует» и реагирует на изменения напряжения в ячейке.Эта транслокация разделяет пару FRET, поэтому возбуждение донорного зонда CC2-DMPE теперь генерирует сильный синий сигнал флуоресценции (при ~ 460 нм) от зонда CC2-DMPE. Ожидается, что деполяризация клетки, которая заставляет DISBAC 2 (3) перемещаться на внутреннюю сторону мембраны, приведет к снижению активности FRET.

Соединения лантанидов, такие как европий и тербий, эффективно используются в качестве доноров в реакциях FRET. Эти соединения обеспечивают очень хорошее соотношение сигнал / шум в результате их длительного периода полураспада флуоресценции и спектральных характеристик.Эмиссия этих соединений имеет резко пиковый профиль с большим стоксовским сдвигом от возбуждения. Кроме того, длительный период полураспада флуоресценции позволяет начать измерение после прекращения возбуждающего света. Задержка между возбуждением и измерением (диапазон мсек) позволяет рассеяться фоновой флуоресценции от молекулы органического акцептора с периодом полураспада в наносекундном диапазоне. Таким образом, при соответствующей задержке измеряется только донорно-акцепторная эмиссия.

Донорная молекула не всегда должна включать флуоресцентное соединение.Люминесцентные молекулы излучают фотоны очень похоже на флуоресценцию. Основное различие состоит в том, что электронное возбуждение не является результатом поглощения фотонов, а, скорее, высвобождением химической энергии, содержащейся в молекуле. Когда возбужденные электроны возвращаются к своему основному состоянию, энергия может быть высвобождена в виде фотона света или передана через RET молекуле-акцептору, если условия верны. Хотя количество молекул, которые можно использовать, более ограничено, эта технология имеет то преимущество, что отсутствует внешнее возбуждение молекулы акцептора.

Проблемы

При разработке экспериментов FRET необходимо учитывать ряд вопросов. Самая очевидная проблема - это близость. В зависимости от схемы анализа, непосредственная близость будет либо установлена, либо устранена во время анализа, что приведет к изменению сигнала, который можно измерить. Необходимо выбрать подходящие пары донор / акцептор. Пары должны иметь достаточное спектральное перекрытие для эффективной передачи энергии, но при этом иметь достаточную разницу в спектрах, чтобы их можно было отличить друг от друга.Выбор фильтров для выбора длины волны флуоресценции также имеет решающее значение для успеха или неудачи экспериментального обнаружения FRET. Фильтр возбуждения для донора должен иметь возможность избирательно возбуждать молекулу донора, сводя к минимуму прямое возбуждение молекулы акцептора. Загрязняющее прямое возбуждение акцепторной молекулы можно учесть с помощью соответствующих контролей, но большие количества затрудняют интерпретацию данных. Как показано на рисунке 1, фильтры, используемые для возбуждения Cy3, минимизировали возбуждение Cy5, обеспечивая при этом достаточный сигнал возбуждения для Cy3.

Еще одна важная проблема, связанная с обнаружением FRET, связана с концентрацией аналита. Только те молекулы, которые взаимодействуют друг с другом, приведут к FRET. Если присутствуют большие количества донорных и акцепторных молекул, но они не взаимодействуют, количество происходящего FRET будет довольно низким. В этом примере, хотя донорные и акцепторные молекулы могут быть очень легко обнаружены по отдельности, фактического количества активности FRET может быть недостаточно для обнаружения. Что касается FRET, фактически измеряемым «аналитом» являются пары донор / акцептор, а не отдельные компоненты.Кроме того, как донорные, так и акцепторные молекулы должны иметь достаточную концентрацию для того, чтобы FRET имел место. Большинство связывающих событий - это динамический процесс, который достигает устойчивого состояния. Если одного из компонентов реакции не хватает, то общее связанное количество будет естественно низким. Например, временные трансфекции с двумя разными генетическими элементами, которые приводят к тому, что один из элементов не эффективно транслируется в белок, приведут к низким уровням FRET. Клеточная локализация также может иметь значение.Если одна молекула находится в цитоплазме, а другая - в ядре, взаимодействия друг с другом не будет, несмотря на достаточное количество каждой из них.

Приложения FRET

  • Структура и конформация белков [3]
  • Пространственное распределение и сборка белков [4]
  • Взаимодействие рецептор / лиганд [5]
  • Иммуноанализ [6]
  • Структура и конформация нуклеиновых кислот [7]
  • ПЦР в реальном времени и определение SNP [8,9]
  • Гибридизация нуклеиновых кислот [10]
  • Распределение и транспорт липидов [11]
  • Анализы слияния мембран [12]
  • Определение потенциала мембраны [13, 14]
  • Анализ флуорогенных протеаз [15]
  • Индикаторы циклического AMP [16]

Узнать больше о Synergy HTX
Многорежимный считыватель

Список литературы

  1. Förster, T.(1948) Межмолекулярная миграция энергии и флуоресценция Ann. Phys 2: 55-75.
  2. Tsien, R. (1998) Ann. Обзор Biochem, 67: 509-544
  3. Jonsson T, Waldburger CD, Sauer RT, (1996) Нелинейные отношения свободной энергии в разворачивании репрессора дуги подразумевают существование нестабильных, нативных промежуточных продуктов сворачивания. ". Biochemistry 35: 4795-4802.
  4. Watson BS, Hazlett TL, Eccleston JF, Davis C, Jameson DM, Johnson AE. (1995) Расположение макромолекул в аминоацил-тРНК.фактор элонгации Tu.GTP тройной комплекс. Исследование передачи энергии флуоресценции. Биохимия 34: 7904-7912
  5. Berger W, Prinz H, Striessnig J, Kang HC, Haugland R, Glossmann H. (1994) Сложный молекулярный механизм связывания дигидропиридина с Ca (2 +) - каналами L-типа, выявленный с помощью резонансной передачи энергии флуоресценции. Биохимия 33: 1875-11883.
  6. Ханна П.Л., Ульман Э.Ф. (1980) 4 ', 5'-Диметокси-6-карбоксифлуоресцеин: новый диполь-дипольный акцептор переноса энергии флуоресценции, полезный для флуоресцентных иммуноанализов.Анал Биохим 108: 156-161.
  7. Клегг Р.М., Мурчи А.И., Лилли Д.М. (1994) Структура раствора четырехстороннего соединения ДНК в условиях с низким содержанием соли: анализ флуоресцентного резонансного переноса энергии. Biophys J 66: 99-109.
  8. Ли Л.Г., Ливак К.Дж., Мулла Б., Грэм Р.Дж., Винаяк Р.С., Вуденберг TM. (1999) Семицветное, однородное обнаружение шести продуктов ПЦР. "Biotechniques 27: 342-349.
  9. "
  10. Мякишев М.В., Хрипин Ю., Ху С., Хамер Д.Х. 2001) Высокопроизводительное генотипирование SNP с помощью аллель-специфической ПЦР с универсальными праймерами, меченными переносом энергии.Genome Res 11: 163-169.
  11. Parkhurst KM, Parkhurst LJ. (1995) Кинетические исследования резонансного переноса энергии флуоресценции с использованием олигонуклеотида с двойной меткой: гибридизация с олигонуклеотидным комплементом и одноцепочечной ДНК. Биохимия 34: 285-292.
  12. Николс JW, Пагано RE. (1983) Анализ резонансной передачи энергии белково-опосредованного переноса липидов между везикулами. J Biol Chem 258: 5368-5371.
  13. Uster PS (1993) Микроскопия резонансного переноса энергии in situ: мониторинг слияния мембран в живых клетках.Методы Энзимол. 221: 239-246.
  14. Hoffman, R. и Held, P. Примечание по применению BioTek.
  15. Gonzalez JE, Tsien RY. (1995) Измерение напряжения путем резонансного переноса энергии флуоресценции в отдельных клетках. Biophys J 69: 1272-1280.
  16. Matayoshi ED, Wang GT, Krafft GA, Erickson J. (1990) Новые флуорогенные субстраты для анализа ретровирусных протеаз с помощью резонансной передачи энергии ». Science 247, 954-958.
  17. . Адамс С.Р. и др. (1993) Оптические зонды для циклического AMP, флуоресцентные и люминесцентные зонды для определения биологической активности, Mason W.T., Ed.С. 133-149.

Флуоресцентные белки 101: Введение в FRET

Представьте себе возможность определить, находятся ли два белка в пределах 10 нанометров друг от друга, или измерить натяжение спиральной структуры паучьего шелка или активность белка в синапсе. Какие инструменты позволяют нам измерять эти свойства и какие увлекательные эксперименты могут продвинуть эти инструменты еще дальше? Все это можно сделать с помощью FRET! Прочтите, чтобы узнать больше об этой удивительной технике визуализации и найти дополнительные советы по использованию FRET в ваших экспериментах здесь.

Что это за FRET, о котором вы говорите?

F örster R esonance E nergy T ransfer (FRET) был первоначально описан Теодором Фёрстером в 1948 году как вариант более часто наблюдаемого излучения света при флуоресценции. Широкое распространение FRET с флуоресцентными молекулами, включая флуоресцентные белки, привело к альтернативному сокращению F luorescence R esonance E nergy T ransfer.В отличие от типичного возбуждения и испускания возбужденного флуорофора, FRET включает безызлучательный перенос энергии (т. Е. Отсутствие испускаемых фотонов) от возбужденного донорного флуорофора к акцепторному флуорофору. Типичные шаги в FRET:

1. Возбуждение донорного флуорофора поглощением фотона

2. Передача энергии от возбужденного донора непосредственно к акцепторному флуорофору - представьте его как виртуальный фотон

3. Релаксация акцепторного флуорофора обратно в его основное состояние путем испускания фотона с длиной волны, специфичной для акцептора

Для появления FRET необходимо соблюдение нескольких ограничений.Донорные и акцепторные флуорофоры должны быть совместимы, так чтобы спектр излучения донорного флуорофора перекрывался со спектром возбуждения акцепторного флуорофора. В противном случае переданная от донора энергия не сможет возбудить акцептор. Помимо достаточного спектрального перекрытия, флуорофоры должны располагаться в пределах 1-10 нм друг от друга и быть ориентированы соответствующим образом для передачи энергии посредством диполь-дипольного взаимодействия.

Эффективность FRET может быть измерена для данной пары донор-акцептор, и изменение эффективности FRET коррелирует с изменением расстояния и / или ориентации пары FRET.Поскольку многие биологические процессы происходят в типичном диапазоне FRET, эффективность FRET используется для вывода о взаимодействии между флуорофорами и служит в качестве мелкомасштабной линейки для измерения расстояний, которые слишком малы для обычной световой микроскопии.

Don't FRET - Используйте вместо этого эти ресурсы FRET!

Поскольку выбор пар флуорофоров является ключевым моментом в эксперименте FRET, возможности могут показаться ошеломляющими, учитывая большой ассортимент доступных флуоресцентных белков.К счастью, в нескольких отличных обзорах собраны данные из разных статей, чтобы облегчить принятие решения.

1. Мюллер, Сара М., et al. «Количественная оценка резонансной передачи энергии Ферстера путем мониторинга сенсибилизированного излучения в живых растительных клетках». (2013). PubMed PMID: 24194740. Центральный PMCID PubMed: PMC3810607.

2. Bajar, Bryce T., et al. «Руководство по парам флуоресцентных белков FRET». Датчики 16.9 (2016): 1488. PubMed PMID: 27649177. Центральный PMCID PubMed: PMC5038762.

3. Джордж Абрахам, Бобин и др. «Пары FRET на основе флуоресцентных белков с улучшенным динамическим диапазоном для измерения времени жизни флуоресценции». PloS one 10.8 (2015): e0134436. PubMed PMID: 26237400. Центральный PMCID PubMed: PMC4523203.

Многие пустые векторы, содержащие эти флуоресцентные белки, доступны на нашей странице ресурсов FRET и могут использоваться для создания слияний с интересующим геном. Эти плазмиды будут наиболее полезны для конструирования межмолекулярных зондов FRET, где донорные и акцепторные флуорофоры сливаются с двумя отдельными белками.(Напротив, внутримолекулярные зонды FRET содержат донорный и акцепторный флуорофор на одном и том же белке и полезны, когда процесс влияет на конформацию зонда. Подробнее об этих биосенсорах позже). Эксперименты с использованием межмолекулярных зондов FRET обычно используются для изучения межмолекулярных взаимодействий путем измерения изменения эффективности FRET, из чего можно сделать выводы о близости двух белков.

Межмолекулярный FRET может быть экспериментально труднодостижим, поскольку соотношение акцепторных и донорных слияний зависит от эффективности трансфекции, и любые неспаренные флуоресцентные белки могут вносить дополнительный шум в измерения.Если расстояние или ориентация донорного и акцепторного белков не оптимальны, FRET может не возникать или обнаруживаться, даже если два белка образуют комплекс.

Чтобы помочь устранить неполадки в вашей экспериментальной установке как потенциальный источник ошибки в неоптимальном или необнаруживаемом FRET, хорошо охарактеризованные эталонные стандарты FRET могут использоваться для проверки измерений FRET и служить типом положительного контроля. В случае неблагоприятной донорно-акцепторной ориентации, ограничивающей эффективность FRET, круговая перестановка (Baird et al., 1999) флуоресцентного белка (т.е. перестановка начального и конечного положений без изменения порядка аминокислот в белке) может повысить эффективность FRET.

Перед созданием собственного зонда FRET попробуйте поискать в PubMed статьи, описывающие инструмент FRET, который вы ищете, и также просмотрите наш тщательно подобранный список биосенсоров, так как другая лаборатория, возможно, уже создала сенсор, который вам нужен. Биосенсоры FRET, предназначенные для измерения специфических малых биомолекул или активности генов, часто являются внутримолекулярными зондами, поскольку линкерная последовательность между донором и акцептором чувствительна к изменению окружающей среды, которое влияет на эффективность FRET.Обнаружение определенных клеточных изменений с помощью межмолекулярного зонда часто либо непрактично (для биомолекул, не являющихся белками), либо нарушает эндогенное состояние, которое вы хотите измерить (сверхэкспрессия гена или белка после трансфекции).

Будущее FRET

Первый генетически закодированный биосенсор FRET, Cameleon (Miyawaki et al., 1997), был разработан для измерения внутриклеточного кальция и опубликован в 1997 году. С тех пор многочисленные достижения в области дизайна зондов, флуоресцентных белков и оборудования для микроскопии расширили возможности лабораторий. чтобы ответить на сложные вопросы о клеточных процессах.В настоящее время эксперименты FRET позволяют исследовать белок-белковые взаимодействия, измерять концентрацию или активность малых молекул, обнаруживать клеточные процессы и сигнальные каскады, количественно определять механическое напряжение (молекулярную «пружину») (Meng et al., 2008) и контролировать нейронную активность. (датчики напряжения) и многие другие.

Найдите множество биосенсоров на основе FRET на страницах биосенсоров Addgene

Недавние инновации продемонстрировали использование одномолекулярного FRET для визуализации биомолекул в живых клетках (Sustarsic and Kapanidis 2015), что может привести к мониторингу этих процессов у живых животных (Hirata and Kiyokawa 2016) и микроскопии молекулярного натяжения (MTM). , который может отслеживать физические нагрузки или даже применять силы (Gayrard and Borghi, 2016) к выбранному белку.Преодоление текущих ограничений, позволяющих использовать несколько биосенсоров FRET одновременно, еще больше увеличит количество коррелированной информации, доступной из клеточного процесса. Ожидается, что эксперименты FRET будут и дальше способствовать нашему пониманию болезней и даже помогут в открытии лекарств.


Список литературы

1. Baird, Geoffrey S., et al. «Круговая перестановка и вставка рецептора в зеленые флуоресцентные белки». Труды Национальной академии наук 96.20 (1999): 11241-11246. PubMed PMID: 10500161. PubMed Central PMCID: PMC18018.

2. Miyawaki, Atsushi, et al. «Флуоресцентные индикаторы Ca2 + на основе зеленых флуоресцентных белков и кальмодулина». Nature 388.6645 (1997): 882. PubMed PMID: 9278050.

3. Meng, Fanjie, et al. «Датчик механического напряжения на основе передачи энергии флуоресценции для конкретных белков in situ». Журнал FEBS 275.12 (2008): 3072-3087. PubMed PMID: 18479457. Центральный PMCID PubMed: PMC2396198.

4. Сустарсич, Марко и Капанидис, Ахиллефс Н. «Уводя правителя в джунгли: одномолекулярный FRET для понимания биомолекулярной структуры и динамики живых клеток». Текущее мнение в структурной биологии 34 (2015): 52-59. PubMed PMID: 26295172.

5. Хирата, Эйшу, и Киёкава, Эцуко. «Перспективы одномолекулярных биосенсоров FRET и прижизненной микроскопии FRET». Биофизический журнал 111.6 (2016): 1103-1111. PubMed PMID: 27475975.

6. Гейрар, Шарлен и Борги, Николя. «Микроскопия молекулярного натяжения на основе FRET». Методы 94 (2016): 33-42. PubMed PMID: 26210398.

Дополнительные ресурсы в блоге Addgene

Дополнительные ресурсы на Addgene.org

Обзор

: презентация гитар McNally OM Celtic Ivy | Guitar.com

Кьяран МакНалли начал свою карьеру мастером в нежном возрасте 16 лет, обучаясь в Lagan Lutherie School в Северной Ирландии.В свои 29 лет МакНелли провел промежуточные годы, работая в двух самых престижных акустических заведениях Великобритании - Lowden Guitars в Даунпатрике и Atkin Guitars в Кентербери. МакНелли сейчас строит независимо от своей мастерской в ​​Крейгавоне, графство Арма, и хотя на сегодняшний день он сделал более 300 полных инструментов за свою карьеру и приложил руку к более чем 1000 сборок, наша обзорная гитара - только 45-я гитара, созданная под его собственным именем. .

Учитывая количество гитар среднего размера на верстаках мастеров по всему миру, название Orchestra Model теперь может означать что угодно, от ультратрадиционного инструмента в стиле Мартина до футуристического произведения искусства в стиле Somogyi.Учитывая его родословную, неудивительно, что Кьяран МакНелли черпает вдохновение по обе стороны Атлантики, возможно, больше склоняясь к США. Эта элегантная гитара с немного более глубоким корпусом и сужающейся гривой, безусловно, больше похожа на Санта-Крус, Калифорния, чем на Назарет, Пенсильвания.

Сочетание деки из ели Адирондак с задней и боковыми поверхностями из орехового дерева может быть прекрасным в правильных руках, особенно при использовании в средних и больших корпусах. Мы нашли его наиболее эффективным в работе мастеров, сочетающих современные и традиционные техники, таких как легендарные гитары Вермонта с Froggy Bottom Guitars и, как мы узнаем, Кьяран МакНалли.

Сразу становится ясно, что Макнелли не только знает свое дело, но и хорошо разбирается в том, что работает в контексте его собственных гитар. Он также заботится о качестве - набор из английского ореха, выбранный для задней и боковых сторон (это Juglans regia для непосвященных, в отличие от более распространенных сортов Claro и черного ореха), превосходен, с глубоким трехмерным изображением и легкий золотисто-зеленый блеск на спине, который соответствует названию гитары. Кремово-белая дека Adirondack (обшитая запеченной европейской елью) безупречная и яркая с глубоким резонирующим пятном позади моста.

Но из-за отсутствия ламинатной конструкции гриф из красного дерева с 14 ладами выглядит так, как если бы его цвет и отделка могли быть получены от Lowden. Тем не менее, это более объемное сжатие, чем обычно бывает у Даунпатрика, с глубоким вырезом «ре», красиво заполняющим левую руку. Пятка начинает расширяться перед 12-м ладом, а сам гриф уже достиг глубины 26 мм на 10-м ладу. Он прочный, прочный и вдохновляющий, но мы хотели бы видеть что-то кроме одной боковой точки, обозначающей октаву.МакНалли, конечно, может вырезать любую форму шеи с помощью любых маркеров, которые вам нужны, если вы рассматриваете индивидуальный заказ.

Celtic Ivy OM, конечно же, получил свое название от сложной инкрустации с ушками, которые украшают всю накладку грифа из черного дерева с нежными усиками, идущими как на грифе, так и на розетке. Это плавный, органичный дизайн, сочетающий в себе элементы европейской и американской отделки, а единственный лист плюща, вставленный в скульптурный мост из черного дерева, является особенно приятным штрихом.Есть пара небольших участков, на которых можно использовать немного эбеновой пыли и суперклея, чтобы заполнить зазоры, но это мгновенная работа. Тема морского ушка усилена полностью отделкой сверху, сзади и по бокам сияющим радужным ушком.

Используется

McNally прибыл с ослабленными струнами для транспортировки, и простое доведение его до концертной высоты многое раскрывает о характере инструмента. Это мощная гитара, но она остается сбалансированной по регистру.Высокие частоты четкие и детализированные по длине грифа, а средние частоты - древесные и выразительные.

Walnut обычно придает нотам фундаментальность, и это, пожалуй, наиболее заметно в басовой реакции Celtic Ivy. Это не мягкий «вуумф» из области залива, вместо этого нас встречает стенторианский «бонг», который остается артикулированным и звучным до шеи, не подавляя остальной звуковой спектр.

Противоречие в Тонвуде, несомненно, имеет место, и нет недостатка в людях, отравленных Интернетом, которые отвергнут ель Адирондак как нуждающуюся во времени, чтобы раскрыться.Это может / иногда / быть правдой в контексте производственных инструментов, производимых в количестве, но в случае с McNally у нас есть яркий пример того, как квалифицированный мастер извлекает максимум из своих тщательно отобранных материалов, создавая гитару, которая звучит впечатляюще хорошо с первого дня.

DADGAD сразу же ощущается как естественная среда обитания Celtic Ivy, и эта гитара действительно сияет в измененных настройках. Быстрый отклик деки с легкими подкосами в сочетании с 25.4-дюймовая шкала делает этот инструмент незамедлительным и вдохновляющим для соло-фингера. Сложные аккорды звучат с серьезностью и грацией, а однотонные линии звучат достаточно мощно и сосредоточенно, чтобы их точка зрения не сопровождалась аккомпанементом. Что особенно важно для некоторых позиций, гайка имеет гладкую резьбу без острых углов.

Многие пытались убедительно соединить трансатлантические стили в искусстве, но немногие преуспели в мире кастомной акустической гитары - это интересная сцена, где клиенты часто тратят больше на модернизацию древесины, чем Кьяран МакНалли в настоящее время берет за готовый инструмент.Это также рынок, который требует высочайших стандартов подгонки и отделки, и есть еще некоторые возможности для улучшения более тонких аспектов исполнения этой гитары. Например, логотип грифа и инкрустация с именем производителя кажутся неуклюжими по сравнению с тонкой инкрустацией на остальной части инструмента, а на концах ладов можно использовать еще один поцелуй с напильником на высоких частотах, но это впечатляющий снимок в целом. Луки.

Основываясь только на звуке, модель McNally Orchestra, даже в полном формате презентации, представляет собой исключительное соотношение цены и качества.С его нынешней ценой неудивительно, что Кьяран поднимется дальше по служебной лестнице на акустической сцене - мы с нетерпением ждем, что он сделает дальше.

Презентация гитар McNally OM Celtic Ivy

Основные характеристики

  • ЦЕНА От 2650 фунтов стерлингов (5730 фунтов стерлингов согласно обзору), включая жесткий футляр
  • ОПИСАНИЕ 6-струнная акустическая гитара, произведенная в Северной Ирландии
  • BUILD OM презентационного качества из ели Адирондак с подпеченной европейской елью, фигурная спинка и боковые стороны из английского ореха, гриф из красного дерева с грифом из черного дерева, инкрустация «кельтский плющ» по всей поверхности грифа, спинка, боковые стороны и верхняя кромка морского ушка, накладки на переднюю часть грифа из черного дерева ( спереди и сзади), костяная гайка и седло, мост и булавки из черного дерева, переплет из черного дерева
  • HARDWARE Тюнеры Gotoh SG381 с кнопками из черного дерева
  • ДЛИНА ШКАЛА 25.4 дюйма / 645 мм
  • ШИРИНА ШЕИ 44,6 мм на гайке, 55,5 мм на 12 ладу
  • ГЛУБИНА ШЕИ 20 мм на первом ладу, 33,8 мм на 12 ладу
  • РАССТОЯНИЕ СТРУНЫ 38 мм на гайке, 58 мм на мосту
  • ВЕС 1,47 кг / 3,24 фунта
  • ОТДЕЛКА Глянцевый лак с кислотным катализатором (атлас на тыльной стороне шеи)
  • ЛЕВЫЕ РУЧКИ Да (без доплаты)
  • КОНТАКТЫ mcnallyguitars.com

Нравится? Попробуйте эти

  • Орех Lowden FM50 и ель ситкинская £ 5,135
  • Новый взгляд на Мартин OM-28 £ 2950
  • Модель
  • Turnstone TM от 6 500 £

Taylor PS12E 12 Fret Grand Concert Presentation Series

На этой гитаре играли и держали в руках на Летней выставке NAMM 2017, и на ней могут быть небольшие признаки использования.

* вы сейчас просматриваете серийный номер: 1103287102

Гитары Taylor's Presentation Series занимают отдельный класс. Их лучшие комплекты из кокоболо сочетаются с верхушками из ели ситка премиум-класса. Контурный подлокотник из черного дерева сочетает в себе красоту и комфорт игры. Среди других высококлассных деталей - красочная окантовка из paua, задний ремешок из кокоболо и изысканная инкрустация грифа из виноградной лозы в стиле модерн, дополненная элегантным фонариком на гриле и вставками на перемычке. Предлагаемая с тюнерами Gotoh Gold, костяным орехом и седлом, эта гитара является произведением искусства!

Характеристики :

  • Длина шкалы: 24 7/8 “
  • Гайка и седло: костяное
  • Крепление седла: CV с рельефным выступом
  • Крышка анкерного стержня: Ebony
  • Накладка 9: None
  • Накладка 9
  • Количество ладов: 20
  • Тюнеры: Taylor Gold
  • Корпус: Taylor Deluxe Hardshell Brown
  • Марка струн: Elixir Phosphor Bronze Light
  • Длина корпуса: 19 1/2 ”

Основные моменты

  • Длина шкалы: 24-7 / 8 "
  • Гайка и седло: кость
  • Крепление: CV с разгрузкой
  • Крышка анкерного стержня: черное дерево
  • Накладка: Нет
  • Количество ладов: 18
  • Тюнеры: Gotoh
  • Корпус: Taylor Deluxe Hardshell Brown
  • Марка струн: Elixir Phosphor Bronze HD Light
  • Длина корпуса: 19 1/2 "
  • Ширина корпуса: 15 "
  • Глубина корпуса: 4 3/8 дюйма
Тело
  • Переплет: Ebony
  • Верхняя поверхность: Глянец
  • Задняя конфигурация: 2 шт., Без клина
  • Отделка спинки: глянец
  • Размер розетки: одинарное кольцо, серия 900, переплет
  • Мостик Инкрустация: модерн
  • Отделка тыльной / боковой стороны: Глянец
  • Крепление подлокотника: черное дерево
  • Древесина ремешка: такая же, как корпус
  • Rosette Mat.: Paua
  • Пятна / солнечные лучи: Нет
  • Клин: Нет
Шея
  • Ширина горловины: 1-3 / 4 "
  • Накладка на гриф: модерн
  • Переплет грифа: Ebony
  • Обвязка каблука: черное дерево
  • Тип шейного шарнира: Шарф
  • Шея / Каблук: Тропическое красное дерево
  • Древесина грифа: Эбеновое дерево
  • Отделка горловины: Атлас
  • Длина каблука: 3-1 / 4 "
Peghead
  • Peghead Поверхность: глянец
  • Peghead Binding: черное дерево
  • Peghead Тип: Стандартный
  • Peghead Purfling: Нет
  • Накладка на переднюю бабку: черное дерево
  • Инкрустация Peghead: Nouveau
  • Логотип Peghead: Тейлор Перламутр
Другой
  • Бридж-штифты: Ebony w / Abalone Dots
  • Пуговицы: Золото
  • Внешний номер грифа: Paua
  • Обрезка кромок: Paua
читать дальше…

Крис Симмонс Установить Zero Fret….Требуется небольшая модификация.

Презентация на тему: «Крис Симмонс www.simmons-pagham.co.uk Установить Zero Fret…. Требуется небольшая модификация.» - Стенограмма презентации:

ins [data-ad-slot = "4502451947"] {display: none! important;}} @media (max-width: 800px) {# place_14> ins: not ([data-ad-slot = "4502451947"]) {display: none! important;}} @media (max-width: 800px) {# place_14 {width: 250px;}} @media (max-width: 500 пикселей) {# place_14 {width: 120px;}} ]]>

1

2 Крис Симмонс www.simmons-pagham.co.uk

3

4 Установите Zero Fret…. Требуется небольшая модификация

5

6

7

8

9 Более глубокие пазы в гайке только для направления струны

10

11

12 Установите магнитный звукосниматель и удалите старые лады.

13

14 небольшая регулировка, чтобы подобрать пикап

15

16 Установить новые лады

17

18

19

20 Сделайте паз для палисандрового моста достаточно глубоким для пьезо и костяного седла.

21 год

22

23

24

25

26 Маленькая пластиковая коробка для 2 розеток

27

28 год Маленькая коробочка для предусилителя для пьезо не хотела подходить к гитаре.У пользователя гитары есть выбор пьезо от бриджа и магнитного звукоснимателя на грифе. Можно подключить к гитарному усилителю с магнитным звукоснимателем и пьезо к PA одновременно или нет.

29

30 Крис Симмонс www.simmons-pagham.co.uk


Расширенная нормализация FRET позволяет проводить количественный анализ белковых взаимодействий, включая стехиометрию и относительную аффинность в живых клетках.

Используемые плазмиды

Все плазмиды, которые мы использовали, доступны из коллекции лаборатории Шмида.Банк данных, содержащий их, доступен в Интернете по адресу http://www.meduniwien.ac.at/user/johannes.schmid/. Используемые плазмиды и карты перечислены на дополнительном рисунке 11.

Приготовление образцов клеток

Все эксперименты проводились на клетках HeLa, клон ACC 57. Клетки пассировали за день до трансфекции, достигая слияния 70–80% на день трансфекции. Для микроскопических экспериментов клетки высевали на 8-луночные предметные стекла там же. Для проточной цитометрии клетки высевали в 24-луночные многолуночные планшеты.Для достижения охвата в широком диапазоне соотношений акцептора к донору плазмиды, несущие донор или акцептор, трансфицировали в пяти различных массовых соотношениях: 5: 1, 3: 1, 1: 1, 1: 3 и 1: 5. Трансфекция была достигнута с помощью реагента для трансфекции TurboFect ™ (Thermo Scientific ™, номер по каталогу: R0531) в соответствии со спецификациями продукта.

Получение и оценка микроскопических изображений

Микроскопия проводилась на конфокальной системе лазерного сканирования Nikon A1 R +, оснащенной 12-битными детекторами с использованием апохроматического масляного иммерсионного объектива 60x (NA1.4). Донорный канал был получен при возбуждении на 488 нм и эмиссионном фильтре 525/50. Канал FRET был получен при возбуждении на 488 нм и эмиссионном фильтре 595/50. Акцепторный канал был получен при возбуждении на 561 нм и эмиссионном фильтре 595/50.

Измерения фотообесцвечивания акцептора проводились на Nikon A1 с использованием иммерсионного объектива с апохроматическим маслом и иммерсией 60x (NA1.4). Фотодеструкция применялась на длине волны 561 нм при 100% мощности лазера в течение одной секунды (лазер: Melles Griot 85-YCA-020, выходная мощность 20 мВт при 561 нм ± 0.5 нм).

Оценка изображений проводилась с использованием программного пакета Fiji из ImageJ (https://fiji.sc/) и набора самописных макросов FRET, которые свободно доступны под GPLv3 (General Public License версии 3). ) на GitHub под (https://github.com/BHochreiter). Предоставляется описание и протокол использования этих макросов для оценки (дополнительный рисунок 7).

Получение и оценка проточной цитометрии

Измерения FRET на основе проточной цитометрии проводили на приборе CYTOFLEX S (Beckman Coulter, Ser.№ AW19039, используя следующие настройки каналов. Донорный канал: лазерное возбуждение 488 нм, эмиссионный фильтр 525/40 BP (505–545 нм), канал FRET: лазерное возбуждение 488 нм, эмиссионный фильтр 610/20 BP (600-620 нм), канал акцептора: лазерное возбуждение 561 нм, Эмиссионный фильтр 610/20 БП (600–620 нм).

Программное обеспечение CytExpert (https://www.beckman.com/coulter-flow-cytometers/software) использовалось для сбора данных и стробирования анализируемых популяций. Программное обеспечение FlowPy (http: // flowpy.wikidot.com/) использовался для извлечения данных из файлового формата FCS в текстовый формат с разделителями табуляцией.

Оценка отбеливания акцептора

В качестве альтернативного метода для определения эффективности FRET мы использовали метод фотообесцвечивания акцептора, который использует прямое сравнение интенсивности излучения донора до и после фотодеструкции акцепторного флуорофора, после чего большинство измерений и инструментов вызванные искажения не имеют значения, и поэтому результат является прямым коррелятом физического процесса.Однако многие флуорофоры демонстрируют определенные спектральные аномалии при освещении сильным источником света, которые необходимо учитывать перед анализом FRET. Донорские флуорофоры иногда могут быть совместно обесцвечены или, наоборот, фотоактивированы освещением с определенной длиной волны акцептора, что приводит к изменению сигнала флуоресценции без присутствия FRET. Другое явление - фотопереключение акцептора после обесцвечивания, когда акцептор не теряет свою эмиссию, а переходит на другой профиль эмиссии, который часто можно обнаружить в донорном канале 12,13 .

Поправочные коэффициенты df (совместное обесцвечивание и фотоактивация донора) и af (фотопереключение акцептора) используются для учета этих эффектов и определяются для образцов, содержащих только донор или акцептор.

$$ df = \ frac {{D} _ {dpost} - {D} _ {dpre}} {{D} _ {dpre}} $$

(2)

$$ af = \ frac {{D} _ {apost} - {D} _ {apre}} {{A} _ {apre} - {A} _ {apost}} $$

(3)

где «пост» означает интенсивность после отбеливания с акцепторно-специфическим возбуждением, а «до» - значение до.{c}} $$

(5)

Расчет коэффициентов нормализации C1 и C2

Сигналы донора, FRET и акцептора требуют нормализации, чтобы преобразовать их в одно и то же измерение и сделать возможным расчет относительных концентраций и соотношений доноров и акцепторов. C1 и C2 нормализуют донор или акцептор соответственно к сигналу в канале FRET. Они требуют информации от конструкции с известной эффективностью переноса и стехиометрией. Каждый измеренный эксперимент включал популяцию, трансфицированную тандемной слитой конструкцией mCherry-YFP, которая удовлетворяет этим требованиям.{c} \ ast C2} $$

(8)

Расчет различных измерений FRET по полученным сигналам

Из-за спектральных свойств флуорофоров, сигналы донора, акцептора и канала FRET должны быть скорректированы на спектральные перекрестные помехи (или просачивание) от другого флуорофора. Во-первых, четыре спектральных коэффициента прохождения определяются с использованием образцов, содержащих только донорный или акцепторный флуорофор. В литературе встречаются разные номенклатуры этих факторов - в данной работе используются S1 – S4 31 .S1 и S3 описывают спектральный поток флуоресценции донора в FRET и акцепторный канал соответственно, тогда как S2 и S4 описывают спектральный поток флуоресценции акцептора в FRET и донорный канал соответственно. (Список математических параметров в уравнениях представлен в таблице 1)

$$ {\ rm {donor}} \, {\ rm {into}} \, {\ rm {FRET}} \, {\ rm { channel}}: {S} _ {1} = \ frac {{F} _ {d}} {{D} _ {d}} $$

(9)

$$ {\ rm {acceptor}} \, {\ rm {into}} \, {\ rm {FRET}} \, {\ rm {channel}}: {S} _ {2} = \ frac { {F} _ {a}} {{A} _ {a}} $$

(10)

$$ {\ rm {donor}} \, {\ rm {into}} \, {\ rm {acceptor}} \, {\ rm {channel}}: {S} _ {3} = \ frac { {A} _ {d}} {{D} _ {d}} $$

(11)

$$ {\ rm {acceptor}} \, {\ rm {into}} \, {\ rm {donor}} \, {\ rm {channel}}: {S} _ {4} = \ frac { {D} _ {a}} {{A} _ {a}} $$

(12)

Таблица 1 Список переменных.{c} = \ frac {{A} _ {da} - {S} _ {3} \ ast {D} _ {da}} {1- {S} _ {3} \ ast {S} _ {4 }} $$

(14)

Если донор не подает сигнал в акцепторном канале и наоборот, что означает, что S3 и S4 равны 0, то этот шаг можно пропустить, и сигналы можно использовать сразу после коррекции фона.

Скорректированные донорные и акцепторные сигналы могут использоваться для отделения фактического сигнала FRET от спектрального просачивания в канале FRET, согласно Youvan et al .{c}} $$

(18)

Моделирование экспериментов FRET

Для моделирования экспериментов FRET мы создали математическую модель, основанную на обобщенной форме закона действия масс, которая описывает состояние всех химических взаимодействий в состоянии равновесия.

$$ A + B \ rightleftharpoons \ text {AB}, \, {K} _ {a} = \ frac {[AB]} {[A] \ ast [B]} $$

(19)

Состояние равновесия, а точнее, концентрации свободных и связанных фракций молекул, зависит от концентраций реагентов, а также их сродства, описываемого константой сродства K a (или наоборот, константа диссоциации K d ).K a - постоянное значение для реакции при указанной температуре и давлении. Для расчета FRET мы можем использовать наши донор и акцептор как A и B соответственно.

$$ {K} _ {a} = \ frac {[complex]} {{[don]} _ {free} \ ast {[acc]} _ {free}} $$

(20)

$$ [сложный] = [don] - {[don]} _ {free} = [acc] - {[acc]} _ {free} $$

(21)

Когда эти формулы объединяются и решаются для [комплекса], количество связанных и свободных частиц может быть определено при заданной общей концентрации донора, акцептора и значения K a .{2}} + [don] {K} _ {a} + \ frac {[acc]} {z} {K} _ {a} +1} {2 {K} _ {a}} $$

(24)

Важно отметить, что этот способ введения фактора стехиометрии подразумевает, что многочисленные молекулы донора или акцептора, которые появляются в комплексе, уже связаны друг с другом до взаимодействия между молекулами донора и акцептора. Эта формула не может отражать сродство донорных или акцепторных субкомплексов по отдельности. {c} \) и F c можно рассчитать, применив фиксированное значение максимальной эффективности FRET FRET max , которое представляет эффективность FRET, если все донорные и акцепторные молекулы были задействованы в донорно-акцепторном комплексе, а также спектральные факторы просачивания S1, S2, S3 и S4.

$$ {D} _ {da} = {[don]} _ {free} + [complex] \ ast (1-FRE {T} _ {max}) + ({[acc]} _ {free} + [сложный]) \ ast {S} _ {4} $$

(26)

$$ {A} _ {da} = {[acc]} _ {free} + [complex] + (\, {[don]} _ {free} + [complex] \ ast (1-FRE {T } _ {max})) \ ast {S} _ {3} $$

(27)

$$ {F} _ {da} = [комплекс] \ ast FRE {T} _ {max} + S1 \ ast {D} _ {da} + S2 \ ast {A} _ {da} $$

(28)

Для вычислительного моделирования модель можно упростить, установив для S1, S2, S3 и S4 значение 0, что не влияет на математическое моделирование.

Из полученных значений были рассчитаны показатели FRET в соответствии с уравнениями с 16 по 18.

Подгонка результатов FRET

Для получения трех количественных переменных K a app , z и FRET max , мы модифицировали результаты наших измерений в имитационную модель. Чтобы напрямую использовать интенсивности донорного и акцепторного каналов, а также результирующий DFRET для подгонки, мы немного изменили формулу, чтобы получить меру FRET вместо концентрации комплекса.{app}} \ ast \ frac {FRE {T} _ {max}} {don} $$

(31)

Подгонка проводилась с помощью нелинейной модели наименьших квадратов, что сводило к минимуму отклонение теоретических и реальных значений за несколько итераций. Подгонка модели может быть непосредственно применена к измеренным значениям, но должна быть ограничена значимой областью около стехиометрии комплекса. Для простого взаимодействия 1: 1 мы применяем модель ко всем значениям с отношением акцептора к донору от 0,2 до 2.

Статистическая информация

Статистические значения для соответствия модели были определены с помощью нелинейного алгоритма наименьших квадратов программного обеспечения R. Статистическая информация (где применимо) и n чисел приведены на соответствующих рисунках или в подписях к рисункам.

Реализованное программное обеспечение и код

Все описанные расчеты и оценки могут быть выполнены в свободно доступных ( R, ImageJ, CytExpert, FlowPy ) или общих (Microsoft Excel) программных пакетах.

Расчеты FRET, оценка FRET и моделирование были выполнены в Microsoft Excel (версия 2013). Приведены примеры таблиц данных (дополнительные шаблоны 1 и 2), включая пояснения по использованию и образец набора данных (дополнительные рисунки 8–10).

Подгонка модели

была выполнена в R (https://www.r-project.org/) с использованием команд нелинейной подгонки по методу наименьших квадратов. Предоставляется код, используемый для фитинга (дополнительное примечание 2).

Разное

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *