Лада 2018: Официальный сайт LADA

Содержание

LADA — исключительный успех в 2018 году — Пресс-релизы — Новости

Всего в 2018 году в РФ продано 360 204 автомобиля LADA. Это на 16% больше, чем годом ранее, и, по собственной оценке Компании, опережает рост рынка в целом. Марка является безусловным лидером российского рынка.

В декабре 2018 года продано 35 407 автомобилей LADA, что превышает прошлогодние показатели на 8,7% и является лучшим результатом продаж за месяц за последние 4 года.

Четыре модели LADA регулярно входят в десятку лучших по продажам в России. Возглавляют рейтинг автомобили семейства LADA Vesta с результатом в 108 364 автомобиля, что на 40% превышает показатели прошлого года. В том числе было реализовано 43 282 LADA Vesta SW и LADA Vesta SW Cross.

Традиционно лидирующие позиции принадлежат семейству LADA Granta, которое было полностью обновлено в 2018 году и привлекло в дилерские центры LADA новых клиентов. Своих покупателей нашли 106 325 машин этой модели, что составляет 13% прироста.

Несомненным успехом пользовались легковые и легкие коммерческие автомобили LADA Largus, продан 53 691 автомобиль. Продажи семейства LADA XRAY, которые были укреплены запуском нового XRAY Cross, составили 34 807 штук.

Следует отметить, что в 2018 году 32% LADA были приобретены с использованием собственной программы автокредитования — LADA Finance. Также для корпоративных клиентов в 2018 году была запущена собственная программа финансового лизинга — LADA Leasing. За год по программе LADA Leasing было продано 13 156 автомобилей.

В 2018 году продолжилось активное обновление дилерской сети LADA, являющейся самой большой на территории России — 288 центров продаж и сервисного обслуживания. За прошедший год открыли свои двери 16 новых автосалонов, а результатом активной работы по обновлению стандартов внутреннего и внешнего оформления стали 150 центров, достигших 100% соответствия новым стандартам Марки.

Послепродажное обслуживание и бизнес по реализации запасных частей также показали положительную динамику. Рост товарооборота составил 7%.

Отдельного внимания заслуживает экспортная политика — автомобили LADA в 2018 году продавались в 34 странах. За год было реализовано 38 052 автомобиля, а общий рост продаж на зарубежных рынках составил 57% по сравнению с 2017 годом. Следует отметить особый успех Бренда на рынках стран СНГ, в Казахстане LADA стала лидером рынка, а в Беларуси заняла вторую строчку рейтинга продаж.

Ян Птачек, исполнительный вице-президент по продажам и маркетингу ПАО »АВТОВАЗ», отметил: »2018-й был исключительным годом для LADA. По внутренней оценке компании, мы смогли достичь 20% доли рынка, а результат продаж LADA является лучшим за последние 7 лет. Мы вывели на рынок новые модели и продолжили работу по качественному обновлению дилерской сети. У нас амбициозные планы. В 2019 году мы будем стремиться к новым победам, открывая перед собой новые горизонты в истории LADA».

Седан LADA Granta 2018: лучшие ожидания оправдались

Записавшихся в очередь для того, чтобы купить рестайлинговый седан Лада Гранта в 2018 году, можно поздравить. Автомобили благополучно добрались до выставочных залов и стоянок дилерских центров LADA, где можно провести тест-драйв, выбрать комплектацию и цвет кузова, осведомиться об условиях кредита и просто узнать много нового о концерне.

Изменился в нужную сторону

Внешне седан LADA Granta стал динамичнее, его перед и задняя часть расширены, багажник обрел новый рельеф. Картину дополняют эксклюзивные диски, хромированный контур решетки радиатора и современная светотехника.

Салонный комфорт достигнут за счет мягких оттенков и новой обивки сидений. В топовой комплектации спереди они имеют подогрев и регулировку по высоте. Продуманы ниши для размещения мелких вещей, а также функция задержки освещения после того, как салон был покинут.

Двигатель – 87, 98 или 106 лошадиных сил

В продаже уже в салонах все пять комплектаций и три варианта двигателя – каждый из них делает новый автомобиль от АвтоВАЗ резвее.

В конструкции мотора заменены поршни, которые теперь не «втыкают» при ходе, а принимают клапаны в специальные выемки. Такое новшество от Federal Mogul позволяет избежать поломки клапанов при обрыве ГРМ. Двигатель в целом стал активнее и мягче на низких оборотах.

Лучший по соотношению «цена-наполнение»

LADA Granta седан имеет несколько преимуществ в своем классе:

Признание покупателя – большинство ожиданий сводятся все-таки к очертаниям седана
Высокий клиренс (16 см) при низкой высоте кузова. Притом, что в салоне комфортно себя чувствуют и люди ростом 195 см
Просторный багажник, который теперь открывается одной кнопкой
Самые низкие цены на комплектации

Подробнее о них можно узнать от менеджера в салоне. Комплектация Standard, например, считается базовой – в цену 419 900р входит двигатель мощностью 87 л.с., пятиступенчатая механическая трансмиссия, а из фундаментальных отличий – кондиционер в салоне, система ЭРА-ГЛОНАСС, подушка безопасности для водителя. За доплату в категории Classic можно получить бортовой компьютер, иммобилайзер и ассистент переключения передач в МКП. Наибольшее количество приспособлений для повышенного комфорта приходится на комплектацию Luxe – мультифункциональная аудиосистема, климат-контроль 2 зон, подогрев передних сидений и далее, по списку.

Автомобили в наличии

АВТОВАЗ уверенно продолжил реализацию среднесрочного плана развития.

В 2018 году АВТОВАЗ уверенно продолжил реализацию среднесрочного плана развития.

Компания усилила продуктовое наступление, укрепила позиции автомобильного бренда №1 в России — LADA — и расширила свое присутствие на экспортных рынках. Группа АВТОВАЗ показала устойчивую положительную операционную маржу и вышла на прибыльность.

Новинки LADA

В июне 2018 года стартовали продажи LADA Vesta Cross. Это первый автомобиль в своем сегменте, сочетающий дорожный просвет кроссовера (203 мм), азартную управляемость, просторный салон и один из самых популярных в регионе типов кузова — седан.

В августе 2018 года в продажу вышло новое семейство LADA Granta. Отличающаяся современным стилем и улучшенным уровнем комфорта и безопасности, LADA Granta была и остается одной из самых доступных моделей на рынке.

В ноябре стартовали продажи LADA XRAY Cross. Модель отличается атрибутами, присущими внедорожникам, и с точки зрения дизайна, и в плане технической составляющей. У автомобиля богатый набор нового оборудования, высокий уровень комфорта и проходимости: дорожный просвет машины достиг рекордных для LADA 215 мм, внедрена интеллектуальная система LADA Ride Select, позволяющая выбрать режимы движения для различных дорожных условий.

На Московском международном автосалоне LADA представила 4 новые модели и показала развитие дизайн-концепции марки. Такое количество премьер на стенде LADA — это рекорд в истории бренда. Концепт-кар LADA 4х4 VISION, признанный лучшим экспонатом Московского международного автосалона, продемонстрировал видение развития фирменной ДНК стиля.

Награды бренда и предприятия

Сразу 4 номинации стали победными для LADA по итогам ежегодной национальной премии «Автомобиль года в России». В голосовании приняли участие более 1 миллиона человек. В номинации «Малый класс» победителями стали LADA Vesta и LADA Vesta SW. Звание «Автомобиль года в России» в номинации «Универсалы повышенной проходимости» заслужила LADA Vesta SW Cross. И уже в 6-й раз в номинации «Мини-фургоны» победил LADA Largus Van. Сама LADA награждена в специальной номинации «Любимая марка в массовом сегменте».

LADA Vesta SW Cross стала обладателем престижной автомобильной премии — Гран-при «За рулем-2018». Автомобиль награжден в номинации «Компактные кроссоверы». В специальной номинации «Ломая стереотипы» были награждены LADA Vesta SW и LADA Vesta SW Cross.

Ежегодная национальная премия экспертов автомобильного бизнеса «ТОП-5 Авто»: LADA Vesta SW и LADA Vesta SW Cross признаны лучшими в номинации «Компактный городской автомобиль». Кроме того, PR-служба LADA награждена в категории «Лучший PR-департамент автопроизводителя» — это специальная номинация за компетентность и эффективную коммуникацию.

Автомобиль LADA Vesta SW Cross получил Премию Российского автомобильного форума RAF-2018 — модель награждена в номинации «Лучший дебют 2017 года».

Развитие бренда и предприятия

В 2018 году LADA разработала новую корпоративную философию, впервые за последние несколько лет появился единый слоган марки. Энергичный дизайн, лучшее качество и оснащение за приемлемую цену, уверенность в любых ситуациях — таковы три основных принципа новой философии LADA. Новый девиз марки: «LADA. Новые горизонты». Слоган подчёркивает полное обновление модельного ряда, выход в новые ниши, трансформацию дилерской сети, применение самых современных стандартов проектирования и производства автомобилей.

Корпоративное развитие Группы АВТОВАЗ направлено на подготовку дальнейшего обновления модельного ряда. С целью укрепления научно-технического потенциала предприятия был проведен набор инженеров: около 400 сотрудников, среди которых молодые специалисты и выпускники вузов приняты в инжиниринговый центр.

завод полного цикла запустят в 2018 году — Авторевю

Президент АвтоВАЗа Николя Мор посетил строящийся завод в Казахстане и рассказал о перспективах этой производственной площадки. Строительство нового предприятия совместно с местной компанией Азия Авто началось осенью 2013 года. Первоначально запуск был запланирован на этот год, но кризис и резко упавший спрос на автомобили вынудили сдвинуть срок запуска еще на два года. На сегодняшний день работы по монтажу инженерных коммуникаций (подъездных путей, электросети, водо- и теплоснабжения) выполнены на 79%, а старт работ по строительству железнодорожных путей намечен на следующий год.

Площадь предприятия — 523 гектара.

Инвестиции в базовые мощности первой очереди проекта составят 380 млн долларов (из них 58 млн уже вложила Азия Авто), а общие затраты на новое предприятие по плану превысят 500 млн долларов, хотя эта сумма в итоге наверняка заметно вырастет. Первая очередь завода предусматривает мощности для производства 60 тысяч машин в год по полному циклу — со сваркой и окраской кузовов. К слову, это не первое подобное предприятие в Казахстане: еще в 2013 году на заводе Агромашхолдинг (ныне СарыаркаАвтоПром) начали производство внедорожников SsangYong Nomad по полному циклу, позже к ним добавили модель Toyota Fortuner, хотя фактический объем выпуска не превышает пару тысяч машин в год. А совместное предприятие АвтоВАЗа и Азии Авто по плану должны расширить до 120 тысяч автомобилей ежегодно! Хотя со сбытом такого количества автомобилей, мягко говоря, возникнут проблемы.

Основными рынками сбыта по плану станут сам Казахстан, другие страны Евразийского экономического союза (Россия, Армения, Белоруссия, Киргизия), а также республики Центральной Азии: Туркменистан, Таджикистан и Монголия. Но в Казахстане в прошлом году продано только 24,5 тысячи автомобилей Лада, а в других перечисленных странах (кроме России) продажи еще намного ниже. Что касается России, то здесь серьезно недозагружены сам АвтоВАЗ и завод Лада Ижевск, поэтому поставки к нам машин из Казахстана выглядят очень сомнительно.

Пока буксует и «отверточное» производство на существующих мощностях завода Азия Авто. Этим летом здесь начали сборку седанов Лада Гранта, универсалов Калина и пятидверных внедорожников Лада 4х4 (трехдверки в Усть-Каменогорске выпускают с 2003 года). Но старт производства Ларгуса перенесен с сентября на ноябрь, Веста отложена на более поздний срок, а Приора и XRAY пока и вовсе исчезли из планов завода.

LADA Largus: рестайлинг или ремейк

Новая LADA Largus скорее всего станет предпоследней новинкой АвтоВАЗа выдержанной в фирменном Х-стиле открытом шеф-стилистом Стивом Матином.

После Largus’а будет только обновлённая Vesta. А дальше… Дальше Ренолюция, новые платформы и новый стиль. Кстати родной брат нашего Largus’а – Dacia Logan MCV сегодня выглядит так.

Не знаю, как вам, а на мой взгляд наш Largus смотрится не хуже. И всё это заслуга Х-стиля. Хромированные бумеранги молдингов, вписанные в передний бампер здорово омолодили внешность заслуженного трудяги. Чёрная, ячеистая фальшрадиаторная решётка привилегия исполнения Люкс (на «простом» Largus’е она выглядит не столь авангардно, но тоже стильно). Решётка эффектно завязана с новыми блоками фар головного света. Практически такие же ставят на новые Logan’ы и Sandero в России. Здесь нет светодиодов, зато есть дневные ходовые огни. Попутно обновились передние крылья и крышка капота.

А ещё новая передняя часть значительно улучшила прикладную аэродинамику нового Largus’а. Подъёмная сила, неизбежно возникающая при движении на высокой скорости, была снижена на весомые 16%.

В принципе обновлением передка весь рестайлинг и ограничился. Сбоку и сзади это всё тот же 9-ти летний Largus. Разве, что сзади появилась камера заднего вида и парктроники, но о них чуть позже. Есть места под парктроники и в переднем бампере, но самих излучающих элементов нет. Скорее всего они появятся позднее, а пока вы можете установить их самостоятельно, благо что места для этого уже обозначены.

Гораздо больше перемен внутри. Здесь появились новые передние кресла (от LADA X-Ray), новое торпедо (от Renault Duster первого поколения), новый руль (от LADA Vesta) и много чего ещё. Например, центральный подлокотник на передних креслах и подстаканники для пассажиров третьего ряда (тех самых «мест для поцелуев»). Кстати этот 3-й ряд и превращает LADA’у Largus не только в 7-ми местный автомобиль, но и в уникальное транспортное средство в своём сегменте. Подобных автомобилей и по близкой цене рядом не наблюдается. От слова «совсем». Правда багажника в 7-ми местном варианте конфигурации салона у вас практически не будет. Он появится если вы сложите сиденья 3-го ряда: откроется простор более чем в полкубометра. Да ещё с ровным полом. Так что у вас всегда будет свобода выбора: возить либо груз, либо пассажиров. А что вы хотите, LADA Largus универсальный автомобиль, как по кузову, так функциональным возможностям.

И как всякий универсал новый Largus демонстрирует внимание к мелочам. Например, к размещению мелкого багажа неизбежно следующего в каждом путешествии, будь то поездка в отпуск или ближайший супермаркет. Для этого здесь есть вместительный перчаточный ящик, бокс в центральном подлокотнике и даже потолочная полка над сиденьями 2-го ряда. Согласитесь — ещё вчера такое внимание к деталям было не характерно для продукции отечественного автопрома.

Точно так же вчера было трудно предположить, что на LADA Largus появятся датчики дождя и света и, вот сегодня, это уже свершившийся факт. А ещё здесь появился, подогрев сидений спереди и сзади, причём спереди 3-х ступенчатый. И, кстати о дожде – форсунки омывателей на новом Largus переехали с крышки капота на специальное жабо у основания ветрового стекла. Так улучшилась аэродинамика и эстетика формы. Одновременно форсунки омывателей получили более широкий факел распыла, что так же улучшает обзорность в тяжёлых дорожных условиях.

Современный автомобиль должен соответствовать духу времени. Отсюда в салоне нового Largus’а множество USB-разъёмов для зарядки многочисленных гаджетов. А отзеркалить свой смартфон по Bluetooth можно с помощью штатного мультимедиа центра, доставшегося Largus’у вместе с передней панелью от Duster’а. Сюда же выводится картинка с камеры заднего вида. Правда она показывает статичную траекторию движения. Это тем более непонятно, так-как на LADA Vesta такая же камера показывает динамический коридор манёвра. Да и омыватель здесь отсутствует в то время, как на новой NIVA Travel он есть. Скорее всего ответом всему является стремление удержать цену новинки в разумном коридоре, а попутно оставить задел для последующей модернизации.

А теперь – как всё это ездит. Скажем сразу: энергоёмкая подвеска Largus’а не стала для нас откровением. Платформа В0 (она же платформа Logan) хорошо известна у нас и пользуется хорошей репутацией. В том числе за свою надёжность и способность поглощать даже серьёзные неровности дорожного покрытия.

А вот улучшившаяся звукоизоляция стала приятным сюрпризом. Нельзя сказать, что в салоне стало абсолютно тихо, но шумы от ветра, работы двигателя и колёс стали заметно тише.

Линейка моторов нового Largus’а предполагает два силовых агрегата. Оба одинакового рабочего объёма – 1,6 литра, но разной мощности. Один (16-ти клапанный) способен тянуть, как табун в 106 «лошадей». Именно этот мотор и стоял на нашем испытуемом. Второй (8-ми клапанный) мощностью 90 лошадиных сил это сильно-переработанный 87-ми сильный двигатель, ставившийся на дорестайлинговые модели. Однако комплекс конструкторско-технологических мероприятий был столь велик, что впору говорить о новом силовом агрегате, у которого обновлена шатунно-поршневая группа, модернизирован коленвал и газораспределительный механизм. В результате мощность повышена до 90 «лошадей», а 80% крутящего момента доступны уже на 1000 оборотах в минуту, что позволяет уменьшить расход топлива и снизить частоту переключений. Кроме того, исключена необходимость регулировки клапанов до пробега в 90 тыс. км. 90-сильный мотор будет основным для коммерческой версии, а проще говоря, фургона LADA Largus, есть и такой. Нам не удалось опробовать этот двигатель, но эксперты отмечают его динамику и высокие тяговые характеристики. Чего не скажешь о 106-сильном силовом агрегате – нам показалось, что он недостаточно резв. Хотя возможно это следствие небольшого пробега – наш испытуемый на момент теста пробежал всего около 200 километров.

Подведём итоги. Мы имеем автомобиль семейства LCV не столько новый, сколько обновлённый, но я считаю, что это неплохой выбор учитывая тот факт, что в этом сегменте найти другой автомобиль с 7-ми местным салоном и по такой цене вам не удастся. Даже на вторичном рынке. Добавьте к этому обширный список стандартного и дополнительного оборудования, и вы поймёте, что это прекрасный повод присмотреться к этому автомобилю поближе и сделать правильный выбор.

Мы благодарим дилерский центр ЛАДА НОРД-АВТО, расположенный в центре Твери, на улице Коробкова, 5 за предоставленный автомобиль и помощь в проведении нашего драйв-теста.

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter.

FRET-улучшенная фотостабильность позволяет улучшить отслеживание отдельных молекул белков и белковых комплексов в живых клетках млекопитающих

Анализ структуры белка

Данные опубликованных кристаллических структур были проанализированы с использованием пакета UCSF Chimera ⁵⁵. Программное обеспечение Chimera также использовалось для создания рисунков для этой статьи. Список проанализированных белковых структур выглядит следующим образом: mEos3.2 (PDB ID: 3P8U) ⁵⁶, HaloTag (PDB ID: 4KAA) ⁵⁷, тег SNAP (PDB ID: 3KZZ) ⁵⁸ и CENP -Нуклеосома (PDB ID: 3AN2) ⁴⁴.

Экспрессия белков mEos3.2-HaloTag и HaloTag-SNAP-tag

Конструкция mEos3.2-HaloTag была клонирована из плазмид, содержащих mEos3.2 ⁵⁹ и HaloTag (Promega), слитых через короткий линкер (Leu- Glu-Gly-Ser) и вставляли в расщепленный EcoRI / HindIII экспрессионный вектор pET30a с использованием набора для клонирования In-Fusion HD (Clontech). Таким же образом клонировали конструкцию HaloTag-SNAP. Затем проводили сайт-направленный мутагенез вектора mEos3.2-HaloTag для создания слитой конструкции с другой длиной линкера (ΔARRELEGSE).

His-tagged конструкции mEos3.2-HaloTag и HaloTag-SNAP были экспрессированы в клетках E. coli BL21 (DE3) pLysS путем выращивания литра клеток из 50-мл заквасочной культуры до OD _{600 нм} 0,7–1,0 в среде LB, содержащей 35 мкг / мл канамицина и 34 мкг / мл хлорамфеникола, перед индукцией экспрессии с использованием 1 мМ IPTG (Melford Laboratories Ltd) в течение 4 ч при 25 ° C. Клетки осаждали и хранили при -20 ° C. Для очистки белка клетки быстро размораживали при 37 ° C и ресуспендировали в трех объемах буфера для лизиса (50 мМ Hepes pH 7.5, 300 мМ NaCl, 5% глицерина и коктейль ингибиторов протеазы (Roche)) на объем осадка. Затем ресуспензию клеток обрабатывали ультразвуком в течение 13 минут с амплитудой 33% (5 секунд при включении и 10 секунд после выключения) с использованием Sonic Dismembrator (модель 505, Fisher Scientific), остатки клеток осаждали, собирали лизат белка и фильтровали через фильтр 0,45- мкм фильтр.

Слитые белки сначала очищали с помощью аффинной хроматографии на никеле. Лизат белка ресуспендировали в 5 мл суспензии шариков 50% Ni-нитрилотриуксусной кислоты (Ni-NTA) (Qiagen), предварительно уравновешенной в буфере (50 мМ NaH ₂ PO ₄, 300 мМ NaCl, pH 8.0) и вращали в течение ночи при 4 ° C. Слитый белок очищали с использованием гравитационной колонки объемом 20 мл (Bio-Rad), промывали тремя объемами колонки промывочного буфера (50 мМ NaH ₂ PO ₄, 300 мМ NaCl, 5 мМ имидазол, pH 8,0) и окончательно элюировали 10 мл буфера для элюции (50 мМ NaH ₂ PO ₄, 1 М NaCl, 250 мМ имидазол, pH 8,0). Затем белок диализовали (в 50 мМ NaH ₂ PO ₄, 1 М NaCl, pH 8,0) для удаления имидазола с использованием Vivaspin 500 с отсечкой по молекулярной массе (MWCO) 5 кДа (Sartorius Stedim Biotech). Затем слитый белок дополнительно очищали гель-фильтрацией в буфере, состоящем из 50 мМ NaH ₂ PO ₄ и 1 М NaCl (колонка 75 мл Sephadex200, GE Healthcare). Для проверки массы белка (65096,8 Да) проводили масс-спектрометрию, а для определения его концентрации использовали аминокислотный анализ. Белок хранили в аликвотах по 500 мкл с концентрацией 1 мг / мл при -80 ° C и повторно очищали с использованием эксклюзионной хроматографии перед маркировкой красителя. Слитые белки (5–10 мкМ) метили лигандами HaloTag-dye или SNAP-tag-краситель путем их реакции в эквимолярном соотношении при комнатной температуре в течение 1 ч перед очисткой с использованием гравитационной колонки Illustra Nap-5 (GE Healthcare ).Масс-спектрометрия подтвердила, что метка близка к 100%.

Красители HaloTag или SNAP-tag PA-JF ₅₄₉ и JF ₆₄₆ были любезным подарком от Люка Д. Лависа (HHMI) ⁶⁰.

Характеристика спектров объемной флуоресценции

Спектры объемной флуоресценции были получены с использованием mEos3.2 или PA-JF ₅₄₉ с красителем JF ₆₄₆ или без него (15–25 мкМ) с использованием флуоресцентного спектрофотометра (Cary Eclipse). Образец помещали в кварцевую кювету (Hellma Analytics, 3 × 3 мм).Чтобы определить фактическую эффективность FRET белков mEos3.2-HaloTag с различными красителями, спектры излучения были собраны после возбуждения при 532 нм и регистрации флуоресценции в диапазоне длин волн (550-800 нм). Эффективность FRET ( E ) была рассчитана по стандартному уравнению (уравнение 1):

$$ E = 1 — \ frac {{I _ {\ rm D} \ prime}} {{I _ {\ rm D}} }, $$

, где \ (I _ {\ rm D} \) — интенсивность флуоресценции одного донорного флуорофора (mEos3.2), а \ (I _ {\ rm D} \ prime \) — интенсивность флуоресценции донор в присутствии акцептора (mEos3.2 \) — фактор ориентации диполя (\ (\ frac {2} {3} \) для свободно вращающихся донорных и акцепторных флуорофоров), \ (Q _ {\ rm D} \) — квантовый выход донора mEos3. 2 или PA-JF ₅₄₉ флуорофоров (0,55 и 0,88 соответственно), n — показатель преломления среды (1,33), а J — интеграл спектрального перекрытия между донорами mEos3.2 или PA-JF ₅₄₉ и акцепторный JF ₆₄₆ спектры, рассчитанные на разных длинах волн λ с использованием коэффициента экстинкции \ ({\ it {\ epsilon}} _ {\ rm A} \) акцепторного красителя JF ₆₄₆ (максимальное значение 152000 M ⁻¹ см ⁻¹) (Ур.4 \ mathrm {d} \ lambda. $$

Визуализация времени жизни флуоресценции

Измерения временного коррелированного подсчета одиночных фотонов (TCSPC) были выполнены на системе Leica SP8 STED 3 ×, дополнительно оснащенной программным обеспечением для обнаружения одиночных молекул (SMD) (SymPhoTime версия 5.3.2.2) и оборудование (PicoHarp 300; PHR 800) от PicoQuant. Возбуждение флуоресценции в этой системе осуществлялось с помощью настраиваемого импульсного (80 МГц) лазера белого света (WLL; Super-K; NKT Photonics), в то время как обнаружение флуоресценции осуществлялось с помощью внутреннего гибридного детектора одиночных молекул (Leica HyD SMD).Возбуждение донора осуществляли на длине волны 561 нм с полосой обнаружения 570-620 нм и с использованием водно-иммерсионного объектива 20 × 0,75 NA (HC PL APO CS2) с коэффициентом масштабирования 1 × и скоростью сканирования 400 Гц. , и с накоплением кадров 25 изображений. Фотоактивация / преобразование достигались с использованием лазера 405 нм в течение 1 мин при мощности активации 1,75 кВт / см ² в фокальной плоскости объектива до измерения срока службы. Увеличение эмиссии доноров произошло после активации / конверсии, как и ожидалось.Измерения FLIM проводили в трех экземплярах до и после активации / конверсии очищенного белка в 50 мМ NaH ₂ PO ₄, 1 М NaCl, pH 8,0 на 8-луночных микропрепаратах со стеклянным дном (iBidi). Белок прикрепляли к покровному стеклу путем инкубации с поли-L-лизином (Sigma Aldrich) в течение 30 минут, а затем с 5–10 мкМ белка в течение 10 минут. {- t / \ tau _i} $$

где I _Bkgd — смещение интенсивности для подсчета фона, а \ (\ alpha _i \) и \ (\ tau _i \) — значения амплитуды и времени жизни для i -й экспоненты, где мы сравнивали соответствия для 1 ≤ i ≤ 3 (т.е.е., моно-, би- и трехэкспоненциальные аппроксимации). Впоследствии мы определили относительную вероятность для каждой модели для каждого набора данных с помощью байесовского информационного критерия (BIC) ^62,63. Короче говоря, используя этот подход, мы рассчитали BIC для каждой модели из (Ур. 6)

$$ \ mathrm {BIC} = \ ln [n] (p + 1) + n \ left ({\ ln \ left [{\ frac {{2 \ pi {\ rm RSS}}} {n}} \ right] + 1} \ right), $$

, где n — количество точек данных, p — это количество свободных параметров для подгонки, а RSS — остаточная сумма квадратов подбора.Впоследствии мы определили относительную вероятность для каждой модели для каждого набора данных из (Уравнение 7):

$$ {\ mathrm {Relative}} \; {\ mathrm {Likelihood}} = {\ mathrm {Exp}} \ left [{ \ frac {{{\ mathrm {BIC}} _ {{\ mathrm {Min}}} {\ mathrm {(модель) -}} {\ mathrm {BIC (модель)}}}} {2}} \ right] . $$

Данные как для mEos3.2 с JF ₆₄₆ и без него, так и для PA-JF ₅₄₉ с JF ₆₄₆ и без него можно описать двумя сроками жизни. Мы определили эффективность FRET ( E ), используя среднее время жизни флуоресценции (уравнение.8):

$$ E = 1 — \ frac {{\ tau _ {{\ rm DA}}}} {{\ tau _ {\ rm D}}}, $$

где \ (\ tau _ {\ rm D} \) — средневзвешенное по амплитуде время жизни флуоресценции только донорского флуорофора (mEos3.2 или PA-JF ₅₄₉), а \ (\ tau _ {{\ rm DA}} \) — амплитуда средневзвешенное время жизни флуоресценции донора в присутствии акцептора (mEos3.2 – JF ₆₄₆ или PA-JF ₅₄₉ –JF ₆₄₆).

Установка микроскопа

В этой работе использовались две сделанные на заказ установки микроскопа, обе из которых описаны ниже. Таблицу с подробным описанием конкретных параметров, используемых для каждого эксперимента, можно найти в дополнительной информации.

Микроскоп 1: использовался инвертированный микроскоп IX71 Olympus с лазерными лучами с круговой поляризацией, выровненными и сфокусированными на задней апертуре масляного объектива Olympus 1,49 NA 60 × (Plan Apochromat 60 × NA 1,49, Olympus APON 60XOTIRF). Используемые источники света диодных лазеров с непрерывной длиной волны включают 561 нм (Cobolt, Jive 200, 200 мВт) и 405-нм лазер (Oxxius, LaserBoxx 405, 100 мВт).Полное внутреннее отражение достигалось смещением лазерного луча от оси таким образом, чтобы выходящий луч на границе образца был почти коллимированным и падал под углом, превышающим критический угол Визуализация TIRF и чуть меньше θ _c для визуализации с косоугольным освещением. Это создавало след возбуждения диаметром ~ 50 мкм. Для TIRF плотность мощности на покровном стекле для лазера с длиной волны 561 нм была рассчитана приблизительно равной 0.4 кВт / см ² измерено лазерным лучом при эпи-освещении. Для косоугольного освещения мощность коллимированных лучей на задней апертуре микроскопа составляла 10 кВт / см ² и 10–100 Вт / см ² для лазерных лучей 561 нм и 405 нм соответственно. Лазеры отражались дихроичными зеркалами, которые также отделяли собранное флуоресцентное излучение от пучка TIR (Semrock, Di01-R405 / 488/561/635). Эмиссия флуоресценции собиралась через тот же объектив, а затем дополнительно фильтровалась с использованием комбинации длиннопроходных и полосовых фильтров (BLP01-561R и FF01-587 / 35 для возбуждения 561 нм).Эмиссионный сигнал расширялся с помощью расширителя ахроматического луча 2,5 × (Olympus, PE 2,5 × 125) и, наконец, проецировался на EMCCD (Photometrics, Evolve 512) с усилением электронного умножения 250 ADU / фотон, работающим в режиме передачи кадров. Инструмент был автоматизирован с использованием программного обеспечения с открытым исходным кодом micro-manager (https://www. micro-manager.org), а данные отображались с помощью программного обеспечения ImageJ ^64,65.

Микроскоп 2: использовался инвертированный микроскоп IX73 Olympus с лазерными лучами с круговой поляризацией, выровненными и сфокусированными на задней апертуре Olympus 1.40 NA 100 × масляный объектив (Universal Plan Super Apochromat, 100 ×, NA 1.40, UPLSAPO100XO / 1.4). Используемые диодные лазерные источники света с непрерывной длиной волны включают 641 нм (когерентный, CUBE 640–100 C, 100 мВт), 561 нм (Cobolt, Jive 200, 200 мВт) и 405-нм лазер (Stradus, Toptica, 405–100, 100 мВт). Визуализация TIRF и косоугольного освещения выполнялась с использованием идентичных дихроичных зеркал и фильтров излучения. Сигнал излучения проецировался на EMCCD (Photometrics, Evolve 512 Delta) с усилением электронного умножения 250 ADU / фотон, работающий в режиме передачи кадров.Инструмент был автоматизирован с использованием программного обеспечения с открытым исходным кодом micro-manager (https://www.micro-manager.org), а данные отображались с помощью программного обеспечения ImageJ ^64,65.

TIRF-характеристика красителей mEos3.2-HaloTag

Покровные стекла из боросиликатного стекла (VWR Int, 22 × 22 мм) очищали для удаления любых флуоресцентных остатков в очистителе аргоновой плазмы (плазма Харрика) в течение 1 часа. Инкубационные камеры с герметичной рамкой (Bio-rad) прикрепляли к покровному стеклу и 50 мкл 0,1% поли-L-лизина (Sigma Aldrich) добавляли в центр камеры на 30 мин; Затем к покровному стеклу, покрытому поли-L-лизином, добавляли 50 мкл 10 нМ белка на 10-15 мин.Образец трижды промывали 50 мкл фильтрованной (шприц-фильтр 0,2 мкм, Whatman, 6780–1302) воды MilliQ, и флуоресцентные изображения, собранные в виде видеозаписей из 500 изображений, при экспозиции 500 мс. Фотопреобразование производилось одиночным импульсом в первом кадре каждого фильма.

Анализ фотофизических параметров

Эксперимент был воспроизведен в лаборатории дважды на Микроскопе 1 и дважды на Микроскопе 2. Хотя все эксперименты показали схожие результаты, мы решили проанализировать наборы данных с Микроскопа 1, записанные в тот же день, чтобы уменьшить возникающие систематические ошибки. от слегка различающихся настроек микроскопа.Мы проанализировали фильмы, собранные в тот же день с микроскопа 1, в которых мы отслеживали 455 и 454 одиночных mEos3.2 и mEos3.2 – JF ₆₄₆ молекул без Trolox, 990 и 1568 одиночных mEos3.2 и mEos3.2 – JF ₆₄₆ молекул с 2 мМ Trolox. Учитывая, что 20% одиночных молекул mEos3.2 – JF ₆₄₆ находились во включенном состоянии значительно дольше, чем одиночные молекулы mEos3.2, это подходящий размер выборки, чтобы продемонстрировать наблюдаемые нами изменения. Все гистограммы были созданы с использованием пакета Origin (OriginLab, Northampton, MA).

Здесь приводится краткое описание программного обеспечения, используемого для анализа данных. Проекция с максимальной интенсивностью первых двух изображений после фотопреобразования использовалась в качестве основы для обнаружения одиночных молекул. К проекции был применен фильтр Лапласа гаусса, и были найдены локальные максимумы. Скрипты для этого доступны на https://github.com/TheLaueLab/blob-detection, а для всех остальных шагов — на https://github.com/TheLaueLab/blink-analysis. Область с центром на каждом пике с пороговым значением> 600 ADU была извлечена из каждого изображения.Эта область состояла из области сигнала 7 на 7 пикселей и окружающей фоновой области шириной 2 пикселя. Отдельные кадры были упрощены до одномерных графиков путем вычитания среднего покадрового фона из соответствующего кадра, а затем взятия среднего значения всех пикселей в этом кадре. Скрытая марковская модель (с использованием пакета python hmmlearn из https://github.com/hmmlearn/hmmlearn) была настроена с четырьмя состояниями: двумя включенными состояниями, одним выключенным и одним обесцвеченным. Переходы были одинаково вероятны между всеми включенными и выключенными состояниями и 1/10 вероятности из любого включенного состояния в обесцвеченное состояние (переход от обесцвеченного состояния был невозможен). Состояния были инициализированы со средним значением 300 ADU для включенного состояния и 0 для выключенного и обесцвеченного состояний, с предварительным весом 1e3, присвоенным среднему состоянию. Модель была обучена на всех следах от определенного флуорофора, и одна и та же обученная модель использовалась для категоризации всех следов.

Общее время в открытом состоянии каждой молекулы было рассчитано путем подсчета количества изображений в открытом состоянии. Мигание определялось как серия последовательных изображений; средняя длина цикла, умноженная на время воздействия, представляет собой время включения, а количество циклов, обнаруженных для конкретной молекулы, является числом событий переключения.Частота выключения — это количество миганий, разделенное на общее время включения, а скорость включения — это количество миганий, разделенное на общее время выключения (исключая последний запуск вне кадра, если он продолжался до конец видео).

Наконец, было вычислено полное излучение фотонов для каждого изображения, вычитая среднее значение области фона из области сигнала. Чтобы рассчитать количество испускаемых фотонов на молекулу, общее усиление камеры в аналого-цифровых единицах (ADU) / фотон было определено по формуле (Ур.9)

$$ G _ {{\ rm total}} = \ frac {1} {{G _ {{\ rm camera}}}} \ times G _ {{\ rm EM}} \ times {\ rm QE}, $$

где G _камера — это усиление сигнала, присущее EMCCD в единицах ADU / электрон, G _EM — это соотношение заряда на камере с усилением и без усиления, а QE — это коэффициент усиления. квантовая эффективность — способность камеры производить заряд в результате падающего фотона с единицами электронов / фотонов. G _итого это 33.1 ADU / фотон и 35,7 ADU / фотон для микроскопов 1 и 2 соответственно.

Измеренный сигнал ( I ) в единицах электронов был преобразован в испускаемые фотоны ( n ) следующим образом (уравнение 10):

$$ n = \ frac {I} {{G _ {{\ rm total}} \ times {\ rm TE}}}. $$

TE определяется как эффективность передачи всех оптических компонентов на пути излучения прибора и может быть описана формулой (11)

$$ { \ rm TE} = \ eta _ {{\ rm coll}} \ times T \ times \ eta _ {{\ rm EMCCD}}, $$

, где η _coll — эффективность сбора объектива, T — это пропускание внутренних оптических компонентов микроскопа, а η _EMCCD — квантовая эффективность EMCCD ⁶⁶.

Культура клеток млекопитающих и поколение клеток

ES-клетки культивировали в стандартных условиях сывороточного и мышиного фактора ингибирования лейкемии (mLIF): минимальная необходимая среда Глазго (Sigma-Aldrich G5154), содержащая 100 мМ 2-меркаптоэтанола (Life tech, кат. 21985023), 1 × Minimum Essential Media, незаменимые аминокислоты (Sigma-Aldrich, M7145), 2 мМ L-глутамин (Life tech, кат. 25030024), 1 мМ пируват натрия (Sigma-Aldrich, S8636-100ML), 10% фетальная бычья сыворотка (HyClone FBS, номер партии SZB20006, GE Healthcare Austria SV30180.03) и 10 нг / мл mLIF (предоставлено кафедрой биохимии Кембриджского университета). Их пассировали каждые 2 дня, промывая PBS (Sigma-Aldrich, D8537), добавляя 0,25% трипсин-ЭДТА (Life tech, кат. 25200072) для отделения клеток, а затем промывая в среде перед повторным посевом в свежую среду. Чтобы помочь клеткам прикрепиться к поверхности, планшеты инкубировали в течение 15 мин при комнатной температуре в PBS, содержащем 0,1% желатина (Sigma Aldrich, G1890). Фоновые линии ES-клеток E14tg2a (доступные от Sigma Aldrich, 08021401) были охарактеризованы с помощью количественной ПЦР, RNA-seq, ChIP-seq и анализов активности, и их обычно проверяли на контаминацию микоплазмой и дали отрицательный результат.

ES-клетки, экспрессирующие мышиный CHD4, помеченный на С-конце mEos3.2-HaloTag, генерировались путем нокаута на основе CRISPR / Cas9 кассеты, содержащей mEos3.2-HaloTag и ген селекции пуромицина в один аллель CHD4 ячейки ES ³⁷. Затем кассету пуромицина удаляли с использованием рекомбиназы Dre для генерации аллеля CHD4 с помощью слияния mEos3. 2-HaloTag на С-конце. Поскольку нокаут CHD4 является летальным, мы использовали анализы жизнеспособности клеток, чтобы убедиться, что функция меченого CHD4 не пострадала.Линия ES-клеток E14tg2a ⁶⁷, экспрессирующая mEos3.2-tagged CENP-A, была ранее описана ⁵⁹, но вкратце была создана путем трансфекции плазмиды, экспрессирующей меченый белок, с последующим отбором в 500 мкг / мл генетицина (Life tech , кат.10131019). После 2 недель отбора генетицина клетки сортировали с использованием проточного сортировщика MoFlo (Beckman Coulter), чтобы гарантировать, что они были помечены флуорофором mEos3.2 (возбуждение при 488 нм, испускание при 515 нм). Чтобы проверить наличие одномолекулярного FRET между mEos3.2 или PA-JF ₅₄₉ и JF ₆₄₆ на разных белках, векторы, экспрессирующие CENP-A с тегами HaloTag и SNAP, были созданы путем вставки последовательности тегов HaloTag или SNAP в сайт NcoI / XhoI mEos3.2. -меченый вектор CENP-A, описанный выше ⁵⁹. Один только белок HaloTag также экспрессировался в том же векторе, что и контроль. Вектор, экспрессирующий гистон h3B с меткой SNAP, был ранее описан ⁴⁵.

Визуализация живых клеток и фиксированных клеток млекопитающих с одной молекулой

ES-клетки, экспрессирующие mEos3.CHD4, меченный 2-HaloTag, пассировали за 2 дня перед визуализацией на 35-миллиметровых чашках со стеклянным дном № 1.0 (MatTek Corporation P35G-1.0-14-C Case) в сыворотке без фенолового красного и в условиях mLIF. Непосредственно перед визуализацией, если необходимо, клетки метили 5 мкМ лиганда HaloTag-JF ₆₄₆ в течение не менее 15 минут с последующими двумя промывками в PBS и 30-минутной инкубацией при 37 ° C в среде перед визуализацией клеток в свежая сыворотка без фенолового красного и условия LIF, содержащие 5 мМ Trolox. Флуоресцентные изображения in vivo собирали в виде видеороликов из 10 000 кадров при экспозиции 500 мс.Непрерывное фотопреобразование было достигнуто с использованием лазера с длиной волны 405 нм при низкой мощности активации ~ 10 Вт / см ².

Для отслеживания белкового комплекса ES-клетки, экспрессирующие гистон h3B, меченный SNAP, или mEos3.2-, HaloTag- и CENP-A, меченный SNAP, генерировали путем трансфекции соответствующих векторов экспрессии. Четыре микролитра Lipofectamine® 2000 (Life tech, кат. 11668027), инкубированных в 100 мкл OPTI-MEM® I Reduced Serum Medium (Thermo Fisher Scientific, кат. 31985070) в течение 5 минут, добавляли примерно к 2–3 мкг раствора. векторы экспрессии, также инкубированные в 100 мкл OPTI-MEM® в течение 5 мин.Затем смесь инкубировали еще в течение 15 мин перед добавлением к ES-клеткам, которые одновременно пассировали на чашки со стеклянным дном 35 мм. Через 2 дня клетки метили с использованием соответствующих лигандов HaloTag, как описано выше для CHD4. Лиганды меток SNAP также были помечены аналогичным образом, но с начальной инкубацией за 30 минут до промывки.

FRET был оптимизирован за счет обеспечения избытка акцепторного красителя вокруг донора mEos3.2 или PA-JF ₅₄₉. Для FRET между mEos3.2-tagged CENP-A и JF ₆₄₆ -tagged CENP-A, это было выполнено путем трансфекции 0,4 мкг CENP-A с меткой mEos3.2 или CENP-A с меткой SNAP вместе с 2 мкг CENP-A с меткой HaloTag. А. Для FRET между PA-JF ₅₄₉ с меткой и JF ₆₄₆ с меткой CENP-A или PA-JF ₅₄₉ с меткой и h3B с меткой JF ₆₄₆, это было достигнуто путем мечения клеток после трансфекции 0,2 µM SNAP-tag PA-JF ₅₄₉ лиганд и 2 µM SNAP-tag JF ₆₄₆ лиганд. Наконец, для CENP-A / h3B FRET — 1 мкг mEos3.2-меченый CENP-A трансфицировали вместе с 1 мкг SNAP-меченного CENP-A и метили 5 мкМ SNAP-tag JF ₆₄₆ лигандом. Клетки, экспрессирующие конструкцию mEos3.2-CENPA, PA-JF ₅₄₉ -CENP-A или PA-JF ₅₄₉ -h3B, были идентифицированы по их способности фотоактивировать отдельные молекулы с использованием лазера 405 нм и клеток, меченных лиганды HaloTag-JF ₆₄₆ или SNAP tag JF ₆₄₆ по их локализации в центромерных фокусах или в ядре (для HaloTag-CENP-A или h3B с меткой SNAP, соответственно), как определено с помощью визуализации с использованием лазера с длиной волны 641 нм. (1 кВт / см ²).Флуоресцентные изображения фиксированных и живых клеток собирали в виде видеофильмов размером от 3000 до 5000 кадров при экспозиции 500 мс. Фотопреобразование достигалось с использованием 100 мс экспозиции лазера 405 нм каждые 6 с при низкой мощности активации ~ 10 Вт / см ². Для фиксации клеток клетки промывали PBS, фиксировали при комнатной температуре в PBS, содержащем 4% формальдегид, в течение 15 минут, снова промывали в PBS и затем ресуспендировали в PBS, содержащем 5 мМ Trolox.

Обработка и анализ изображений клеток млекопитающих

Фильмы с живыми клетками и фиксированными клетками одиночных молекул были проанализированы с использованием программного обеспечения Rapidstorm, которое определяет локализации одиночных молекул из фильмов PALM ⁶⁸, после использования коррекции фона катящегося шара изображения с радиусом 5 пикселей.Были проанализированы только флуоресцентные точки шириной менее 5 или 3 пикселей (для микроскопов 1 и 2 соответственно) и с фиксированным глобальным порогом выше 25000. Чтобы отслеживать отдельные молекулы CHD4, CENP-A или h3B, мы использовали специальный код для соединения локализаций отдельных молекул и извлечения длины их траекторий (сценарий можно найти на https://github.com/TheLaueLab/trajectory-analysis) . Флуоресцентные точки считались одной и той же молекулой, если они находились в пределах 100 нм между кадрами, потому что мы не ожидаем увидеть более высокие коэффициенты диффузии для связанного h3B / CENP-A / CHD4.Молекулы все еще были связаны, если они не были обнаружены в течение 1 кадра, чтобы уменьшить вероятность того, что молекулы на короткое время упадут ниже порога отношения сигнал-шум. Траектории меньше трех локализаций отбрасываются, чтобы снизить вероятность обнаружения шума. Средняя интенсивность этих траекторий также была извлечена для расчетов эффективности FRET — мы игнорируем первый и последний кадры, потому что молекула могла не флуоресцировать на всех этих кадрах. Изображения одиночных молекул, представленные на рис.4 были сгенерированы с использованием Peak Fit, так что локализации представляют точность, с которой они были локализованы ⁶⁹. Точность локализации была рассчитана после анализа Rapidstorm путем подбора гистограммы парных расстояний до ближайших соседей ⁷⁰.

Для отслеживания живых клеток односвязанных молекул CHD4 эксперимент был воспроизведен дважды на Микроскопе 1 и один раз на Микроскопе 2. Мы снова решили проанализировать наборы данных с Микроскопа 1, записанные в тот же день, чтобы уменьшить систематические ошибки, возникающие из-за незначительно отличающихся друг от друга микроскопов. выравнивания.Мы собрали 772 и 539 траекторий одиночных молекул из фильмов одиночных молекул, содержащих mEos3.2- и mEos3.2 – JF ₆₄₆-меченые молекулы CHD4, соответственно (обычно в каждом фильме изучались две клетки). Учитывая, что 10–30% отдельных молекул mEos3.2 – JF ₆₄₆ находились во включенном состоянии дольше, чем отдельные молекулы mEos3.2, это подходящий размер выборки, чтобы продемонстрировать наблюдаемые нами изменения.

Для анализа близости белка FRET CENP-A было собрано больше траекторий, потому что mEos3 относительно мало.Предполагалось, что молекулы с двумя метками будут находиться рядом с молекулами с меткой JF ₆₄₆. Эксперимент был воспроизведен один раз на Микроскопе 1 и дважды на Микроскопе 2, и мы проанализировали один из наборов данных из Микроскопа 2, в котором мы собрали 17 953, 17 288 и 21 018 траекторий из одномолекулярных фильмов mEos3.2-CENP-A, mEos3. .2-CENP-A / JF ₆₄₆ -CENPA и mEos3.2-CENP-A / JF ₆₄₆ -h3B, соответственно (обычно в каждом фильме изучались четыре клетки). Учитывая, что ~ 0,1–1% mEos3.2 молекулы в присутствии помеченных JF ₆₄₆ молекул находились во включенном состоянии дольше, чем отдельные молекулы mEos3.2, это подходящий размер выборки, чтобы продемонстрировать наблюдаемые нами изменения.

Для анализа близости h3B FRET эксперимент был воспроизведен дважды на Микроскопе 2, и мы проанализировали один из наборов данных, в которых мы собрали 2114 и 3970 траекторий из фильмов с одной молекулой PA-JF ₅₄₉ -h3B и PA-JF. ₅₄₉ -h3b / JF ₆₄₆ -h3B соответственно (обычно в каждом фильме изучались четыре ячейки).Учитывая, что 10% молекул PA-JF ₅₄₉ в присутствии молекул с меткой JF ₆₄₆ находились во включенном состоянии более 1% от одиночных молекул PA-JF ₅₄₉, это подходящий размер образца. чтобы продемонстрировать наблюдаемые нами изменения. Траектории длиннее 1% одиночных молекул PA-JF ₅₄₉ были идентифицированы и окрашены в синий цвет. Эффективность FRET рассчитывалась с использованием средней интенсивности молекул, меченных одним PA-JF ₅₄₉. Карты плотности шириной 2 пикселя (312 нм) были созданы, чтобы показать количество молекул, обнаруженных в пределах области, и была ли средняя длина трека ниже (желтый) или выше 12 с (синий), доверительный интервал 1% установлен таким образом, что существует 1% -ная вероятность того, что молекулы, помеченные PA-JF ₅₄₉, имеют длину трека более 12 с.

Доступность данных

Наборы данных, созданные и проанализированные в ходе текущего исследования, доступны у авторов по запросу.

Доступность кода

Программное обеспечение, используемое для фотофизического анализа in vitro и отслеживания живых клеток, можно найти на https://github.com/TheLaueLab/blink-analysis и https://github.com/TheLaueLab/trajectory-analysis , соответственно. Другое используемое программное обеспечение включает микро-менеджер программного обеспечения с открытым исходным кодом (https://www.micro-manager.org), ImageJ64,65, Rapidstorm68 и PeakFit69.

Taylor 522ce-12 Fret 2018 — Factory Demo

Спасибо, что заглянули на страницу реверберации Хаггерти. Вы просматриваете модель Taylor 522ce 12-Fret в идеальном состоянии, которая поступила в магазин прямо из выставочного зала Taylor Guitars Factory в качестве демонстрации бывшей в употреблении напольной модели.

Гарантия НЕ распространяется на эти демонстрационные гитары, и они обычно находятся в состоянии «Как новый».

Инспекция приборов Хаггерти

TOP : Отличное состояние — очень легкие признаки использования, состоящие из незначительных царапин на поверхности возле звукового отверстия.
НАЗАД : как новый
СТОРОНЫ : как новый
ШЕЯ : как новое Состояние — Чистая, без износа
ACTION : Низкая и удобная — Заводская установка
ПОДГОЛОВКА : Отличное состояние — Одна легкая потертость спереди / сверху
ЭЛЕКТРОНИКА : Полностью функциональная
ОБОРУДОВАНИЕ : Идеальное состояние
PICKGUARD : НЕТ
КОРПУС : Как новый

Это не то, что вы ищете?

Haggerty’s Music поддерживает на складе в среднем 500 различных моделей гитар.Мы гордимся тем, что являемся дилером Premiere Taylor с одним из самых больших выборов в Соединенных Штатах! Позвоните нам и спросите обо всех уникальных моделях, которые у нас есть на складе, от красивых обычаев до действительно уникальных гитар a kind !

522ce 12 ладов

Как и другие 12-ладовые модели Тейлора, это издание, полностью выполненное из красного дерева, выводит играбельность на новый уровень благодаря плавному ощущению руки на струнах и удивительно теплому и мощному голосу.Шкала длиной 24-7 / 8 дюймов сокращает расстояние между ладами и снижает натяжение струн, а более центральное положение перемычки в нижней части позволяет верху выдавать более сильный отклик. Благодаря новым креплениям Performance на серии 500 каждая модель уникально оптимизирована для увеличения громкости, проецирования и тепла. Эстетические усовершенствования включают корпус и шею с затемненными краями, переплет из панциря искусственной черепахи, розетку из панциря искусственной черепахи в обрамлении зернистого цвета слоновой кости и инкрустацию на грифе Century из зернистого цвета слоновой кости. Венецианский вырез дает вам больше доступа к верхнему регистру, в то время как электроника Taylor Expression System 2 естественным образом улавливает тональные нюансы гитары.

Технические характеристики

Особенности

Длина шкалы: 24-7 / 8 «
Гайка и седло: Гайка Tusq / Седло Micarta
Крепление: Performance с разгрузочной выемкой
Пластиковая крышка анкера
Количество ладов: 18
Тюнеры: Taylor Slot Head
Корпус: Taylor Deluxe Hardshell Brown
Марка струн: Elixir Phosphor 9039 Light Body 19 1/2 «
Ширина корпуса: 15″
Глубина корпуса: 4 3/8 «

Кузов

Переплет / обработка краев: Черепаха
Верхняя отделка: Глянец
Конфигурация задней части: 2-х компонентная без клина
Размер розетки: Одиночное кольцо
: Глянец
Мат. Зернистый ивороид / черепаха / зернистый ивороид
Пятно / солнечные лучи: Средне-коричневое пятно с заштрихованной кромкой с разрывом

Шейка

Ширина грифа: 1-3 / 4 «
Накладка на гриф: Century
Крепление на гриф / обработка кромки: Ebony
Крепление на пятку: Ebony Тип
Ebony Тип
Шейный шарнир: Тейлор Гриф
Гриф / каблук: Тропическое красное дерево
Древесина грифа: Эбеновое дерево
Гриф: Атлас
Каблук 3 / 4-1

Peghead

Поверхность Peghead: Глянцевая
Peghead Тип: Пазовая головка
Накладка передней бабки: Ebony
Логотип Peghead: Зернистый ивороид

9 9039

Прочее

Мостовидные штифты: Ebony
Кнопки: Grained Ivoroid

Информация о доставке : Все заказы требуют подписи для подтверждения доставки, если не указано иное. Если вы не хотите подписывать свой заказ, сообщите нам об этом через Reverb Messenger. Сделав заказ в Haggerty’s Music, вы можете рассчитывать на быструю, бесплатную и застрахованную доставку.

ЛИХОРАДКА И FRET

Описание

Кинорежиссеры и актеры.

Элеонора, застенчивая артистичная одиночка, выросшая в Бронксе, мучается в школе из-за больших родинок на лице. Ночью она начинает посещать другой мир и встречает другое существо.Но когда Элеонора вынуждена вступить в конфронтацию в школе, ей, возможно, придется навсегда покинуть свой потусторонний мир.

Совместно с нашим партнером по сообществу: Торговой палатой Голливуда FilAm (FACCHO) и фестивалем Silent River Film

Биография директора

Кэт Гулик — режиссер из Нью-Йорка. Мировая премьера ее предыдущего короткометражного фильма состоялась на Slamdance, где Film Threat назвал его «очень забавным и хорошо сыгранным». Она помогала продюсировать пародийные шоу «Guilty Pleasures» и «The Blushing Diamond Review», которые были опубликованы в New York Magazine, а также работала ассистентом оператора в фильме Джереми Солнье «MURDER PARTY».Совсем недавно она написала, продюсировала, направила, сфотографировала и отредактировала свой первый полнометражный фильм «Лихорадка и лоб».

Кредиты

Режиссер : Кэт Гулик
Сценарист : Кэт Гулик
Продюсер : Ники Яновски, Виктория Негри
Исполнительный продюсер : Аделина Амоско, Уэйн Чанг
Оператор-постановщик : Кэтил Гулик

Кастинг-директор : Уэйн Чанг
В ролях : Аделина Амоско, Айвори Акино, Кэтлин Чанхо, Ширли Куюган О’Брайен, Ванесса Кармона, Дженни Мун

, предшествовавшая

ELLA
Дэн Чен / Конкурс короткометражных фильмов / США / 2017 / Приключения, Достижение совершеннолетия, Драма, Социальные проблемы, Женщины / 16 мин.
Во время игры «Беглец» в маленьком городке мальчик-подросток сталкивается со своими чувствами к девушке своего старшего брата.
Предыдущая: Лихорадка и лоб

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.

Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

В вашем браузере отключены файлы cookie.Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить, хотите ли вы принимать файлы cookie.
Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie.Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.

Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файле cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

Ускоренная микроскопия FRET-PAINT | Молекулярный мозг

Ускоренная диссоциация донорных цепей

Экспериментальная схема FRET-PAINT и приборная установка кратко представлены на рис. 1а. В предыдущей работе мы использовали EMCCD (iXon Ultra DU-897 U-CS0- # BV, Andor) с максимальной частотой кадров 56 Гц и областью изображения 512 × 512. Однако из-за медленной диссоциации ДНК-зондов фактическая частота кадров составляла 10 Гц. В этой работе мы заменили EMCCD камерой sCMOS (ORCA-Flash 4.0 V2, Hamamatsu) с максимальной частотой кадров 400 Гц для того же размера области изображения. Однако из-за фотоиндуцированного повреждения ДНК-зондов, которое будет объяснено более подробно позже, максимальная используемая частота кадров составляла 200 Гц. Чтобы компенсировать короткое время экспозиции, интенсивность освещения следует увеличивать пропорционально частоте кадров. По той же причине фотоиндуцированного повреждения ДНК мы использовали мощность освещения 1,5 кВт / см ², что всего в 3,3 раза больше, чем в предыдущей работе 460 Вт / см ².

Рис. 1

| Ускоренная диссоциация донорских цепей. ( a ) Схема микроскопии FRET-PAINT. Акцептор флуоресцирует только через FRET, а его сигнал улавливается высокоскоростной камерой sCMOS. Донорный сигнал отклоняется полосовым фильтром. ( b ) Нити ДНК, использованные в экспериментах: стыковочные (черные), донорные (синие) и акцепторные (красные) цепи. Длину донорной цепи контролировали путем усечения 5′-конца донорной цепи. Акцепторные и донорные флуорофоры помечены в обозначенных позициях.( c-f ) Время диссоциации донорных цепей длиной 9 нуклеотидов ( c ), 8 нуклеотидов ( d ), 7 нуклеотидов ( e ) и 6 нуклеотидов ( f ). На левой панели показаны характерные временные кривые FRET, в которых высокое и низкое состояния FRET соответствуют связанным и несвязанным состояниям, соответственно. Правые панели показывают гистограммы времен диссоциации. Время диссоциации было получено путем аппроксимации гистограмм экспоненциальной функцией затухания: 670 мс (9 нт), 63 мс (8 нт), 4,8 мс (7 нт) и 3.7 мс (6 нт)

Чтобы полностью использовать увеличенную частоту кадров sCMOS-камеры, необходимо также увеличить скорость переключения ДНК-зондов; если диссоциация ДНК-зонда происходит медленно, то при более низких концентрациях зонда пятна одной молекулы начинают перекрываться, ограничивая общую скорость визуализации. Были определены времена диссоциации донорных цепей разной длины. Были протестированы четыре различных донорских нити (рис. 1б, синий). На рис. 1c-f показаны характерные временные кривые (слева) и гистограммы времени диссоциации донорных цепей (справа).Полученное время диссоциации составляло 670 мс (9 нт), 63 мс (8 нт), 4,8 мс (7 нт) и 3,7 мс (6 нт). Измеренные времена диссоциации донорных нитей 7 нт и 6 нт были короче времени экспозиции камеры (5 мс) и должны считаться неточными. Мы выбрали донорные нити длиной 7 нт для частоты кадров 100 или 200 Гц, используемых в данной работе. Auer et al. ранее использовали донорные нити длиной 7 нт [11], но время диссоциации нити было намного больше (88 мс), чем у нас (4,8 мс).

Улучшенное отношение сигнал / шум (SNR)

Фоновый шум, исходящий от плавающих донорных и акцепторных нитей, ограничивает максимальную концентрацию зонда, которую можно использовать. Чтобы уменьшить фоновый шум и, как результат, увеличить максимальную концентрацию зонда для получения разумного отношения сигнал / шум (SNR), мы сначала попробовали разные пары донор-акцептор, кроме Alexa Fluor 488 (AF488, Invitrogen) -Cy5. (GE Healthcare), использованная в предыдущей работе. Что касается фонового шума, чем больше спектральное разделение излучения донора и акцептора, тем лучше отношение сигнал / шум. Было проведено сравнение спектров поглощения и возбуждения красителей Alexa [12], Atto dyes [13, 14], красителей CF [15] и Cy [12], и в качестве кандидатов на замену были выбраны CF488A (Biotium) и CF660R (Biotium). AF488 и Cy5 соответственно.На рис. 2а сравниваются спектры возбуждения (пунктирные линии) и излучения (сплошные линии) AF488 (черный), CF488A (красный), Cy5 (пурпурный) и CF660R (фиолетовый). Спектры поглощения и излучения CF488A смещены в синий цвет по сравнению со спектрами AF488, тогда как их коэффициенты экстинкции аналогичны на пиках. С другой стороны, спектр излучения CF660R смещен в красную область по сравнению со спектром излучения Cy5. В качестве дополнительных усилий по улучшению отношения сигнал / шум мы также заменили длиннопроходный фильтр 640 нм (зеленая пунктирная линия) на полосовой фильтр 700/75 (зеленая сплошная линия).Поскольку полосовой фильтр имеет длину волны отсечки с красным смещением, чем длиннопроходный фильтр, некоторая часть сигнала акцептора теряется при замене, но мы ожидали, что уменьшение просачивания донора приведет к увеличению отношения сигнал / шум при высоком уровне донорной цепи. концентрации. Как и ожидалось из того факта, что CF488A имеет больший коэффициент экстинкции, чем AF488 при 473 нм, пара CF488A-Cy5 дала больше фотонов, чем пара AF488-Cy5 при той же мощности возбуждения (рис. 2b). Фоновый шум и, следовательно, отношение сигнал / шум были значительно улучшены за счет использования полосового фильтра вместо длиннопроходного.Фоновый шум и отношение сигнал / шум также были улучшены с парой CF488A-Cy5, чем с парой AF488-Cy5 (рис. 2c, d). Примечательно, что упомянутый выше процесс оптимизации практически полностью устранил донорское просачивание, и в результате зависимость отношения сигнал / шум от концентрации донора была очень слабой (рис. 2d). Вопреки нашим ожиданиям, мы обнаружили, что замена Cy5 на CF660R не улучшила SNR, потому что CF660R имеет более высокое прямое возбуждение, чем Cy5, на длине волны 473 нм (дополнительный файл 1: рисунок S1).Поскольку CF660R имеет более низкое прямое возбуждение, чем Cy5 на 488 нм, мы ожидаем, что CF660R может обеспечить лучшую производительность, если мы будем использовать лазер возбуждения 488 нм вместо лазера 473 нм в будущей работе. В этой работе мы использовали исключительно пару CF488A-Cy5 при возбуждении 473 нм.

Рис. 2

| Улучшенное отношение сигнал / шум (SNR). ( a ) Спектры возбуждения (пунктирные линии) и излучения (сплошные линии) донорного (AF488, черный; CF488A, красный) и акцепторного (Cy5, пурпурный; CF660R, фиолетовый) флуорофоров.Вертикальная синяя пунктирная линия указывает длину волны возбуждения 473 нм, вертикальная зеленая пунктирная линия указывает длину волны отсечки длиннопроходного фильтра 640 нм, а зеленая сплошная линия указывает кривую пропускания полосового фильтра 700/75 м. ( b ) Сигнал акцептора пар AF488-Cy5 (черный) и CF488A-Cy5 (красный) при мощности возбуждения 1,5 кВт / см ², зарегистрированный с помощью sCMOS-камеры и полосового фильтра. Сигнал приемника пары AF488-Cy5 (синий) при мощности возбуждения 460 Вт / см ², зарегистрированный камерой EMCCD и длиннопроходным фильтром.Сигнал определяется как амплитуда двумерной гауссовой функции каждого пятна одной молекулы. Белые квадраты обозначают измеренные значения, а сплошные линии обозначают подогнанные кривые с функцией Гаусса. Пара CF488A-Cy5 дает более высокую интенсивность. ( c ) Фоновый шум пар AF488-Cy5 (черный) и CF488A-Cy5 (красный) при мощности возбуждения 1,5 кВт / см ² с камерой sCMOS и полосовым фильтром. Фоновый шум пары AF488-Cy5 (синий) при мощности возбуждения 460 Вт / см ² с камерой EMCCD и длиннопроходным фильтром.Фоновый шум определяется как FWHM гауссовой функции фонового сигнала. Белые квадраты обозначают измеренные значения, а сплошные линии обозначают подогнанные кривые с квадратным корнем из концентрации донорной цепи. Полосовой фильтр значительно снижает фоновый шум, а пара CF488A-Cy5 дает более низкий фоновый шум, чем пара AF488-Cy5. Горизонтальная зеленая пунктирная линия указывает фоновый шум без донорных и акцепторных цепей, который в основном вызван автофлуоресценцией, исходящей из покровного стекла.( d ) SNR пар AF488-Cy5 (черный) и CF488A-Cy5 (красный) при мощности возбуждения 1,5 кВт / см ², зарегистрированное камерой sCMOS и полосовым фильтром, а также AF488-Cy5 пара (синяя) при мощности возбуждения 460 Вт / см ², записанная камерой EMCCD и длиннопроходным фильтром. SNR определяется как отношение сигнала к фоновому шуму. Белые квадраты обозначают рассчитанные значения, а сплошные линии обозначают подогнанные кривые с функцией, обратной квадратному корню от концентрации донорной цепи.Пара CF488A-Cy5 с камерой sCMOS и полосовым фильтром дает наивысшее SNR при высокой концентрации донорных цепей

Характеристика скорости визуализации нового микроскопа

Чтобы охарактеризовать улучшенную скорость визуализации нового микроскопа, мы сравнили скорость визуализации нового микроскопа FRET-PAINT по сравнению с предыдущим. В качестве модельной системы были отображены микротрубочки клеток COS-7. Для нового микроскопа использовались донорные нити длиной 7 нт и мощность возбуждения 1,5 кВт / см ², тогда как для старого микроскопа использовались донорные нити 9 нт и мощность возбуждения 460 Вт / см ².На рис. 3а показано изображение со сверхвысоким разрешением, полученное на старом микроскопе с частотой кадров 10 Гц и временем сбора данных 1 мин. Для визуализации использовали 30 нМ меченных AF488 донорных цепей и 20 нМ меченных Cy5 акцепторных цепей. На рис. 3b и c показаны изображения сверхвысокого разрешения, полученные с помощью нового микроскопа с частотой кадров 100 Гц для рис. 3b или 200 Гц для рис. 3c. Для визуализации общее время сбора данных составляло 1 мин, и использовали 300 нМ меченных CF488A донорных цепей и 300 нМ меченных Cy5 акцепторных цепей.Как видно из рисунков, новый микроскоп давал изображения более высокого качества, чем предыдущая установка FRET-PAINT, за более короткое время. Ширина поперечного сечения микротрубочек была подобна ранее сообщенному значению (дополнительный файл 1: Рисунок S2) [11]. Чтобы показать улучшенное качество изображения более подробно, покадровые изображения областей, выделенных рамкой на фиг. 3a-c, также показаны на фиг. 3d-f соответственно. Чтобы количественно сравнить качество изображения на рис. 3a-c, мы сравнили разрешения изображения в зависимости от времени получения изображения (рис.3г). Разрешение было получено методом корреляции колец Фурье [16, 17]. Примечательно, что разрешение достигло предела (42 нм для 100 Гц, 46 нм для 200 Гц) через 20–30 с с новой установкой FRET-PAINT, тогда как разрешение все еще снижается даже через 60 с с предыдущей FRET-PAINT. настраивать. В принципе, разрешение, определяемое методом корреляции кольца Фурье, зависит как от точности локализации, так и от плотности локализации [16,17,18,19]. Плотность локализации линейно пропорциональна времени визуализации (рис.3h), тогда как точность локализации не зависит от времени. Таким образом, мы можем сделать вывод, что для времени получения изображений в течение десятков секунд разрешение изображения определяется точностью локализации в новом микроскопе. С другой стороны, для того же времени получения изображения разрешение изображения определяется плотностью локализации в старом микроскопе. Плотность локализации как функция времени визуализации на рис. 3h дает еще один способ сравнить скорость визуализации микроскопов. Скорость локализации увеличена на 5.4 раза для изображения 100 Гц и 8 раз для изображения 200 Гц.

Рис. 3

| Характеристика скорости изображения нового микроскопа. В качестве модельной системы использовались изображения микротрубочек со сверхвысоким разрешением фиксированных клеток COS-7. ( a ) Изображение было восстановлено из 600 кадров, записанных с частотой кадров 10 Гц с помощью предыдущего микроскопа (камера EMCCD, фильтр длинного прохода, 460 Вт / см ² мощность возбуждения, 30 нМ 9 нт AF488 донорные цепи, 20 нМ 10 нМ акцепторных цепей Cy5).( b , c ) Изображения были восстановлены из 6000 кадров, записанных с частотой кадров 100 Гц ( b ) или 12000 кадров, записанных с частотой кадров 200 Гц ( c ) с новым микроскопом ( камера sCMOS, полосовой фильтр, мощность возбуждения 460 Вт / см (²), 300 нМ 7 нМ донорных цепей CF488A, 300 нМ 9 нМ акцепторных цепей Cy5). Буфер для визуализации (10 мМ Трис-HCl, pH 8,0, 500 мМ NaCl, 1 мг / мл глюкозооксидазы, 5 мг / мл глюкозы, 0,04 мг / мл каталазы и 1 мМ Trolox) использовали для всей визуализации.Все изображения были восстановлены с помощью ThunderSTORM [23] с методом максимального правдоподобия. Общее время визуализации для всех изображений составляет 60 с. ( d — f ) Цейтраферные изображения областей в рамке в a — c в указанное время формирования изображения. ( g ) Разрешение изображения a — c с использованием метода кольцевой корреляции Фурье в зависимости от времени визуализации. Белые квадраты обозначают измеренное значение, а сплошные линии обозначают подогнанные кривые с функцией экспоненциального затухания.( ч ) Плотность локализации как функция времени визуализации (100 Гц, черный; 200 Гц, красный; 10 Гц, синий). Плотность локализации определяется как количество событий локализации на 1 мкм ². Чтобы свести к минимуму влияние интересующей области, выбранной для анализа данных, плотность локализации была рассчитана из 10 различных областей 5 разных ячеек. Прямоугольники в квадрате указывают на среднее значение, а полосы ошибок указывают на стандартное отклонение. Скорость увеличения плотности локализации составила 21 (10 Гц), 114 (100 Гц) и 168 (200 Гц) локализации / мкм ² / с.Мы получили увеличение в 5,4 раза для изображения 100 Гц и в 8 раз увеличение для изображения 200 Гц по сравнению со старым микроскопом. Масштабные планки: 5 мкм ( a — c ), 1 мкм ( d — f )

2018 Goodall TmhLD 12-ладовый дредноут с наклоном плеча — Northern Lights Music

Звоните, чтобы узнать цены.

Артикул TmhLD6657

Первоначально эта лучшая модель Goodall была выставлена на продажу Sound Pure в Северной Каролине за 7470 долларов и украшена тончайшим фигурным красным деревом и адирондакской елью.Этот инструмент излучает тепло и глубину как по тону, так и по громкости, сохраняя при этом четкую чистоту. Mahogany обладает богатым музыкальным балансом, в паре с Adirondack он разгоняется от 0 до 60 за 0,01 секунды. Удивительно отзывчивая как на пальцевую, так и на агрессивную плоскую игру, эта гитара способна на все. Все это связывает красивая фигурная кленовая повязка на туловище и шее. Традиционные винтажные элементы на остальной части гитары придают ей классический сдержанный вид даже с использованием древесины тона верхней полки.Будучи гитарой на 12 ладов, каждая нота в пределах досягаемости. Добавьте к этому шею среднего размера (не слишком тонкую и не слишком толстую), и вы получите чрезвычайно удобный инструмент для игры. Поставляется с оригинальным жестким корпусом.

Состояние: Отличное состояние, как и следовало ожидать от любимого и ухоженного инструмента, с обычной светлой отделкой и износом ладов. В позиции ковбойского аккорда есть вмятина на задней части шеи, которая ощущается только при игре аккорда F. Пикап был установлен опытной командой в Music Emporium в Массачусетсе.

Характеристики:

Форма: LD / TMhLD6657

Длина шкалы: 25,5 дюйма, шкала 12 ладов

Ширина шеи: 1,75 дюйма

Отделка горловины: сатин

Поверхность корпуса: уретан с глянцевым катализатором

Защита отмычек: Tor-tis

Задняя / боковая сторона Древесина: красное дерево AAA

Верхняя древесина: ель адирондак AAA

Переплет: клен

Отделка кромок: черное дерево / клен

Накладка на головку штифта: Ebony

Древесина грифа: Эбеновое дерево

Штифты мостовидные: самшит

Тюнеры: Waverly Nickel

Кнопки тюнера: Ebony

Вкладыш Peghead: Blacklip MOPG & Wings

Квадраты MOP для грифа

Розетка Материал: Елочка

Гайка / Седло: Кость

Верхняя древесина: Адирондакская ель
Сзади и по бокам: красное дерево
Форма корпуса: наклон D

Black Fret выходит за рамки $ 1 000 000 в виде грантов с 9000 номинантами 2018 года

Местная некоммерческая организация Black Fret, получившая гранты и выплаты остинским музыкантам всего за четыре года на сумму более 1 000 000 долларов, объявила на SXSW свой пятый класс номинантов.

В число номинантов Black Fret 2018 входят A Giant Dog, Billy King and the Bad Bad Bad, Дэйв Шер, Донован Кейт, борзые, Исраэль Нэш, Джейми Харрис, Джейн Эллен Брайант, Джефф Планкенхорн, Kalu and the Electric Joint, Los Coast, Megafauna. , Отис Разрушитель, Пало Дуро, Ребекка Лёбе, Застенчивый зверь, Техасский КГБ, Томар и ФК, Проблемы на улицах и Wood & Wire.

«Это большая веха», — сказал Колин Кендрик , соучредитель Black Fret. «Невероятные музыканты продолжают называть Остин, штат Техас, своим домом, а жители нашего прекрасного города продолжают выступать, становясь участниками Black Fret, чтобы поддержать нашу потрясающую музыкальную сцену.”

Trouble In The Streets — часть недавно объявленных номинантов на Black Fret 2018 года.
Courtesy photo

«Удивительно, что происходит, когда вы просите о помощи и обратитесь за профессиональным советом в этом городе. Музыкальное сообщество Остина очень благосклонно, и мы как группа получили от этого огромную пользу », — сказала Мариклер Глейзер из Shy Beast. «Какая честь быть номинированным на звание артиста Black Fret в этом году! Мы в восторге, и в наших парусах витает новый ветер ». Тейлор Уилкинс из Otis the Destroyer добавил: «Я наблюдал, как организация растет и помогает многим артистам на протяжении многих лет, и для меня большая честь быть среди них.”

Соул-певец из Остина Донован Кейт — один из номинантов на грант Black Fret 2018 года.
Courtesy photo

«Предстоящий сезон прослушивания Black Fret будет отличным, — сказала Эрин Айви , директор по работе с участниками Black Fret и исполнитель Black Fret 2014 года. «С таким большим классом номинантов каждое мероприятие станет уникальным событием, которым славится Black Fret».

Кандидаты на грант Томар и футбольные клубы усиленно работают над своей третьей записью. Courtesy photo

Black Fret объявил номинантов на 2018 год 14 марта более чем 1000 поклонникам музыки на мероприятии, проведенном во время SXSW в штаб-квартире легендарного рекламного агентства GSD&M в Остине, которое продемонстрировало всю глубину таланта, уже взращенного Black Fret.

Разное