2 • Дж (λ) • η-4 • QD] 1/6

, в которой κ -квадрат — коэффициент, описывающий относительную ориентацию в пространстве между переходными диполями донора и акцептора, Дж (λ) — интеграл перекрытия в области излучения донора. и спектры поглощения акцептора (с длиной волны, выраженной в нанометрах), η представляет показатель преломления среды, а Q (D) представляет собой квантовый выход донора.

Эффективность передачи энергии, E (T) , является мерой доли фотонов, поглощенных донором, которые передаются акцептору, и связана с расстоянием разделения донора и акцептора, r , соотношением уравнение:

r = R0 • [(1 / ET) — 1] 1/6

и E (T) оценивается как:

ET = 1 — (τDA / τD)

, где τ (DA) — время жизни донора в присутствии акцептора, а τ (D) — время жизни донора в отсутствие акцептора.Следовательно, измеряя время жизни донорной флуоресценции в присутствии и в отсутствие акцептора (что указывает на степень тушения донора из-за акцептора), можно определить расстояние, разделяющее молекулы донора и акцептора. Во многих обычно применяемых методах эффективность передачи энергии определяется путем измерения в установившемся режиме относительной средней интенсивности флуоресценции донора в присутствии и в отсутствие акцептора (а не путем измерения времени жизни).

Таким образом, скорость передачи энергии зависит от степени перекрытия спектров между спектрами излучения донора и поглощения акцептора (см. Рисунок 4), квантового выхода донора, относительной ориентации дипольных моментов перехода донора и акцептора, и расстояние, разделяющее молекулы донора и акцептора. Любое событие или процесс, которые влияют на расстояние между донором и акцептором, будут влиять на скорость резонансной передачи энергии, что позволяет количественно оценить явление при условии, что артефакты можно контролировать или устранять.

На рисунке 4 представлены спектры поглощения и излучения голубого флуоресцентного белка ( CFP , донор) и красного флуоресцентного белка ( RFP или DsRed , акцептор) в сравнении с их потенциальным применением в качестве пара резонансного переноса энергии флуоресценции. Спектры поглощения для обоих биологических пептидов показаны красными кривыми, а спектры испускания представлены синими кривыми. Область перекрытия спектров излучения донора и поглощения акцептора представлена ​​серой областью у основания кривых.Всякий раз, когда спектральное перекрытие молекул слишком сильно увеличивается, возникает явление, известное как спектральное просачивание или кроссовер , в котором сигнал от возбужденного акцептора (возникающий из возбуждающего освещения донора) и излучение донора обнаруживаются в акцепторный канал излучения. Результатом является высокий фоновый сигнал, который необходимо выделить из излучения слабой флуоресценции акцептора.

Основная теория безызлучательного переноса энергии напрямую применима к паре донор-акцептор, разделенной фиксированным расстоянием, и в этом случае скорость передачи энергии является функцией расстояния Ферстера, R (0) , которое в свою очередь зависит от κ -квадрат, Дж (λ) , η и Q (D) .Если эти факторы известны, можно рассчитать расстояние между донором и акцептором. Для описания таких ситуаций, как множественные акцепторные хромофоры и распределения расстояний, требуются более сложные формулировки. В таблице 1 представлена ​​серия экспериментально измеренных критических расстояний Фёрстера, которые были установлены из спектрального перекрытия нескольких популярных пар донорно-акцепторных флуорофоров. Поскольку переменная включает выход донорного кванта и степень спектрального перекрытия, оба из которых зависят от локализованных условий окружающей среды, значения расстояния Ферстера должны определяться в тех же экспериментальных условиях, что и те, которые используются для исследования резонансного переноса энергии.

Показатель преломления среды передачи энергии обычно известен из состава растворителя или может быть оценен для конкретной макромолекулы и обычно принимается равным 1,4 в водном растворе. Квантовый выход донора определяется путем сравнения со стандартными флуорофорами с известным квантовым выходом. Поскольку Q (D) появляется как шестой корень при вычислении R (0) , небольшие ошибки или неопределенности в значении Q (D) не имеют большого влияния на расчет расстояния Ферстера.Также из-за зависимости корня шестой степени, R (0) не сильно зависит от вариаций J (λ) , но интеграл перекрытия все равно должен оцениваться для каждой пары донор-акцептор. В общем, более высокая степень перекрытия между спектром излучения донора и спектром поглощения акцептора дает более высокие значения критического расстояния Ферстера.

Критическое расстояние Фёрстера для обычных пар донор-акцептор RET

(1) 5- (2-иодацетиламиноэтил) аминонафталин-1-сульфоновая кислота
(2) N- (4-диметиламино-3,5-динитрофенил) малеимид
(3) карбоксифлуоресцеинсукцинимидиловый эфир
(4) 4,4-дифтор-4-бора-3a, 4a-диаза-s-индацен

Таблица 1

Неопределенность в оценке фактора ориентации ( κ -квадрат) широко обсуждалась в литературе, и, несмотря на экспериментальные доказательства того, что теория Ферстера действительна и применима к измерению расстояний, эта переменная продолжала оставаться в силе. несколько спорно.Важно понимать, что расстояния Ферстера обычно приводятся для предполагаемого значения κ в квадрате, обычно это динамически усредненное значение 2/3 (0,67). Это предполагаемое значение является результатом рандомизации ориентации донора и акцептора за счет вращательной диффузии до передачи энергии. Фактор ориентации зависит от относительной ориентации в пространстве диполя излучения донора и диполя поглощения акцептора и может находиться в диапазоне от нуля до 4. Значение 1 соответствует параллельным диполям перехода, а значение 4 соответствует диполям, которые оба являются параллельные и коллинеарные.

Из-за связи корня шестой степени с расстоянием Ферстера, изменение коэффициента ориентации от 1 до 4 приводит только к 26-процентному изменению рассчитанного расстояния, а максимальная погрешность в 35 процентов возможна, когда обычно принимаемое значение 0,67 применяется. Наиболее серьезная потенциальная ошибка возникает, если диполи ориентированы точно перпендикулярно друг другу и соответствующее значение в квадрате κ становится равным нулю. Было использовано несколько методов работы с неопределенностью, включая предположение, что существует ряд статических ориентаций, которые не изменяются в течение времени жизни флуорофора в возбужденном состоянии.Измерения анизотропии флуоресценции донора и акцептора могут позволить определить пределы для κ -квадратного отклонения. Кроме того, использование флуорофоров с низкой поляризацией флуоресценции (из-за излучения нескольких перекрывающихся переходов) снижает неопределенность фактора ориентации. Ограничение возможных значений κ в квадрате таким образом снижает потенциальную ошибку вычисления расстояния до 10 процентов.

Во многих случаях фактор ориентации трудно, а то и невозможно определить, а точное значение переменной часто рассматривается как непреодолимая проблема.Однако некоторые свидетельства указывают на ограничение важности фактора в расчетах резонансного переноса энергии. Сравнение донорных и акцепторных расстояний с использованием резонансной спектроскопии переноса энергии и рентгеновской дифракции в значительной степени подтверждает обоснованность принятия значения 0,67 для фактора (как предлагается теорией Фёрстера), по крайней мере, для небольших пептидов и белков. Больше неопределенности существует для более крупных белков. Использование этого значения для фактора ориентации допустимо при предположении, что зонды донора и акцептора могут свободно совершать неограниченное изотропное движение.Дальнейшее обоснование получено из экспериментальных доказательств того, что для флуорофоров, прикрепленных одинарной или двойной связью к макромолекулам, сегментарные движения донора и акцептора имеют тенденцию приводить к динамически рандомизированным ориентациям.

Для слабосвязанных флуорохромов свободное вращательное движение вокруг одинарных связей должно позволить использовать среднее значение ориентации, но неограниченное движение молекул, связанных через несколько сайтов связывания, вероятно, не происходит. С другой стороны, крайние значения нуля и 4 для κ -квадрат требуют полной флуоресцентной поляризации донора и акцептора, что маловероятно.Статистические расчеты были представлены некоторыми исследователями, которые утверждают, что расстояния распределения донор-акцептор и их ориентация определяют наблюдаемое среднее расстояние. При условии, что наблюдается некоторое распределение наблюдаемого расстояния (и это не ограничивается слишком близким расположением донора и акцептора относительно R (0) ), можно надежно получить среднее расстояние между флуорофорами и оценить погрешность, обусловленную фактором ориентации. .

Зависимость фактора ориентации ( κ -квадрат) от относительной ориентации диполя излучения донора и диполя поглощения акцептора (показано на рисунке 5) дается уравнением:

2 = (cos θT — 3cos θDcos θA) 2 = (sin θD sin θAcos Φ — 2cos θDcos θA) 2

, где θ (T) — угол между диполем перехода излучения донора и диполем перехода поглощения акцептор, θ (D) и θ (A) — это углы между этими диполями и вектором, соединяющим донор и акцептор, а Φ — угол между плоскостями, содержащими два переходных диполя.

Эффективность передачи энергии наиболее чувствительна к изменениям расстояния, когда расстояние между донорами и акцепторами приближается к расстоянию Ферстера ( R (0) ) для двух молекул. Рисунок 6 иллюстрирует экспоненциальную зависимость между эффективностью переноса и расстоянием, разделяющим донор и акцептор. Эффективность быстро увеличивается до 100 процентов, когда расстояние разделения уменьшается ниже R (0) , и, наоборот, уменьшается до нуля, когда r больше, чем R (0) .Из-за сильной (шестой степени) зависимости эффективности переноса от расстояния измерения расстояния разделения донора и акцептора являются надежными только в том случае, если радиус донора и акцептора находится в пределах расстояния Ферстера в два раза. Когда r составляет приблизительно 50 процентов от R (0) , эффективность резонансной передачи энергии близка к максимуму, и более короткие расстояния не могут быть надежно определены. Когда расстояние донор-акцептор превышает значение R (0) на 50 процентов, наклон кривой настолько пологий, что более длинные разделительные расстояния не разрешаются.

Практическое значение критического расстояния Ферстера состоит в том, что это значение дает представление о диапазоне расстояний разделения, которые могут быть определены FRET для данной пары датчиков (см. Таблицу 1). Поскольку измерение передачи энергии очень чувствительно к изменению расстояния, когда расстояние донор-акцептор близко к расстоянию Ферстера, приблизительные размеры целевого молекулярного взаимодействия являются наиболее важным фактором при выборе пары флуоресцентных красителей.Другие факторы, которые следует учитывать, в зависимости от того, проводятся ли измерения в установившемся режиме или с временным разрешением, включают химическую стабильность, квантовый выход и время жизни флуорофора. Поскольку для обычных методов флуоресцентного резонансного переноса энергии не существует внутреннего эталона расстояния, расстояния, рассчитанные путем измерения эффективности переноса, относятся к расстоянию Ферстера, которое выводится из спектроскопических данных, измеренных на парах донор-акцептор.

Явление резонансной передачи энергии по механизму Ферстера сложно в некоторых аспектах, но простое и надежное по своему результирующему эффекту.Расстояния Ферстера точно предсказываются из спектральных свойств донора и акцептора, и, поскольку никаких исключений из теории еще не выявлено, можно предположить, что резонансная передача энергии происходит при любых условиях, при которых пара молекулы донор-акцептор находится в непосредственной близости. Сложность теории, описывающей перенос диполя, возникает не из-за самого механизма передачи, а из-за наличия распределений расстояний (включая неслучайные распределения) и диффузии молекул донора и акцептора.Когда предпринимаются шаги для усреднения зависимости передачи энергии от расстояния по диапазону геометрий и временных рамок, FRET представляет собой надежный метод исследования пространственного распределения между взаимодействующими молекулами.

Применение методов FRET в оптической микроскопии. FRET-микроскопия (см. Рисунок 7).В общем, микроскоп должен быть оборудован охлаждаемой и усиленной системой CCD-камеры с высоким разрешением (12 бит), соединенной с качественными интерференционными фильтрами, имеющими низкие уровни перекрестных помех (минимальный уровень блокировки) и полосы пропускания, соответствующие спектрам флуорофора. Чувствительность детектора определяет, насколько узкой может быть полоса пропускания фильтра, при этом сбор данных может продолжаться с приемлемой скоростью с минимальным спектральным сквозным шумом. В большинстве случаев для получения изображений следует использовать одно дихроматическое зеркало, соединенное с колесами или ползунками фильтров возбуждения и излучения, чтобы минимизировать или исключить сдвиги изображения.

Широкопольная флуоресцентная микроскопия страдает от испускания флуорофора, возникающего выше и ниже фокальной плоскости, что дает изображения со значительным расфокусированным сигналом, который снижает контраст и приводит к ухудшению качества изображения. Эта проблема усугубляется в микроскопии FRET из-за изначально низких уровней сигнала, возникающих в результате резонансной передачи энергии. Методы цифровой деконволюции могут быть связаны с оптическим секционированием, чтобы уменьшить или исключить сигналы вдали от фокальной плоскости, но этот процесс требует больших вычислительных ресурсов и может быть недостаточно быстрым для многих экспериментов по динамической визуализации FRET.Конфокальные методы лазерного сканирования могут применяться к FRET-микроскопии для значительного улучшения латерального разрешения, позволяя собирать последовательные оптические срезы с интервалами, приближающимися к реальному времени. Основным недостатком конфокальной микроскопии является ограничение длин волн возбуждения стандартными лазерными линиями, доступными для конкретной системы, что ограничивает выбор пар флуорофора донора и акцептора в экспериментах по резонансному переносу энергии. Многофотонное возбуждение также может использоваться в сочетании с методами FRET и меньше повреждает клетки из-за задействованных более длинных волн возбуждения.Кроме того, артефакты автофлуоресценции и фотообесцвечивание образца с меньшей вероятностью возникают в ограниченном объеме возбуждения, характерном для многофотонного возбуждения.

Типичная конфигурация микроскопа, позволяющая наблюдать живые клетки в культуре с несколькими мотивами изображения флуоресцентного резонансного переноса энергии, представлена ​​на рисунке 7. Инвертированный микроскоп для культуры тканей оснащен стандартной вольфрам-галогенной лампой на столбе для исследования и записи. Ячейки с использованием стандартного освещения светлого поля, фазового контраста или дифференциального интерференционного контраста ( DIC ).Обратите внимание, что последние два метода усиления контраста можно использовать в сочетании с флуоресценцией, чтобы выявить пространственное расположение флуорофоров в клеточной архитектуре. К тринокулярной головке микроскопа прикреплена стандартная система CCD-камеры с охлаждением Пельтье для получения широкоугольной флуоресценции и получения изображений в светлом поле.

Эксперименты по резонансной передаче энергии проводятся с использованием мультиспектрального излучения с использованием либо широкопольного освещения (дуговая разрядная лампа), либо конфокальной сканирующей приставки в реальном времени, оснащенной высокоскоростной дисковой системой Нипкова.Луч аргонно-криптонового лазера сначала фильтруется через акустооптическое устройство с перестраиваемой длиной волны для выбора конкретных длин волн возбуждения перед прохождением к конфокальной сканирующей головке. Изображения собираются с помощью двух охлаждаемых CCD-камер высокого разрешения Gen III с усиленным охлаждением, считывающих отдельные каналы, и передаются в буфер на главный компьютер. Сканирование образца в боковой ( x и y ) и осевой ( z ) плоскостях позволяет собирать оптические срезы для восстановления трехмерного изображения.Различные программы обработки изображений совместимы с проиллюстрированной конфигурацией микроскопа.

Основываясь на фундаментальных принципах явления, при проведении измерений резонансного переноса энергии флуоресценции с помощью оптического микроскопа следует учитывать ряд важных практических моментов:

• Необходимо тщательно контролировать концентрации донорных и акцепторных флуорофоров. Статистически самая высокая вероятность достижения резонансного переноса энергии флуоресценции происходит, когда несколько акцепторных молекул окружают одну донорную молекулу.
• Фотообесцвечивание необходимо устранить, поскольку артефакт может изменить молекулярное соотношение донора и акцептора и, следовательно, измеренное значение процесса резонансной передачи энергии.
• Спектр излучения донорной флуоресценции и спектр поглощения акцептора должны иметь значительную область перекрытия.
• Прямое возбуждение акцептора в диапазоне длин волн, используемом для возбуждения донора, должно быть минимальным. Распространенным источником ошибок в измерениях с помощью FRET-микроскопии в установившемся режиме является обнаружение донорной эмиссии с помощью наборов акцепторных фильтров.
• Длины волн излучения как донора, так и акцептора должны совпадать с максимальным диапазоном чувствительности детектора.
• Спектры поглощения и излучения донора должны иметь минимальное перекрытие, чтобы уменьшить возможность самопереноса от донора к донору.
• Донорная молекула должна быть флуоресцентной и иметь достаточно длительное время жизни, чтобы произошла резонансная передача энергии.
• Донор должен обладать низкой поляризационной анизотропией, чтобы минимизировать неопределенности в значении фактора ориентации (-квадрат).Этому требованию удовлетворяют доноры, испускание которых происходит в результате нескольких перекрывающихся переходов возбуждения.
• При использовании методов маркировки антител не следует изменять биологическую активность реагентов, конъюгированных с донорными и акцепторными флуорохромами. Любое снижение активности серьезно повлияет на достоверность результирующих измерений резонансного переноса энергии.
• Поскольку резонансный перенос энергии флуоресценции требует, чтобы молекулы донора и акцептора имели соответствующее дипольное выравнивание и располагались в пределах 10 нанометров друг от друга, необходимо учитывать третичную структуру реагентов, к которым присоединены молекулы.Например, когда донорно-акцепторные молекулы могут быть прикреплены к различным структурным местоположениям (таким как карбокси или аминоконце) на белке, возможно, что FRET не будет наблюдаться, даже если белки действительно взаимодействуют, потому что молекулы донора и акцептора расположены на противоположных концах взаимодействующих молекул.
• Живые клетки, меченные зелеными флуоресцентными мутантами белка для исследований FRET, должны быть проанализированы с использованием традиционных иммуногистохимических методов, чтобы убедиться, что меченый белок принимает ту же внутриклеточную среду обитания и свойства, что и нативный аналог.

Для того, чтобы явление флуоресцентного резонансного переноса энергии предоставляло значимые данные в качестве инструмента в оптической микроскопии, необходимо оптимизировать как подготовку образца, так и параметры визуализации. Выбор подходящих донорных и акцепторных зондов и способа их использования в качестве молекулярных меток является серьезной проблемой. Кроме того, как только стратегия маркировки, которая разрешает передачу энергии, была разъяснена, для выполнения самого измерения можно использовать широкий спектр методов.Большинство количественных исследований флуоресцентной микроскопии проводится путем измерения интенсивности флуоресцентного излучения. Детектирование FRET на основе интенсивности флуоресценции обычно достигается путем отслеживания изменений относительных величин интенсивности излучения на двух длинах волн, соответствующих донорному и акцепторному хромофорам. Когда условия подходят для возникновения резонансного переноса энергии флуоресценции, увеличение эмиссии акцептора ( I (A) ) сопровождается одновременным уменьшением интенсивности эмиссии донора ( I (D) ).

Хотя изменение относительной интенсивности излучения донора или акцептора может рассматриваться как показатель резонансного переноса энергии, обычный подход заключается в использовании отношения двух значений, I (A) / I (D) , как мера FRET. Величина отношения зависит от среднего расстояния между донорно-акцепторными парами и нечувствительна к различиям в длине пути и объеме, доступном для возбуждающего светового луча. Любое состояние образца, которое вызывает изменение относительного расстояния между парами молекул, приводит к изменению соотношения испускания донора и акцептора.Следовательно, FRET можно наблюдать в микроскоп путем преимущественного возбуждения донорного флуорофора и обнаружения повышенного излучения взаимодействующего акцепторного флуорофора, сопровождаемого уменьшением флуоресценции донора, вызванным тушением из-за передачи энергии. Измерение FRET с использованием подхода мониторинга интенсивности называется стационарным, флуоресцентным резонансным переносом энергии.

Подходящие донорные и акцепторные зонды выбираются на основе их спектральных характеристик поглощения и излучения.Для максимальной резонансной передачи энергии спектр излучения донора должен существенно перекрывать спектр поглощения акцептора. Кроме того, должно быть минимальное прямое возбуждение акцепторного флуорофора в максимуме возбуждения донора, и не должно быть значительного перекрытия эмиссии между донором и акцептором в области длин волн, в которой происходит эмиссия акцептора. На практике может быть сложно идентифицировать пары донор-акцептор, удовлетворяющие этим требованиям.Ситуация часто осложняется тем фактом, что имеющиеся в продаже наборы флуоресцентных фильтров не полностью эффективны при пропускании только желаемых длин волн, и может передаваться небольшой процент света за пределами проектной полосы пропускания. Если не используются очень хорошо охарактеризованные и контролируемые системы экспрессии, может быть трудно определить точную концентрацию донорных и акцепторных флуорофоров. Дополнительные корректировки могут также потребоваться для автофлуоресценции, фотообесцвечивания и фоновой флуоресценции.

Типичное исследование внутриклеточной белковой ассоциации в живой культуре клеток проиллюстрировано на рисунке 8 для событий, связанных с апоптозом, физическим процессом гибели клеток в результате сложного каскада последовательных взаимодействий. Генные продукты, непосредственно участвующие в цепочке событий, могут быть помечены слиянием с соответствующими членами семейства флуоресцентных белков (в данном случае BFP и GFP) для совместной экспрессии в одной и той же клетке, чтобы исследовать специфические ассоциации с помощью FRET.Белки, участвующие в апоптозе, взаимодействуют внутри митохондрий и демонстрируют постепенное уменьшение связывания по мере того, как происходит запрограммированная гибель клеток. Таким образом, изображение излучения донора (рис. 8 (a)) содержит только флуоресценцию от белков, меченных BFP, в то время как соответствующий профиль излучения акцептора (рис. 9 (b)) иллюстрирует сигналы, обусловленные белками, меченными GFP (и некоторый вклад от белков, меченных GFP). донорская эмиссия). Фильтр FRET (рис. 8 (c)), как описано ниже, выявляет флуоресценцию, полученную в результате резонансного переноса энергии между двумя белками

Среди факторов, которые потенциально могут повлиять на точность измерений резонансного переноса энергии флуоресценции в целом, некоторые из них очень специфичны. к оптическому микроскопу.Основной целью микроскопических исследований является получение изображений с высоким разрешением, и это требует особого внимания к качеству и характеристикам оптических фильтров, используемых для спектрального различения длин волн поглощения и излучения донора и акцептора. Чтобы максимизировать отношение сигнал / шум (без вредного воздействия на образец или исследуемый процесс), необходимо тщательно сбалансировать интенсивность и время воздействия возбуждающего света с концентрацией донорных и акцепторных флуорофоров и детектора. эффективность.Если концентрация донорно-акцепторных флуорофоров чрезмерна, может произойти самотушение, влияющее на точность измерений FRET. Фотообесцвечивание является проблемой всех флуорофоров и может влиять на соотношение донор-акцептор, изменяя измерения флуоресценции. Избыточная интенсивность освещения также может повредить образцы, особенно содержащие живые клетки или ткани.

Метод, известный как донорский фотообесцвечивающий резонансный перенос энергии флуоресценции ( pbFRET ), который использует процесс фотообесцвечивания для измерения FRET, часто применяется при исследовании фиксированных образцов.Основанный на попиксельном анализе, этот метод был применен для измерения отношений близости между белками клеточной поверхности, меченными моноклональными антителами, конъюгированными с флуорофором. Фотообесцвечивание FRET основано на теории, согласно которой флуорофор чувствителен к фотоповреждению только тогда, когда он находится в возбужденном состоянии. Статистически только небольшая часть молекул находится в возбужденном состоянии в любой момент времени, и поэтому флуорофоры с более длительным временем жизни флуоресценции имеют более высокую вероятность фотоповреждения и демонстрируют более высокую скорость фотообесцвечивания.

Экспериментальные доказательства, подтверждающие эту концепцию, продемонстрировали, что время фотообесцвечивания флуорофора обратно пропорционально времени его жизни в возбужденном состоянии. Возникновение резонансной передачи энергии снижает время жизни флуоресценции молекулы донора, эффективно защищая ее от фотообесцвечивания. Расчеты pbFRET основаны на уменьшении скорости фотообесцвечивания донора по сравнению с измеренной для донора в отсутствие резонансной передачи энергии. Измерение фотообесцвечивания в исследованиях FRET требует относительно длительного периода времени и поэтому наиболее применимо к образцам фиксированных клеток, в которых временные данные не важны, а влияние фотообесцвечивания на функцию клеток не является проблемой.В некоторых отношениях методика фотообесцвечивания доноров менее сложна, чем измерение сенсибилизированного излучения, хотя подгонка постоянных времени к кривым фотообесцвечивания, включающим несколько компонентов, представляет некоторые дополнительные трудности.

Эффективность передачи энергии также может быть определена с помощью методов фотообесцвечивания акцептора , в которых изменение тушения излучения донора измеряется путем сравнения значения до и после селективного фотообесцвечивания молекулы акцептора.Анализ изменения интенсивности флуоресценции донора в одних и тех же областях образца до и после удаления акцептора имеет то преимущество, что требует подготовки только одного образца, и напрямую связывает эффективность передачи энергии с флуоресценцией как донора, так и акцептора.

Точное измерение резонансного переноса энергии флуоресценции в микроскопе требует компенсации всех потенциальных источников ошибок. Был разработан простой метод корректировки обнаружения донорной флуоресценции с помощью фильтра эмиссии акцептора и флуоресценции акцептора с фильтром эмиссии донора (из-за кроссовера или спектрального просвечивания).Метод также корректирует зависимость FRET от концентраций донорных и акцепторных флуорофоров. Стратегия измерения, которая требует минимум спектральной информации, использует комбинацию из трех наборов фильтров и может быть легко реализована. Наборы фильтров донора, FRET и акцептора предназначены для выделения и максимизации трех конкретных сигналов: флуоресценции донора, флуоресценции акцептора, относящейся к FRET, и флуоресценции непосредственно возбужденного акцептора, соответственно. На практике три разных образца, содержащие только донор, только акцептор, и донор, и акцептор, исследуются с каждым из трех наборов фильтров, и полученные данные обрабатываются арифметически для корректировки кроссовера и неконтролируемых изменений концентраций донор-акцептор.

На Рисунке 9 представлены схематические иллюстрации кроссовера (спектральное просачивание) и перекрестных помех фильтра, двух существенных проблем, которые необходимо преодолеть, чтобы получить количественные результаты в экспериментах по флуоресцентному резонансному переносу энергии. Кроссовер или просачивание проявляется в перекрытии спектра излучения донорной флуоресценции с полосой пропускания интерференционного фильтра излучения акцептора на рисунке 9, в результате чего сигнал излучения донора (нежелательные длины волн) проходит через фильтр излучения.Напротив, перекрестные помехи фильтра описывают минимальный уровень затухания (блокировки) в определенном диапазоне двух фильтров, установленных вместе последовательно, и вызывают беспокойство при согласовании фильтров возбуждения и излучения для наборов флуоресценции. Дихроматические зеркала часто включают в оценку перекрестных помех комбинаций флуоресцентных фильтров. Хотя два эмиссионных фильтра редко устанавливаются на световом пути одновременно, спектры объединены на рисунке 9, чтобы одновременно проиллюстрировать обе концепции.Обратите внимание, что два спектра фильтра (синяя и красная кривые) представляют коэффициент пропускания света интерференционными фильтрами, тогда как кривая излучения донора (зеленый) представляет собой график зависимости интенсивности от длины волны.

Дополнительные факторы, которые потенциально могут привести к значительным ошибкам, также требуют исправления при использовании методов измерения FRET в установившемся режиме. Кроме того, желателен тщательный контроль концентрации донорного и акцепторного флуорофора. Определения концентрации флуорофора можно частично избежать за счет применения измерений флуоресценции с временным разрешением, которые обеспечивают метод получения среднего времени жизни без точного знания концентраций доноров.Метод позволяет количественно определять расстояние разделения донор-акцептор и основан на измерениях времени жизни донора в присутствии и в отсутствие акцептора. Измерение затухания интенсивности флуоресценции как функции времени проясняет динамику излучения молекулы в возбужденном состоянии, и, следовательно, может быть получена более подробная информация о природе донорно-акцепторного взаимодействия. Графические графики спада интенсивности иллюстрируют усредненные по времени детали процесса затухания флуоресценции (см. Рисунок 10 (а)), которые не разрешаются при использовании методов устойчивого состояния.Измерения, показывающие одно и то же значение для среднего времени жизни, когда регистрируется как интенсивность в установившемся режиме, нормированная на поглощение, могут соответствовать существенно разным формам кривых затухания на графиках данных с временным разрешением, указывая на различия в участвующих межмолекулярных процессах.

Время жизни флуоресценции ( τ ) флуорофора — это характерное время, в течение которого молекула находится в возбужденном состоянии перед возвращением в основное состояние. Представляя затухание флуоресценции в упрощенной единственной экспоненциальной форме после короткого импульса возбуждающего света, интенсивность флуоресценции как функция времени ( t ) определяется уравнением:

I (t) = I0 exp (-t / τ )

, где I (0) — начальная интенсивность излучения флуоресценции сразу после импульса возбуждающего света, а I (t) — интенсивность флуоресценции, измеренная в момент времени t .Время жизни флуоресценции ( τ ) определяется как время, необходимое для уменьшения интенсивности до 1 / e от ее начального значения (приблизительно 37 процентов от I (0) ; Рисунок 10 (a)), и составляет величина, обратная константе скорости затухания флуоресценции из возбужденного состояния в основное.

Основным общим преимуществом измерений FRET с временным разрешением по сравнению с установившимся режимом является то, что расстояние разделения донор-акцептор может быть нанесено на карту с большей количественной точностью.Частично это происходит из-за того, что время жизни флуоресценции не зависит от локальной интенсивности или концентрации и в значительной степени не зависит от фотообесцвечивания флуорофоров. Однако времена жизни флуоресценции очень чувствительны к среде флуорофора, и даже молекулы со сходными спектрами могут проявлять разные времена жизни в разных условиях окружающей среды. Поскольку рассеяние не влияет на время жизни флуорофора, измерения изменения времени жизни могут предоставить информацию, которая конкретно связана с локальными молекулярными процессами.

Срок службы флуорофора может быть изменен множеством переменных в локальном микроокружении, включая такие факторы, как гидрофобность, концентрация кислорода, ионная сила других компонентов среды, связывание с макромолекулами и близость к молекулам акцептора, которые могут истощать возбужденное состояние. состояние за счет резонансной передачи энергии. Значительным практическим преимуществом является то, что измерения времени жизни могут служить абсолютными индикаторами молекулярных взаимодействий и не зависят от концентрации флуорофора.

Два общих метода, обычно используемых для измерения времени жизни флуоресцентных ламп, классифицируются как во временной области ( импульсный , см. Рисунок 10 (a)) и в частотной области (также называемый с фазовым разрешением ; рисунок 10 (б)) методы. При измерении срока службы во временной области используются источники света с импульсным возбуждением, а время жизни флуоресценции определяется путем прямого измерения сигнала излучения или регистрации с помощью счета фотонов. Подход с частотной областью использует синусоидальную модуляцию источника возбуждающего света (полученную из импульсных или модулированных лазерных систем), а время жизни определяется по фазовому сдвигу и глубине демодуляции сигнала флуоресцентного излучения.Каждый из этих подходов к визуализации времени жизни флуоресценции имеет определенные преимущества и недостатки, и оба широко применяются в традиционной широкопольной, конфокальной и многофотонной микроскопии.

На рисунке 10 показаны схематические диаграммы, представляющие методы временной и частотной области для определения времени жизни флуоресценции. В подходе во временной области (рис. 10 (а)) образец возбуждается коротким импульсом лазерного света, длительность которого намного короче, чем время жизни возбужденных частиц, и измеряется экспоненциальный профиль затухания как функция времени.Затухание флуоресценции обычно является моноэкспоненциальной функцией для одного флуорофора, но может иметь гораздо более сложный характер, если возбужденное состояние имеет многочисленные пути релаксации, доступные в окружающей среде. Синусоидально модулированный свет от лазера непрерывного действия, соединенного с акустооптическим модулятором, используется для возбуждения флуорофора в экспериментах в частотной области (рис. 10 (b)). Результирующее флуоресцентное излучение модулируется синусоидально на той же частоте, что и возбуждение, но сопровождается фазовым сдвигом и уменьшением глубины модуляции.В случае однократного экспоненциального затухания время жизни флуоресценции можно рассчитать, определив либо степень фазового сдвига ( φ ), либо коэффициент модуляции ( M ), используя уравнения, представленные на рисунке 10 (b). Если два значения идентичны, затухание флуоресценции действительно состоит из одной экспоненциальной функции. Когда присутствует более одного флуоресцентного вещества (или один флуорофор находится в сложной среде), фазовый сдвиг и время жизни модуляции следует оценивать в широком диапазоне частот.

Метод измерения времени жизни флуоресценции во временной области в основном основан на подсчете одиночных фотонов и требует системы детектирования с достаточным временным разрешением для сбора почти 100 процентов фотонов, генерируемых каждым импульсом возбуждения. Хотя методы с фазовым разрешением относительно менее требовательны в исполнении, они, как правило, не так чувствительны, как метод подсчета фотонов. Когда фазовая модуляция используется для разрешения сложных времен жизни мультифлуорофоров, длительное время воздействия повреждающего возбуждающего освещения может оказаться чрезмерным для некоторых образцов, а также может не обеспечить достаточного временного разрешения для процессов с живыми клетками.Предпочтительный метод зависит как от информации, необходимой для исследования, так и от типа исследуемого образца.

Измерения времени жизни флуоресценции оказались чувствительным индикатором FRET и имеют особые преимущества при исследованиях живых клеток из-за независимости измерений времени жизни от таких факторов, как концентрация и длина светового пути, которые трудно контролировать в живых образцах. Основное преимущество выполнения FRET-исследований путем измерения времени жизни флуоресценции заключается в том, что можно различать перенос энергии даже между донорно-акцепторными парами с аналогичными спектрами излучения.Когда время жизни флуоресценции измеряется напрямую (в отличие от использования значений в установившемся состоянии), определение FRET возможно без фотодеструкции донорных или акцепторных флуорофоров. Поскольку FRET уменьшает время жизни флуоресценции донорной молекулы за счет передачи энергии акцептору, прямое сравнение времени жизни донора в присутствии акцептора ( τ (DA) ) с временем жизни в отсутствие акцептора ( τ ( D) ), позволяет вычислять значение эффективности FRET ( E (T) ) для каждого пикселя изображения.

В зависимости от метода измерения времени жизни флуоресценции требуют, чтобы образец подвергался воздействию либо высокочастотных повторяющихся импульсов возбуждающего света, либо непрерывного синусоидально модулированного света. В исследованиях с живыми клетками всегда необходимо оценивать эффект интенсивного освещения. Независимо от метода, эталонное время жизни донора без акцептора должно быть определено в экспериментальных условиях, идентичных условиям измерения донор-акцептор.Одним из способов достижения этого с одним образцом является измерение времени жизни только донора после фотообесцвечивания акцептора после эксперимента по передаче энергии.

Выводы

В биологических исследованиях наиболее распространенными применениями резонансного переноса энергии флуоресценции являются измерение расстояний между двумя участками макромолекулы (обычно белка или нуклеиновой кислоты) или исследование взаимодействия in vivo между биомолекулярными объектами.Белки могут быть помечены синтетическими флуорохромами или иммунофлуоресцентными флуорофорами, которые служат донором и акцептором, но достижения в генетике флуоресцентных белков теперь позволяют исследователям маркировать определенные целевые белки множеством биологических флуорофоров, имеющих разные спектральные характеристики. Во многих случаях аминокислота триптофан используется в качестве внутреннего донорного флуорофора, который может быть связан с любым количеством внешних зондов, выступающих в качестве акцептора.

Если макромолекулы помечены одним донором и акцептором, а расстояние между двумя флуорохромами не изменяется в течение времени жизни возбужденного состояния донора, то расстояние между зондами можно определить по эффективности передачи энергии в установившемся состоянии. измерения, как описано выше.В случаях, когда расстояние между донором и акцептором колеблется вокруг кривой распределения, например, белковые сборки, мембраны, одноцепочечные нуклеиновые кислоты или развернутые белки (см. Сценарии, представленные на рисунке 11), FRET все еще можно использовать для изучения явлений, но предпочтительны измерения срока службы с временным разрешением. Некоторые биологические применения, которые попадают в оба случая, показаны на рисунке 11, включая конформационные изменения, диссоциацию или гидролиз, слияние мембраноподобных липидных везикул и взаимодействия лиганд-рецептор.

Хотя для измерения резонансного переноса энергии флуоресценции в оптическом микроскопе доступны различные методы, ни один из них не лишен недостатков. Некоторые методы требуют более сложных и дорогостоящих инструментов, в то время как другие основаны на предположениях, которые необходимо тщательно проверять. Некоторые подходы подходят для фиксированных образцов, но не могут применяться к системам живых клеток, в то время как другие методы должны включать значительные корректирующие вычисления или алгоритмы анализа данных.Однако несомненно, что анализ FRET показывает большие перспективы для дальнейшего развития полезности и объема биологических приложений. В последние годы произошли драматические улучшения в инструментарии, особенно в отношении методов с временным разрешением.

Измерения времени жизни флуоресценции, которые раньше выполнялись крайне сложно, теперь поддерживаются зрелыми пикосекундными и наносекундными технологиями. Успехи в разработке флуоресцентных зондов позволили получить более мелкие и более стабильные молекулы с новыми механизмами прикрепления к биологическим мишеням.Были также разработаны флуорофоры с широким диапазоном времени жизни в собственном возбужденном состоянии, и значительные усилия прилагаются к развитию большего разнообразия генетических вариаций флуоресцентных белков. Совершенно новые классы флуоресцентных материалов, многие из которых меньше, чем предыдущие флуорофоры, и позволяют оценивать молекулярные взаимодействия на меньших расстояниях разделения, обещают улучшить универсальность мечения и привести к новым применениям метода FRET.

Соавторы

Брайан Херман и Виктория Э.Centonze Frohlich — Департамент клеточной и структурной биологии, Центр медицинских наук Техасского университета, 7703 Floyd Curl Drive, Сан-Антонио, Техас 78229.

Джозеф Р. Лакович — Центр флуоресцентной спектроскопии, Департамент биохимии и молекулярной биологии, Университет Мэриленда и Институт биотехнологии Университета Мэриленда (UMBI), 725 West Lombard Street, Baltimore, Maryland 21201.

Thomas J. Fellers и Michael W.Davidson — Национальная лаборатория сильного магнитного поля, 1800 г. Ист. Пол Дирак, доктор, Университет штата Флорида, Таллахасси, Флорида, 32310.

Продвинутые приложения для микроскопии — обзор FRET-Oxford Instruments

FRET (иногда называемый Förster Resonance Energy Transfer ) позволяет определить близость двух флуорофоров. FRET — это один из ряда методов одиночных молекул, таких как TIRF, SIM и локализация сверхвысокого разрешения, которые приобрели популярность в последние годы.Резонансная передача энергии происходит только на очень короткие расстояния, обычно в пределах 10 нм, и включает прямую передачу энергии возбужденного состояния от донорного флуорофора к акцепторному флуорофору в качестве альтернативы флуоресцентному затуханию от донора. При передаче энергии молекула акцептора переходит в возбужденное состояние, из которого она распадается эмиссионно (всегда с большей длиной волны, чем у акцепторного излучения). Возбуждая донора, а затем отслеживая относительные выбросы донора и акцептора, последовательно или одновременно, можно определить, когда произошел FRET и с какой эффективностью.

Флуорофоры могут использоваться для специфической маркировки представляющих интерес биомолекул, а условие расстояния для FRET составляет порядка диаметра большинства биомолекул (1-10 нм). Это означает, что FRET можно использовать для определения того, когда и где две или более из этих меченых биомолекул (обычно белки) взаимодействуют в своем физиологическом окружении. Сигнал FRET, соответствующий определенному месту на изображении микроскопа, обеспечивает дополнительную точность определения расстояния, превышающую оптическое разрешение (~ 0.25 мм) светового микроскопа. Помимо пространственной близости, для эффективного FRET, пара красителей должна также демонстрировать значительное перекрытие спектра возбуждения донора со спектром поглощения акцептора. Именно эта характеристика составляет один из экспериментальных парадоксов FRET:

• Спектральные профили пары FRET не могут быть разделены настолько, что они плохо перекрываются,
• , тем не менее, желательно избежать «перекрестных помех» между двумя каналами формирования изображения, т.е.е. В идеале комплект эмиссионных фильтров донора должен собирать только свет от донора, а не от акцептора, и наоборот.

На практике это может быть достигнуто с помощью коротких полосовых фильтров, которые собирают свет только с более коротковолновой стороны донорного излучения и более длинноволновой стороны акцепторного излучения. Это может несколько ограничить поток фотонов как от донора, так и от акцептора во время типичного экспонирования, особенно если учесть, что эти измерения лучше всего проводить в условиях пониженной мощности возбуждения, так что мы не увеличиваем скорость обесцвечивания.Это означает, что для экспериментов FRET требуются сверхчувствительные детекторы.
Примеры пар красителей FRET включают:

• BFP-GFP
• CFP-DSRED
• BFP-GFP
• Cy3-Cy5
• CFP-YFP
• Алекса488-Алекса555
• Алекса488-Cy3
• Алекса594-Алекса647
• FITC-TRITC
• Тербий (III) -Флуоресцеин
• DiSBAC4 (3) -CC2-DMPE (пара FRET, чувствительная к напряжению)

Профиль пары красителей CFP-YFP FRET показан ниже:

Спектральные профили поглощения и излучения пары CFP-YFP FRET.

Andor iXon EMCCD, будь то в качестве ключевого компонента платформы конфокальной визуализации живых клеток Dragonfly или в составе другой конфокальной системы, представляют собой хорошо зарекомендовавшие себя детекторные решения для получения изображений FRET. EMCCD позволяет с высоким разрешением и высоким отношением сигнал-шум (S / N) определять взаимодействий FRET по всей визуализируемой области или объему клетки и помогает устранить низкие уровни фотонов, присутствующие при использовании узкополосных фильтров. В сочетании с тщательным выбором наборов фильтров это обеспечивает высокую целостность данных FRET.Поскольку EMCCD преодолевают предел обнаружения минимального уровня шума при любой скорости считывания, молекулярные взаимодействия можно отслеживать динамически с высокой точностью. Кроме того, мощность возбуждения часто может быть уменьшена, что означает минимизацию фототоксических эффектов и эффектов фотообесцвечивания, так что за молекулярными взаимодействиями можно следить в течение гораздо более длительных периодов. Для получения дополнительной информации о выборе детектора для исследования одиночных молекул, пожалуйста, просмотрите статью Какой детектор является лучшим для исследований одиночных молекул?

1.О, H-K et al. (2019) Быстрое и простое обнаружение охратоксина A с использованием флуоресцентного резонансного переноса энергии в иммуноанализе бокового потока (FRET-LFI) Toxins 11 (5), 292; https://doi.org/10.3390/toxins11050292
2. Hu J. et al (2018) Объединение антенн из наночастиц золота с резонансным переносом энергии флуоресценции одиночных молекул (smFRET) для изучения динамики шпильки ДНК Nanoscale, 10, 6611-6619 10.1039 / C7NR08397A
3. Чаурасия К.Р., Дама Р.Т. (2018) Одномолекулярный FRET-анализ ДНК-связывающих белков.В: Peterman E. (eds) Single Molecule Analysis. Methods in Molecular Biology, vol 1665. Humana Press, New York, NY
4. Юнг, С. и др. (2018), Мониторинг в реальном времени состояния связывания / диссоциации и окислительно-восстановительного состояния ионов одного переходного металла. Бык. Korean Chem. Soc., 39: 638-642. DOI: 10.1002 / bkcs.11443

EasyLife X — HORIBA

Если у вас есть стационарный флуориметр, вам нужен EasyLife ™ X с временным разрешением!

EasyLife ™ X — это компактная система определения срока службы флуоресценции на основе фильтра, которая является отличным помощником для любой лаборатории, которая в настоящее время использует флуорометр стационарного состояния, но не имеет доступа к системе срока службы флуоресценции.За небольшую часть стоимости настольного спектрофлуориметра EasyLife ™ X чрезвычайно прост в использовании и при этом обладает мощными возможностями временного разрешения и программным обеспечением для анализа распада.

Флуоресценция с временным разрешением (время жизни флуоресценции) является бесценным дополнением к устойчивой флуоресценции (спектры флуоресценции)

Если вы в настоящее время используете флуориметр с постоянным разрешением для измерений люминесценции, но не имеете доступа к системе времени жизни флуоресценции , вам следует серьезно подумать о добавлении EasyLife ™ X в свою лабораторию.Измерения интенсивности флуоресценции (установившееся состояние) и времени жизни флуоресценции (с разрешением по времени) дополняют друг друга. Часто необходимо комбинировать результаты измерений стационарной флуоресценции и времени жизни флуоресценции, чтобы получить наиболее полную информацию об интересующей молекуле (ах). Когда около тридцати лет назад были представлены первые современные инструменты времени жизни флуоресценции, некоторые исследователи по своей сути понимали дополнительную природу метода времени жизни флуоресценции, но в то время это было откровенно неактуальным, поскольку стоимость, размер и сложность этих ранних инструментов почти не поощряли. относительно немного от использования этой новой техники с временным разрешением.Несмотря на то, что стоимость оборудования, а также размер и сложность эксплуатации значительно снизились, до появления нового EasyLife ™ X все еще было трудно убедить исследователей вкладывать средства в прибор для определения срока службы флуоресценции.

За небольшую часть стоимости настольного флуориметра и поскольку им так же легко управлять, как и флуориметром, внедрение системы EasyLife ™ X изменило отношение людей к продолжительности жизни флуоресценции как к методике.Теперь каждый, кто проводит измерения люминесценции, может и должен использовать время жизни флуоресценции с пользой. Добавив к своим исследовательским возможностям флуоресценцию с временным разрешением, вы, наконец, сможете полностью охарактеризовать свою флуоресцирующую молекулу и молекулярные системы. Например, вы сможете узнать, каковы константы скорости флуоресцентного излучения и безызлучательной дезактивации ваших образцов. Эта информация легко доступна путем объединения результатов срока службы со значениями квантового выхода, измеренными с помощью прибора в установившемся режиме.

Почему время жизни флуоресценции?
Если у вас есть стационарный флуориметр, вам нужен флуориметр с временным разрешением для дифференциации нескольких структурных доменов и конформаций

Если вы хотите охарактеризовать взаимодействия молекулы с окружающей средой, одно только стационарное измерение может предоставить спектр флуоресценции , квантовый выход флуоресценции или значение анизотропии, однако большая часть этой информации перемешивается, поскольку измеренные параметры являются средними по времени, а информация о конкретных процессах теряется.Эта утраченная информация становится особенно важной, когда флуоресцентные молекулы используются в качестве зондов для изучения сложных систем, таких как белки, нуклеиновые кислоты, квантовые точки, мембраны, полимеры, поверхностно-активные вещества (мицеллы) и т. Д. Эти системы часто демонстрируют несколько структурных доменов и конформаций. Кривая затухания времени жизни флуоресценции покажет эту информацию, обнаружив несколько значений времени жизни флуоресценции, которые не могут быть получены с помощью измерения в установившемся режиме, когда вся эта информация полностью скрыта.Программное обеспечение EasyLife ™ X даже включает чрезвычайно мощное программное обеспечение для анализа распада, включая анализ распределения ESM и MEM, показанный здесь.

Изучение динамики конформации белка

Очень мощным приложением для прибора флуоресценции с временным разрешением является изучение множественных конформационных состояний белка. Рассмотрим простой случай белка, содержащего один остаток триптофана (Trp) (например, HSA сывороточного альбумина человека). С помощью прибора в установившемся режиме все, что вы можете измерить, — это типичный спектр Trp, не отражающий никакой конкретной информации о белке, за исключением того, что он содержит Trp.Однако, если вы измеряете затухание флуоресценции, вы обнаружите, что этот единственный остаток Trp имеет 4 различных дискретных времени жизни флуоресценции! Вы сразу знаете, что белок существует как минимум в 4 различных конформационных состояниях, и для каждого времени жизни вы знаете процент остатков trp в этом состоянии.

Количественная оценка эффективности связывания

Эксперимент в устойчивом состоянии может выявить связывание между флуоресцентным зондом и белком. Обычно интенсивность флуоресценции изменяется в результате связывания; он будет либо уменьшаться, либо увеличиваться в зависимости от типа датчика.Информация, которую вы получаете, носит очень общий характер. Вы обнаружили, что привязка произошла или нет, и все. Однако с системой времени жизни флуоресценции связывание будет влиять на время жизни зонда (оно будет либо уменьшаться, либо увеличиваться, например, при связывании ANS с BSA), но в то же время вы также обнаруживаете два разных времени жизни: одно для связанного, а другое для связанного несвязанный зонд, а также их относительные вклады (предэкспоненциальные факторы) в общий распад. Из измерения срока службы вы теперь знаете относительную популяцию связанных и несвязанных зондов (т. Е.е. мы знаем эффективность привязки).

^{Эффективность связывания 10%
Для этого эксперимента эффективность связывания составляет 10%, поскольку предэкспоненциальный фактор для второго, более продолжительного времени жизни (связанный компонент) измеряется как 10%. 90% ВНС не связано}

Локализация Trp в белке

Одним из основных инструментов флуоресценции является изучение тушения флуорофоров путем добавления молекул тушителя. Например, остатки триптофана в белке могут быть погашены акриламидными или иодид-ионами.Эксперимент в установившемся режиме может показать уменьшение интенсивности флуоресценции по мере добавления гасителя и, следовательно, гашение, но он не может сказать вам, было ли это гашение динамическим или статическим. Однако эксперимент по времени жизни флуоресценции обнаружит более одного времени жизни из-за разных сайтов, которые Trp может занимать в белке. Кроме того, затухание флуоресценции будет обеспечивать эффект гашения на каждом этапе жизни, поэтому вы можете получить информацию о локализации каждого типа остатков Trp (например,грамм. обнажены ли они на поверхности или погребены внутри белка).

Убедитесь, что вы действительно измеряете FRET

Метод резонансной передачи энергии Фёрстера (FRET) стал очень мощным и широко распространенным экспериментальным инструментом для изучения молекулярного связывания. Он одинаково популярен на клеточном уровне с флуоресцентными микроскопами, а также в молекулярных растворах в кюветах. Однако большинство исследователей используют методы устойчивого состояния для наблюдения и количественной оценки отношения интенсивностей флуоресценции длин волн акцептора и донора.Это привело к ряду ложных выводов и возросшему пониманию того, что метод с временным разрешением — действительно единственный способ быть уверенным в том, что вы действительно измеряете FRET.

Наличие системы флуоресценции с временным разрешением имеет важное значение, потому что реальный механизм тушения флуоресценции вообще не может быть обнаружен с помощью эксперимента в установившемся режиме. Есть два механизма, которые приводят к тушению. Первый — это столкновительное (или динамическое) тушение, при котором возбужденный флуорофор и тушитель сталкиваются и диффундируют друг с другом.Второй — статическое тушение, когда флуорофор в основном состоянии образует нефлуоресцентный комплекс с тушителем. В обоих случаях эксперимент в установившемся режиме будет показывать уменьшение интенсивности по мере добавления все большего количества тушителя. В случае столкновительного (динамического) гашения измерение срока службы покажет уменьшение срока службы по мере добавления гасителя. Однако в случае статического тушения срок службы не изменится. Различие между этими двумя механизмами критически важно, когда кто-то хочет изучить резонансный перенос энергии Ферстера (FRET).Только метод с временным разрешением может доказать, что «подобное FRET» поведение не вызвано статическим гашением. Только эксперимент на протяжении всей жизни может это исключить.

Измерение скорости вращательной диффузии и определение размера макромолекул

Анизотропия флуоресценции (поляризация) — еще один пример важности метода определения срока службы. Молекула зонда в буфере не проявляет анизотропии или проявляет очень небольшую анизотропию (т.е. она не зависит от направления). Присоедините зонд к белку, ДНК, мембране или другой большой мишени, и анизотропия флуоресценции зонда увеличится.Это все, что вам может сказать флуориметр в установившемся режиме: зонд теперь присоединен к гораздо большему объекту. Однако, если вы можете измерить разрешенную во времени анизотропию флуоресценции зонда, вы можете оценить скорость вращательной диффузии и фактический размер макромолекулы, к которой прикреплен ваш зонд. Это не может быть определено с помощью флуорометра в установившемся режиме.

Действительно доступный и простой в использовании!

EasyLife ™ X — это воплощение 40-летней мечты о создании небольшой, простой и доступной флуоресцентной системы со сроком службы, которую может использовать буквально каждый.Используя нашу запатентованную технику определения времени жизни флуоресценции и простые импульсные светодиоды и лазерные диоды, EasyLife ™ X наконец-то позволяет любому исследователю позволить себе и фактически провести эксперименты по продолжительности флуоресценции в своей собственной лаборатории.

Думаете о том, чтобы добавить время жизни флуоресценции к существующему флуорометру?

Не тратьте деньги на дорогостоящее дополнение к стареющему флуорометру. EasyLife ™ X предлагает все те же возможности в новом автономном приборе объемом 1 кубический фут, и он будет стоить вам меньше денег.Кроме того, у вас будет преимущество одновременного использования и стационарного флуориметра, и системы EasyLife ™ X с разрешением по времени, что значительно повысит производительность ваших лабораторий.

Вы сомневаетесь в том, что такая маленькая недорогая система может так много сделать?

Мы вас не виним. Понятно, что любой, кто проводил исследования времени жизни флуоресценции с использованием чего-либо, кроме EasyLife ™ X, мог бы отнестись к этому скептически. Вот почему мы собрали обширную библиотеку данных, собранных с помощью EasyLife ™ X.Просмотрите в нем образцы, похожие на ваш собственный, чтобы увидеть, как система может работать на вас. А если вы нам не верите, вы также можете искать и просматривать цитаты из литературы с помощью EasyLife ™.

Мы просто не можем переоценить, насколько легко EasyLife ™ проводить эксперименты по продолжительности флуоресценции. Есть кнопка питания для включения прибора и диск для регулировки скорости перемешивания дополнительной микромешалки для кюветы. Все остальное контролируется через программное обеспечение.Это так просто!

Импульсные светодиодные источники света

Нет ничего проще. Инженеры OBB разработали широкий спектр простых, недорогих, импульсных светоизлучающих диодов (LED) наносекундной длительности, которые будут использоваться в качестве источников возбуждения с системами EasyLife ™. Эти небольшие, но надежные источники света доступны в широком диапазоне длин волн, от ультрафиолетового до ближнего инфракрасного. У них отличные характеристики от импульса к импульсу и долговременная стабильность их интенсивности, а также их временных профилей импульсов, что подтверждается высоким качеством данных, которые производит система.Переключение с одного светодиода на другой не требует настройки и занимает всего несколько секунд. Вы не сможете работать с каким-либо более простым, необслуживаемым источником света для исследования времени жизни флуоресценции.

Преимущества импульсных светодиодов

Импульсные светодиоды EasyLife ™ имеют определенные преимущества перед более традиционными источниками света, такими как наносекундные импульсные лампы, лазеры и лазерные диоды.Вот эти преимущества:

• Недорогой
• Долговечный
• Не требуют обслуживания
• Очень стабильные источники импульсов
• Быстрые
• Длины волн от УФ до ближнего ИК диапазона (в настоящее время 280–670 нм)
• Малые размеры
• Легко заменяются —Выключить)

Впечатляющая стабильность импульса

Доступные светодиоды

Вам нужно выбрать источник или источники. В следующем списке показаны текущие варианты.Заменить источники очень просто, просто оторвите, а затем защелкните, и все готово — выравнивания не требуется.

Ниже 280 нм мы ограничены текущим состоянием технологии светодиодов. Не отчаивайтесь: будущее должно предложить еще более широкий выбор

Отсек для образцов

Отсек для образцов EasyLife ™ можно настроить с различными опциями, включая следующие.

• микромешалка
• полосовые и длинные фильтры
• фильтры нейтральной плотности
• холодный палец Дьюара

Уникальная запатентованная система обнаружения

EasyLife ™ X — это система с временным интервалом флуоресценции. Он собирает кривую затухания, позволяя пользователю подобрать кривую с помощью комплексного программного обеспечения для анализа, которое предоставляет множество статистических инструментов для оценки качества подбора.Особый метод обнаружения во временной области, используемый в EasyLife ™ X, называется стробоскопическим методом, он запатентован и является уникальным. Изначально стробоскопический метод был разработан как более простая и менее дорогая альтернатива коррелированному по времени подсчету одиночных фотонов (TCSPC). Следовательно, EasyLife ™ X является самой дешевой в мире системой флуоресценции за время жизни.

Протокол регистрации кинетики реакции на основе времени жизни

Помимо регистрации затухания флуоресценции, EasyLife ™ X может измерять кинетику реакции на основе времени жизни.Если вы знакомы с использованием флуорометра для определения кинетики, основанной на времени, вы знакомы со сбором интенсивности в установившемся состоянии как функции времени для мониторинга кинетики и реакций. EasyLife ™ X может собирать данные аналогичным образом, за исключением того, что вместо изменения интенсивности со временем EasyLife ™ X получает и отображает в реальном времени измеренный срок службы как функцию времени. Этот протокол сбора данных позволяет вам измерять изменения продолжительности жизни, а не интенсивности. Продолжительность этого измерения может составлять от нескольких секунд до многих часов.Мы уверены, что эта возможность станет важным инструментом для множества новых приложений.

* Если ваша кинетика происходит на более коротком временном интервале, рассмотрите нашу новую систему DeltaPro, которая может измерять время жизни за 1 миллисекунду.

Уникальная логарифмическая / арифметическая регистрация затухания по шкале времени

Программное обеспечение EasyLife ™ X в полной мере использует запатентованное оборудование стробоскопического обнаружения, чтобы обеспечить еще один уникальный протокол сбора данных. Сбор данных в логарифмической или арифметической шкале времени может быть чрезвычайно полезен для образцов с очень коротким и очень длинным временем жизни флуоресценции.Для короткоживущих компонентов вам необходимо собрать много точек данных, чтобы они соответствовали этим срокам службы, но для очень длинных периодов жизни вы не хотите собирать данные с одинаковым разрешением, потому что это занимает гораздо больше времени и не дает никаких преимуществ при подборе кривой затухания.

Системы, которые используют другие методы, такие как TCSPC, собирают данные в линейной шкале времени, поэтому для этой выборки они обязательно должны собрать намного больше точек данных в течение полного временного окна сбора данных, чтобы иметь достаточно точек данных для устранения компонентов с коротким сроком службы.Таким образом, с помощью стробоскопической техники, используемой с EasyLife ™ X, можно легко собрать отличные данные для сложных явлений распада.

Система EasyLife ™ X

Вся система EasyLife ™ X занимает всего один кубический фут лабораторного пространства!

Благодаря нашим запатентованным светодиодным источникам света в сочетании с нашей запатентованной стробоскопической системой обнаружения вы можете воспользоваться преимуществами высокой чувствительности, превосходного временного разрешения и уникальной способности измерять кинетику срока службы или использовать как линейные, так и нелинейные (арифметические и логарифмическая) развертка по времени.В результате получился мощный и универсальный инструмент, способный работать со сложными многоэкспоненциальными распадами с широким диапазоном времен жизни.

Мы упоминали, что EasyLife ™ X — это самая простая система, доступная для проведения экспериментов по продолжительности флуоресценции?

Программа EasyLife ™ настолько проста в использовании, что ею может пользоваться буквально каждый. Важнейшим требованием к тому, чтобы сделать систему продолжительности жизни флуоресценции простой в использовании, является программное обеспечение, и программа EasyLife ™ выполняет эту работу.Вот насколько просто использовать программу.

Всего два шага

1. Выберите регистрацию затухания флуоресценции. Нажмите кнопку Acquire, и в течение нескольких секунд или минут, в зависимости от ваших настроек, вы получите кривую затухания. При необходимости повторите сбор данных для рассеянной пробы, чтобы получить функцию отклика прибора.

2. Проанализируйте распад: В раскрывающемся списке Math выберите модель распада, которую вы хотите использовать для соответствия кривой затухания. Растяните окно анализа по кривой затухания, чтобы определить диапазон для аппроксимации.В разделе «Параметры запуска» проверьте количество компонентов, которые вы хотите разместить. Затем нажмите кнопку Start Fit. Программное обеспечение EasyLife ™ автоматически отображает результирующую подобранную кривую затухания, измеренное время жизни и ряд качественных параметров подгонки, таких как Ch2 Squared, график остатков и многое другое. Нет ничего проще.

Программное обеспечение EasyLife ™ настолько мощное, что вы будете шокированы тем, сколько вы получите за свою систему.

Не позволяйте цене EasyLife ™ вводить вас в заблуждение.Эта система поставляется с полностью полным набором инструментов для сбора и анализа флуоресценции с временным разрешением.

Протокол регистрации кинетики реакции на основе времени жизни

Помимо регистрации затухания флуоресценции, EasyLife ™ X может измерять кинетику реакции на основе времени жизни. Если вы знакомы с использованием флуорометра для определения кинетики, основанной на времени, вы знакомы со сбором интенсивности в установившемся состоянии как функции времени для мониторинга кинетики и реакций. EasyLife ™ X может собирать данные аналогичным образом, за исключением того, что вместо изменения интенсивности со временем EasyLife ™ X получает и отображает в реальном времени измеренный срок службы как функцию времени.Этот протокол сбора данных позволяет вам измерять изменения продолжительности жизни, а не интенсивности. Продолжительность этого измерения может составлять от нескольких секунд до многих часов. Мы уверены, что эта возможность станет важным инструментом для множества новых приложений.

* Если ваша кинетика происходит на более коротком временном интервале, рассмотрите нашу новую систему DeltaPro, которая может измерять время жизни за 1 миллисекунду.

Уникальная логарифмическая / арифметическая регистрация затухания по шкале времени

Программное обеспечение EasyLife ™ X в полной мере использует запатентованное оборудование стробоскопического обнаружения, чтобы обеспечить еще один уникальный протокол сбора данных.Сбор данных в логарифмической или арифметической шкале времени может быть чрезвычайно полезен для образцов с очень коротким и очень длинным временем жизни флуоресценции. Для короткоживущих компонентов вам необходимо собрать много точек данных, чтобы они соответствовали этим срокам службы, но для очень длинных периодов жизни вы не хотите собирать данные с одинаковым разрешением, потому что это занимает гораздо больше времени и не дает никаких преимуществ при подборе кривой затухания.

EasyLife ™ X поставляется с мощным пакетом анализа срока службы, включающим 8 различных программ настройки и калькулятор FRET, охватывающий практически все возможные сценарии применения.Программное обеспечение даже включает анализ распределения для комплексного анализа многокомпонентного распада. Все программы настройки используют деконволюцию как стандартную опцию. Деконволюция устраняет искажение, наложенное на кривую затухания конечной временной шириной импульса возбуждения. Это позволяет определить время жизни, которое в 10 раз меньше, чем у возбуждающего импульса. Чтобы использовать опцию деконволюции, пользователь должен получить функцию отклика прибора (IRF) в дополнение к затуханию флуоресценции.IRF можно измерить, заменив флуоресцентный образец рассеивателем.

Анализ распределения многоэкспоненциального затухания

^{Затухание флуоресценции квантовых точек CdSe, измеренное с помощью EasyLife ™ X, указывает на сильно неоднородную природу образца. Учитывая, что этот образец имел многоэкспоненциальное затухание с лежащим в основе широким диапазоном времен жизни, для этого образца использовалась уникальная арифметическая шкала прогрессии, чтобы значительно сократить время сбора и анализа.Этот результат был подтвержден инструментом анализа распределения срока службы ESM, который не только подтвердил значения срока службы из дискретного 4-экспоненциального анализа, но и предоставил ценную информацию о распределении этих дискретных значений времени жизни}

Следующие программы анализа включены в каждую систему EasyLife. ™ X

От 1 до 4 экспонент

Эта программа подходит для анализа затухания флуоресценции, состоящего из четырех экспонент и связанных с ними предэкспоненциальных множителей.Это наиболее часто используемая программа для анализа срока службы.

Мультифайловые экспоненты от 1 до 4

Метод экспоненциального срока службы нескольких файлов от 1 до 4 позволяет анализировать несколько пар рассеиватель / образец как пакетную операцию. Каждая пара будет отдельно проанализирована в одном и том же диапазоне с одинаковым количеством экспонент и одинаковыми параметрами. Этот тип анализа полезен, когда была собрана серия кривых затухания в зависимости от некоторого параметра (например, концентрации добавленного реагента).Тогда можно довольно легко распознать тенденции в значениях параметров срока службы.

Глобальные экспоненты от 1 до 4

Эта программа анализирует распады с временем жизни до 4 для нескольких файлов данных одновременно. Глобальный анализ предполагает, что времена жизни файлов данных одинаковы, но связанные с ними предэкспоненциальные функции могут изменяться. Например, global может быть полезен для анализа различных смесей до 4 флуорофоров.

Затухание анизотропии

Эта программа используется для вычисления времен корреляции вращения плюс члена остаточной анизотропии.Требуются дополнительные поляризаторы. Программа сначала позволяет пользователю рассчитать время жизни флуоресценции на основе интенсивностей параллельного и перпендикулярно поляризованного излучения. Затем пользователь может рассчитать время (а) корреляции вращения.

Кинетика мицелл

В этой программе используется функция аппроксимации «растянутой экспоненты» (уравнение Инфельта-Гретцеля), которая описывает тушение в мицеллах, когда добавленные молекулы тушителя распределяются между мицеллами Пуассона. Анализ позволяет определить число мицеллярной агрегации и константу скорости тушения.

Распределение срока службы MEM

Метод максимальной энтропии (MEM) разработан для восстановления распределений срока службы без каких-либо априорных предположений об их формах. Этот метод использует серию экспонент (до 200 членов) в качестве пробной функции с фиксированными, логарифмически разнесенными временами жизни и переменными предэкспоненциальными значениями. Это позволяет анализировать затухание флуоресценции, время жизни которого составляет несколько порядков. Во многих ситуациях MEM может различать непрерывные распределения и дискретные многоэкспоненциальные распады.Алгоритм минимизирует хи-квадрат при максимизации функции энтропии на каждой итерации. Идеально подходит для сложных распадов, таких как меченые белки и мембраны, зонды, адсорбированные на поверхности, зонды с конформационной гибкостью, полимеры и т. Д.

Распределение времени жизни ESM

Подобно MEM, но без максимизации энтропии, разработан метод экспоненциальной серии (ESM) для восстановления распределений времени жизни без каких-либо априорных предположений об их форме. Этот метод использует серию экспонент (до 200 членов) в качестве пробной функции с фиксированными, логарифмически разнесенными временами жизни и переменными предэкспоненциальными значениями.Это позволяет анализировать затухание флуоресценции, время жизни которого составляет несколько порядков. Во многих ситуациях ESM способен различать непрерывные распределения и дискретные многоэкспоненциальные распады. Идеально подходит для сложных распадов, таких как меченые белки и мембраны, зонды, адсорбированные на поверхности, зонды с конформационной гибкостью, полимеры и т. Д.

Неэкспоненциальный

Эта программа позволяет анализировать данные с помощью функции подбора, состоящей из двух экспонент, умноженных вместе и каждый с переменным показателем времени.Показатели степени могут быть изменены или фиксированы, что обеспечивает мощную общую функцию для таких моделей, как передача энергии Фёрстера, зависящее от времени гашение и молекулярное взаимодействие в ограниченной геометрии (например, молекулы на поверхности, цеолиты и т. Д.).

Калькулятор FRET

Резонансный перенос энергии Форстера (FRET), иногда называемый флуоресцентным резонансным переносом энергии, является чрезвычайно мощным методом исследования молекулярных взаимодействий. Время жизни флуоресценции стало методом выбора для проведения экспериментов FRET, потому что исследователи пришли к пониманию, что эксперименты FRET, основанные на измерениях флуоресценции в установившемся состоянии, иногда могут приводить к ошибочным результатам из-за спектральных сдвигов, приводящих к чему-то отличному от фактического FRET.Метод времени жизни флуоресценции позволяет узнать, действительно ли то, на что вы смотрите, является FRET. Калькулятор EasyLife ™ FRET рассчитывает основные параметры FRET, такие как эффективность FRET, константа скорости FRET, расстояние D-A и радиус Форстера Ro (требуются спектральные данные от флуорометра).

Trace Math

Команды в меню Trace Math позволяют выполнять определенные математические функции и операции на отдельных трассах или выбранных областях трассы. Имеется 16 функций, включая антилогарифмическое, среднее, среднее распределение, объединение, объединение xy, множественные производные, интегрирование, линейное соответствие, линейное масштабирование, логарифм, нормализацию, обратное, сглаживание, усечение, подавление базовой линии и объединение трасс.Также имеется пиковое устройство. Все эти функции могут значительно облегчить обработку и представление данных.

EasyLife ™ QuickStart DVD

Программное обеспечение EasyLife ™, поставляемое с системой, можно загрузить на ваш ноутбук или компьютер с Windows XP®. Он легко загружается на компьютер и сам калибруется вместе с прибором. Вместе с DVD QuickStart вы сможете сразу приступить к сбору данных. Однако OBB Corp. не несет ответственности за совместимость программного обеспечения EasyLife ™ с компьютерами, поставляемыми заказчиком.Если вы хотите предоставить свой собственный совместимый ноутбук или компьютер, мы можем включить ноутбук (с предварительно загруженным программным обеспечением EasyLife ™) в ваше коммерческое предложение EasyLife ™, чтобы он поставлялся вместе с вашей системой. Если вы все же решите предоставить свой компьютер, ниже приведены минимальные технические требования.

Требования к компьютеру

• Microsoft Windows XP® с SP2
• Процессор Intel Pentium® III класса, 500 МГц или выше
• Порт USB (рекомендуется USB 2)
• Видео дисплей 800 x 600, 256 цветов или выше
• Минимум 256 МБ ОЗУ (рекомендуется 512 МБ или больше)
• Минимум 125 МБ свободного места на жестком диске
• Мышь, совместимая с Microsoft®

Единственный способ доказать, что система настолько хороша, насколько вы говорите, — это показать фактические данные

Когда мы разрабатывали EasyLife ™, мы знали, что некоторые люди будут скептически относиться к тому, что такой недорогой, такой маленький и такой простой в эксплуатации инструмент может работать на них.Вот почему мы собрали растущую коллекцию данных, собранных с помощью EasyLife ™. Просмотрите приведенные ниже ссылки на образцы или эксперименты, аналогичные вашим собственным, и убедитесь сами, насколько хорошо система может работать для вас.

Белки

Большинство белков флуоресцируют из-за присутствия любой или всех трех флуоресцентных аминокислот: триптофана, тирозина и фенилаланина. Внутренняя флуоресценция триптофана с временным разрешением обычно используется для изучения структуры и динамики белков.Для этих экспериментов требуются импульсные источники света, излучающие в УФ диапазоне от 270 до 295 нм. EasyLife ™ X , оснащенный импульсным светодиодным источником 280 или 295 нм, является очень прочным, но быстрым прибором, идеально подходящим для использования с флуорофорами триптофана и тирозина.

Если вы используете внешние флуорофоры, существует большой выбор импульсных светодиодов для любой длины волны в УФ-видимом диапазоне. Чувствительный к полярности гидрофобный зонд, такой как ANS, является хорошей иллюстрацией связывания внешнего зонда с белком.

^{Связывание ANS с бычьим сывороточным альбумином контролировали с помощью EasyLife ™ X , оборудованного светодиодом 370 нм. Время жизни ANS в буфере очень короткое, 325 пс, и увеличивается до 8 нс после связывания с BSA. Отношение свободного ANS к ANS, связанному с BSA (9: 1), можно легко определить с помощью двойной экспоненциальной аппроксимации затухания флуоресценции.}

^{Затухание флуоресценции бычьего сывороточного альбумина (BSA) в буфере PBS измеряли с помощью прибора EasyLife ™ X .Нативный белок демонстрирует почти одноэкспоненциальный распад со средним временем жизни 6,31 нс. После обработки детергентом SDS BSA претерпевает структурный переход, и его затухание флуоресценции демонстрирует два более коротких времени жизни: 1,47 нс (37%) и 4,43 нс (63%).}

ДНК (нуклеиновая кислота)

Если вы изучаете конформационные особенности или гибридизацию ДНК, EasyLife ™ X — это то, что вам нужно. Молекула зонда в буфере будет демонстрировать очень небольшую анизотропию или вообще не проявлять ее.Однако прикрепите его к белку, ДНК или мембране, и анизотропия увеличится. Это все, что вам может сказать эксперимент в установившемся режиме: зонд прикреплен к гораздо большему объекту. Однако, если вы измеряете срок службы зонда, вы можете оценить скорость вращательной диффузии в дополнение к размеру макромолекулы, прикрепленной к зонду.

^{Бромид этидия (EB) — широко используемый ДНК-зонд, который легко внедряется между основаниями ДНК.EB слабо флуоресцирует в водной среде, но становится сильно флуоресцентным после интеркаляции в ДНК. Время жизни EB в буфере составляет 1,71 нс и резко увеличивается до 22,7 нс после связывания с ДНК тимуса теленка.}

^{Затухание флуоресценции PicoGreen / ДНК измерено с помощью системы измерения срока службы EasyLife ™ X . Конформационное разнообразие может привести к многократному сроку жизни зонда, связанного с ДНК. EasyLife ™ X полностью способен измерять и анализировать такие сложные распады.Распад PicoGreen, обычного зонда для двухцепочечной ДНК, демонстрирует явно многоэкспоненциальное поведение, что приводит к трем временам жизни в диапазоне от 220 пс до 9,7 нс.}

Квантовые точки

Затухание флуоресценции квантовых точек CdSe, измеренное с помощью EasyLife ™ X , указывает на сильно неоднородную природу образца. Уникальная особенность EasyLife ™ X , возможность сбора данных с использованием шкалы времени логарифмической или арифметической прогрессии, значительно облегчает анализ многоэкспоненциальных распадов с широким диапазоном времени жизни.Здесь 4-экспоненциальная функция затухания была необходима для адекватного описания экспериментального затухания, полученного с арифметической шкалой времени. Этот результат был подтвержден анализом распределения срока службы ESM, еще одним мощным аналитическим инструментом в программном обеспечении EasyLife ™ X , который подтвердил значения срока службы на основе дискретного 4-экспоненциального анализа.

Низкотемпературное исследование

^{Затухание флуоресценции образца 5 в MTHF при 295 K и 77 K, измеренное с помощью системы измерения срока службы EasyLife ™ X , снабженной насадкой дьюара для жидкого азота.Восстановленное время жизни составляет 4,4 нс (295 К) и 7,2 нс (77 К).}

Комплексы металл-лиганд (MLC)

Комплексы металл-лиганд (MLC) стали очень популярными зондами из-за их относительно длительного времени жизни. Они особенно подходят для изучения крупных макромолекулярных систем, таких как нуклеиновые кислоты и белки. На рисунке показан распад одного из наиболее распространенных типов MLC, трис (2,2′-бипиридил) рутения (II). Зонд имеет довольно низкий квантовый выход (около 4%). Для EasyLife ™ X это не проблема! Восстановленное время жизни 429 нс.

Chl A, экстрагированный из листьев шпината

^{Затухание флуоресценции Chl A, экстрагированного из листьев шпината и суспендированного в буфере. Распад является двойным экспоненциальным из-за присутствия агрегатов Chl A. Восстановленное время жизни составляет 570 пс (93%) и 4,2 нс (7%).}

Затухание флуоресценции m-TPP

^{Затухание флуоресценции мезотетрафенилпорфирина (m-TPP) в хлороформе измерено с помощью прибора EasyLife ™ X , оснащенного светодиодным источником 370 нм.С учетом одной экспоненциальной функции восстановленный срок службы составляет 9,16 нс. Значение хи-квадрат 1,07 и случайная функция невязки показывают, что одноэкспоненциальная модель адекватно описывает распад m-TPP.}

Затухание флуоресценции бенгальской розы

^{Затухание флуоресценции бенгальской розы в воде измерено с помощью системы EasyLife ™ X , оснащенной светодиодным источником света с длиной волны 525 нм. Благодаря высокой воспроизводимости импульсов и очень стабильной детектирующей электронике, EasyLife ™ X способен измерять срок службы, который более чем на порядок меньше длительности импульса светодиода.Срок службы определяется повторным преобразованием функции отклика прибора (IRF) и истинным экспоненциальным затуханием в сочетании с минимизацией методом наименьших квадратов. Восстановленное время жизни 94 пс отлично согласуется с литературными данными, в которых говорится о времени жизни розовой бенгалии в воде 92 пс.}

Membrane Fluidity

Одно из классических биологических приложений флуоресцентной спектроскопии с временным разрешением. Обычно в качестве зонда используют удлиненную гидрофобную (т.е. нерастворимую в воде) молекулу (например,грамм. DPH) и измеряется спад анизотропии. Из-за топологии мембраны вращение зонда ограничено пространством внутри конуса. Время корреляции вращения и угол конуса получены из данных по анизотропии.

Возбужденное состояние

Область очень фундаментальных исследований, где флуоресцирующая молекула сама по себе является объектом исследования, а не средством изучения чего-то еще. Время жизни флуоресценции измеряется, чтобы получить представление о природе электронного перехода, определить радиационные и безызлучательные константы скорости, проследить процессы релаксации возбужденного состояния, внутренние изменения в геометрии молекул, перенос электронов и энергии, взаимодействия с растворителем и т. Д.

Поверхностно-активные вещества (мицеллы)

Мицеллы — это молекулярные агрегаты, которые образуются при растворении мыла и детергентов в воде. Затухание флуоресценции используется в основном для определения числа агрегации мицелл, критической концентрации мицелл, полидисперсности (распределения размеров мицелл) и скорости диффузии в мицеллах.

Полимеры

Флуоресценция с временным разрешением используется для изучения динамики внутримолекулярных цепей, межконцевых расстояний, вторичной структуры, вязкости и ассоциации полимеров.Обычные методы: FRET, распад анизотропии, образование эксимера или эксиплекса и время жизни.

Циклодекстрины (Nanocavaties)

Циклодекстрины (ЦД) представляют собой циклические молекулы сахара, которые обладают внутренними полостями, способными образовывать комплексы с гидрофобными органическими и металлоорганическими молекулами в водном растворе. CD имеют форму усеченных конусов с тремя различными диаметрами полости: 6,5 A (α-CD), 7,5 A (β-CD) и 9,0 A (γ-CD). Поскольку компакт-диски растворимы в воде, но имеют гидрофобную внутреннюю часть, их можно использовать для доставки гидрофобных лекарств.Взаимодействие и включение лекарств, стероидов и других молекул с CD были тщательно изучены с помощью флуоресценции с временным разрешением. Компакт-диски также используются для изучения эффектов ограниченной геометрии на фотохимию и динамическое поведение гостевых молекул.

Внутримолекулярный перенос заряда в возбужденном состоянии (ICT)

Многие молекулы демонстрируют значительную степень перераспределения заряда при возбуждении. Некоторые могут даже пройти полное разделение зарядов, когда электрон перескакивает с одного конца молекулы на другой.Во многих случаях изменения в геометрии молекул сопровождают перенос электрона (например, TICT: скрученные внутримолекулярные состояния с переносом заряда). Такие молекулы часто используются в качестве флуоресцентных зондов, поскольку сильно полярные возбужденные состояния делают их очень чувствительными к окружающей среде. Феномен ИКТ также возникает естественным образом, например как один из основных процессов фотосинтеза. Время жизни флуоресценции — это обычный инструмент для изучения ИКТ; он дает непосредственно константу скорости переноса заряда. Кинетика затухания флуоресценции в сочетании со спектрами флуоресценции с временным разрешением может прояснить кинетический механизм, который приводит к состоянию ICT, а также механизм последующей релаксации.

Порфирины и хлорофиллы

Порфирины и хлорофиллы, соединения, имеющие большое биологическое значение, излучают флуоресценцию, которая требует чувствительности NIR. Не проблема для EasyLife ™ X , если он оснащен дополнительным детектором с усилением красного цвета. Распад порфиринов и хлорофиллов можно легко измерить в различных условиях. Это делает EasyLife ™ X ценным инструментом для исследователей, изучающих первичные процессы фотосинтеза, и для проверки фотохимических и фотофизических свойств фотосенсибилизаторов на основе порфирина для фотодинамической терапии.

Программное обеспечение HAMAMATSU: Программное обеспечение | Хамамацу Фотоникс

Описание

HCImage — это основное программное обеспечение Hamamatsu для обработки и анализа изображений, предназначенное для решения широкого спектра научных и промышленных приложений обработки изображений. Он может управлять сложными экспериментами, включая управление камерой, полный микроскоп и управление освещением. Кроме того, он позволяет пользователям проводить эксперименты в полуавтоматическом или автоматическом режиме и применять сложные алгоритмы анализа изображений к данным изображений для детального анализа.

Он разработан для таких приложений, как флуоресцентная микроскопия, визуализация соотношений, TIRF, FRET, FRAP, многомерная покадровая визуализация, анализ межбелкового взаимодействия или анализ размера частиц.

Поддерживаемое оборудование

Все DCAM-совместимые камеры
Полный список поддерживаемых аппаратных устройств см. Ниже.

Поддерживаемые аппаратные устройства

Операционная система

ПК (WindowsXP, Windows7, Windows8)

HCImage сайт

Описание

HiPic — это программное обеспечение Hamamatsu, ориентированное на физические и промышленные приложения.

Не только все монохромные камеры на базе DCAM Hamamatsu, например, Поддерживаются камеры sCMOS ORCA-Flash или ImagEM EM-CCD. Внутренние модули драйверов позволяют использовать линейные датчики или рентгеновские камеры, камеры TDI и аналоговые камеры с HiPic. В новейшую версию интегрированы усилители изображения и мини-спектрометры.
HiPic прост в использовании и предлагает помимо полного управления всеми функциями камеры различные функции анализа, такие как сложные алгоритмы коррекции, калибровка, арифметические операции, анализ ROI и многое другое.Усовершенствованная функция удаленного управления позволяет интегрировать его функции в другие программные пакеты, управлять им из других операционных систем, таких как Unix или Linux, или управлять несколькими системами из одного управляющего программного обеспечения.

Поддерживаемое оборудование

Все монохромные камеры Hamamatsu, усилители изображения, плоские сенсоры, рентгеновские камеры, микрофокусные источники рентгеновского излучения и мини-спектрометры

Операционная система

Windows 7, Windows 8, Windows 8.1, Windows 10

См. Каталог

Описание

HoKaWo — это программное обеспечение Hamamatsu для получения изображений для медико-биологических приложений, поддерживающее все камеры, совместимые с Hamamatsu DCAM.

HoKaWo делает упор на простой пользовательский интерфейс и включает в себя все основные функции, необходимые для получения и обработки изображений, включая программируемую временную запись, потоковую передачу с полной частотой кадров даже для камер sCMOS, управление до 3-х камер параллельно, повышение контрастности или псевдо -раскрашивание и масштабирование.

Недоступно в США

Поддерживаемое оборудование

Все камеры, совместимые с DCAM

Операционная система

Windows 7 (32-битная и 64-битная), Windows 8 (32-битная и 64-битная), Windows 10 (32-битная и 64-битная)

См. Каталог

Гитарный лад из нержавеющей стали Контроль качества Резка E Dual Luthier

adventuredogcamp.com, Luthier, 6 долларов США, Нержавеющая сталь, Коронация, E, Двойной, Лад, Гитара, Напильник, Музыкальные инструменты, Принадлежности для инструментов, Аксессуары для гитарных басов, / electromechanical285290.html, Сталь, Резка, 6 долларов США Гитарный лад из нержавеющей стали Crowning Luthier File Dual Cutting E Musical Инструменты Аксессуары для инструментов Аксессуары для бас-гитары Гитарный лад из нержавеющей стали Гарантия качества файла Cutting E Dual Luthier adventuredogcamp.com, Luthier, $ 6, нержавеющая сталь, Crowning, E, Dual, Fret, Guitar, File, Musical Instruments, Instruments Accessories, Guitar Bass Accessories, / электромеханический 285290.html, Steel, Cutting $ 6 Нержавеющая сталь Гитарный лад Crowning Luthier File Dual Cutting E Музыкальные инструменты Аксессуары для инструментов Guitar Bass Accessories Нержавеющая сталь Guitar Fret Crowning File Обеспечение качества Cutting E Dual Luthier

$ 6

Гитарный лад из нержавеющей стали Crowning Luthier File Dual Cutting E

• â… С разверткой из нержавеющей стали из бука и резиновой ручкой, проста в использовании.
• ˜… Рабочая поверхность длиной 10 см и резиновая ручка для удобного использования.
• ★ Имеет одинаковый размер опилки с двух сторон.
• â… Подходит для ремонта большинства гитарных ладов.
• ★ Дополнительные 4 медиатора для случайных цветов

Напильник для гитарных ладов из нержавеющей стали Luthier Dual Cutting E

У нас есть бесплатная ускоренная доставка.

OCULUS QUEST 2 ДАЕТ ВАМ СВОБОДУ СДЕЛАТЬ ВСЕ. ИГРЫ, РАЗВЛЕЧЕНИЯ, ЖИВЫЕ МЕРОПРИЯТИЯ, ФИТНЕС И МНОГОЕ ДРУГОЕ.

ВОЗМОЖНО ЧТО-ТО.

Неважно, кто вы, с растущей библиотекой игр и возможностей нет предела тому, куда вы можете пойти и что вы можете делать в виртуальной реальности.

Поднимитесь на что угодно. Сражайтесь где угодно. Испытайте королевскую битву только в виртуальной реальности.

BEAT SABER

Срежьте биты, чтобы музыка, созданная вручную.

НАСЕЛЕНИЕ ОДИН

Поднимитесь на что угодно. Сражайтесь где угодно. Испытайте королевскую битву только в виртуальной реальности.

ЗВЕЗДНЫЕ ВОЙНЫ: СКАЗКИ С ГРАНИ ГАЛАКТИКИ

Переживите свое приключение из «Звездных войн» и исследуйте дебри Батуу в этой новой оригинальной истории.

SUPERNATURAL

Тренируйтесь, медитируйте и растягивайте с настоящими тренерами в потрясающих местах со всего мира.

Swarm

Схватитесь, стреляйте и сражайтесь, пробираясь к сердцу SWARM и к вершине таблицы лидеров.

TOP GOLF

Попробуйте классические игры Topgolf в виртуальной реальности или сыграйте раунд с друзьями.

FITXR

Занимайтесь боксом и танцуйте во время вдохновляющих групповых тренировок с лучшими тренерами мира в любое время и в любом месте.

YOUTUBE VR

Оцените свои любимые каналы YouTube, видеоролики и авторов в виртуальной реальности.

PISTOL WHIP

Взрыв и шаг в сторону в этом сказочном, музыкальном, классическом ритм-шутере. Станьте настоящим героем боевиков.

Открывайте новые приключения, решайте эпические задачи или пересматривайте классические моменты в своих любимых играх и играх.

Открывайте новые приключения, решайте эпические задачи или пересматривайте классические моменты в своих любимых играх и играх.

ПОСЛЕДНИЕ НОВОСТИ

ВВЕДЕНИЕ В РАБОЧИЕ КОМНАТЫ HORIZON

— это наш флагманский опыт совместной работы, который позволяет людям собираться вместе, чтобы работать в одной виртуальной комнате, независимо от физического расстояния.

19 августа 2021 г.

НОВЫЕ РАЗВЛЕЧЕНИЯ

Ваш билет на лучшие места в доме.

12 августа 2021 г.

ПОГРУЗИТЕСЬ В НОВЫЕ ПРИКЛЮЧЕНИЯ

Ключевые моменты для вас.

14 августа 2021 г.

Теперь попасть в игру с командой стало проще.

21 июля 2021 г.

Игры в виртуальной реальности, которые помогут вам заниматься дома.

6 июля 2021 г.

ПЕРСОНАЛИЗИРУЙТЕ КАЖДЫЙ ОПЫТ

ПЕРСОНАЛИЗИРУЙТЕ КАЖДЫЙ ОПЫТ

ПЕРСОНАЛИЗИРУЙТЕ КАЖДЫЙ ОПЫТ

© Facebook Technologies, LLC.

Флуоресцентный резонансный перенос энергии FRET — Примечание 1.2 | Thermo Fisher Scientific

Флуоресцентный резонансный перенос энергии (FRET) — это зависящее от расстояния взаимодействие между электронными возбужденными состояниями двух молекул красителя, при котором возбуждение передается от молекулы-донора к молекуле-акцептору без испускания фотона .Эффективность FRET зависит от обратной шестой степени межмолекулярного разделения, что делает его полезным на расстояниях, сопоставимых с размерами биологических макромолекул. Таким образом, FRET — важный метод исследования множества биологических явлений, которые вызывают изменения в молекулярной близости. Когда FRET используется в качестве механизма контраста, совместная локализация белков и других молекул может быть отображена с пространственным разрешением, выходящим за пределы традиционной оптической микроскопии.

Основные условия для FRET

• Донорные и акцепторные молекулы должны находиться в непосредственной близости (обычно 10–100 Å).
• Спектр поглощения акцептора должен перекрывать спектр излучения флуоресценции донора ( Рисунок 1 ).
• Ориентации диполей переходных доноров и акцепторов должны быть приблизительно параллельны.

Рис. 1. Схематическое изображение интеграла перекрытия спектров FRET.

Радиус Фёрстера

Расстояние, на котором передача энергии эффективна на 50% (т.е. 50% возбужденных доноров деактивируется FRET), определяется радиусом Ферстера (R ₀ ). Величина R ₀ зависит от спектральных свойств донорных и акцепторных красителей ( Таблица 1 ):

Таблица 1. Типичные значения R

Пары донор / акцептор

Избранные приложения FRET