Лада х рей в: Lada XRAY (Лада Икс Рей) 2023 купить новую в Москве

Содержание

TCSPC, FRET, TRES, SSTD и др.

Что такое коррелированный по времени счет одиночных фотонов или TCSPC?

TCSPC означает коррелированный по времени подсчет одиночных фотонов. Это метод использования синхронизации импульсного источника возбуждения, такого как лазер или светодиод, с синхронизацией прихода одиночных фотонов на детектор, чтобы реконструировать время затухания во многих событиях (повторение обнаруженных импульсов и фотонов). Этот метод основан на том факте, что вероятность обнаружения одиночного фотона в момент времени t после возбуждающего импульса пропорциональна интенсивности флуоресценции в момент времени t.

Повторение импульсов лазера или светодиода с относительно высокой частотой повторения (от 10 кГц до 100 МГц) синхронизировано со временем прибытия следующего фотона на детектор (т. е. ФЭУ). Электроника синхронизации в виде преобразователя времени в цифру или преобразователя времени в амплитуду (TAC) используется для последовательной записи этих событий до тех пор, пока не будет собрано достаточно статистических данных для восстановления распада. Затем затухание подгоняется к экспоненциальной функции для моделирования затухания за время жизни (t). TCSPC обычно используется для измерения времени жизни флуоресценции в диапазоне от пикосекунды до микросекунды.

Можно ли измерять кинетические процессы с помощью времени жизни флуоресценции?

Используя кинетический режим TCSPC, можно выполнять отдельные измерения всего за 1 мс, а до 10 000 измерений могут быть беспрепятственно собраны. Пока происходит изменение времени жизни флуоресценции, этот подход, а не интенсивность, можно использовать для отслеживания кинетического процесса.

Очевидно, что для анализа данных необходимо достаточное количество фотонов. Это можно улучшить, используя очень высокую частоту повторения, но необходимо учитывать время жизни и временной диапазон, чтобы не повторно возбуждать образец до того, как он полностью распадется. Затем данные о продолжительности жизни можно использовать для построения кинетических трасс процесса.

Что такое резонансная передача энергии Фёрстера или FRET?

Резонансная передача энергии Фёрстера

Если вы можете измерить флуоресценцию, вы можете измерить FRET (резонансную передачу энергии Фёрстера). FRET — это интерпретация результата измерения, а не методика измерения. FRET происходит, когда испускание молекулы донора перекрывается с поглощением молекулы акцептора. Когда они находятся достаточно близко, они подвергаются диполь-дипольному взаимодействию, и энергия передается. Расстояние, на котором передается 50% энергии, называется расстоянием Ферстера, и это значение обычно известно для обычных пар FRET. Измеряя изменение интенсивности флуоресценции или время жизни молекулы донора в присутствии акцептора, можно определить эффективность FRET и, следовательно, расстояние между ними. FRET можно измерить, используя либо спектры флуоресценции (интенсивности), либо время жизни флуоресценции.

Резонансная передача энергии Ферстера

Необходимо несколько измерений; ID, интенсивность (или t _D , время жизни), измеренная на пике излучения только донора, I _DA , интенсивность (или t _DA , время жизни), измеренная на пике излучения донора в присутствии акцептора , I _A , интенсивность (или t _A , время жизни), измеренная в пике излучения донора в присутствии акцептора, но без донора, и I _B , интенсивность (или t , время жизни)0023 B , время жизни), измеренное на пике эмиссии донора с использованием холостого раствора (т.е. только буфера). Исходя из этого, эффективность E можно использовать вместе с расстоянием Ферстера (R ₀ ) для расчета R, измеряемого расстояния между молекулами донора и акцептора. См. уравнения на рисунке выше.

Принцип FRET

Загрузите техническое примечание FRET

Как флуоресценция с временным разрешением может помочь в анализе экспериментов по тушению?

Статическое и динамическое тушение

Тушение относится к уменьшению эмиссии флуоресценции, т. е. увеличению скорости безызлучательного затухания (knr). Закалку можно разделить на «статическую» и «динамическую» формы. В обоих случаях интенсивность излучения уменьшается, но только при динамическом тушении происходит изменение времени жизни флуоресценции. Примечание. Если кинетика следует кинетике Штерна-Фольмера и используется среднее время жизни, то ее следует рассчитывать с использованием средней интенсивности.

Как фотообесцвечивание повлияет на мои измерения?

Фотообесцвечивание образца, очевидное при измерении интенсивности

Эффект фотообесцвечивания увеличивает время измерения, так как эффективно снижает количество испускаемых флуорофоров (т. е. действует как уменьшение концентрации) и снижает интенсивность испускания. Срок службы не изменится.

Каковы применения TRES (спектры излучения с временным разрешением)?

TRES 2-нафтола и 2-нафтолата А

Спектральные измерения эмиссии с временным разрешением — это метод, который измеряет затухание флуоресценции на возрастающих длинах волн по всему спектру эмиссии образца. Получается трехмерный график зависимости интенсивности от времени от длины волны. Глядя на этот набор трехмерных данных в направлении спектров в разное время, а не затухания на разных длинах волн, можно измерить спектр излучения с временным разрешением. Если образец содержит несколько излучателей с перекрывающимися спектрами, но с разным временем жизни, отдельные спектры этих компонентов можно разделить с помощью TRES.

Например, 2-нафтол ионизируется с образованием 2-нафтолата в возбужденном состоянии. (Коти, 2001). Спектр излучения в стационарном состоянии показывает два пика, что указывает на присутствие обоих видов. Измерение времени жизни на инкрементальных длинах волн по всему спектру излучения показывает очень разные скорости затухания на каждом пике излучения. Подбирая затухания, можно увидеть, как изменяются времена жизни и/или амплитуды компонентов на разных длинах волн излучения.

Для 2-нафтола пик эмиссии 2-нафтола при 354 нм имеет другое время жизни, чем у 2-нафтолата, пик эмиссии которого составляет около 414 нм. Модель с двумя состояниями ионизированного и неионизированного 2-нафтола четко показана в TRES. Две постоянные времени представляют разные времена затухания для 2-нафтола (3,4 нс доминирует при 357 нм) и 2-нафтолата (90,4 нс преобладает на 414 нм). Показанные ниже данные были измерены на FluoroMax-4 с электроникой FluoroHub TCSPC и источником возбуждения NanoLED-280, работающим на частоте 1 МГц.

Другим применением TRES является измерение констант времени переориентации растворителя. (Хорнг, 1995). Глядя на один флуорофор и на то, как спектр излучения смещается во времени, можно построить график пиковой энергии в зависимости от времени и подобрать постоянную времени. Сдвиг спектра в этом случае может быть связан с переориентацией молекул растворителя своих дипольных моментов в ответ на дипольный момент возбужденного состояния флуорофора. Подбирая пиковую энергию спектра излучения с течением времени, можно получить постоянную (ы) времени переориентации молекул растворителя. (Хорнг, 1995).

Можно ли измерить молекулярный размер/связь?

Да. Есть несколько способов сделать это, в зависимости от образца. Кинетическое измерение TCSPC может быть выполнено для мониторинга связывания, если время жизни изменяется в процессе связывания. Также можно использовать анизотропию с временным разрешением, поскольку связывание повлияет на время корреляции вращения. Поскольку это связано с изменением эффективного размера молекулы, время корреляции вращения пропорционально эффективному объему молекулы.

Каково применение измерений фосфоресценции?

Применение измерений фосфоресценции

В одном примере используется задержка после вспышки лампы для измерения спектра фосфоресценции. Без задержки можно наблюдать как кратковременную флуоресценцию пептида в этом образце, так и более долгоживущую фосфоресценцию тербия.

Применение измерений фосфоресценции

Изменяя задержку, можно выборочно обнаруживать виды с более долгоживущей фосфоресценцией отдельно от фоновой флуоресценции в одном и том же образце.

Состав лантаноидов в стеклянных материалах можно изучить с помощью разрешенных во времени затухания фосфоресценции. Вот данные исследования содержания эрбия в различных стеклах этим методом. Срок службы эрбия может варьироваться в зависимости от типа стекла и процессов, используемых для его изготовления.

Что такое товарный вагон?

Затухание ФЛ хлорида европия в воде

Метод Boxcar или усреднение Boxcar представляет собой метод измерения затухания фосфоресценции или долгоживущей флуоресценции путем интегрирования в фиксированных окнах интегрирования по времени затухания сигнала.

Импульсный источник, такой как ксеноновая лампа-вспышка, мигает, и после импульса устанавливается задержка (в идеале время, когда лампа завершает мигание). Детектор многократно измеряет окно интегрирования, чтобы получить статистическое среднее значение интенсивности в этом окне после вспышки. Затем окно интегрирования постепенно перемещается по затуханию в сторону более длинных времен затухания. Таким образом, получается распад, который можно согласовать с экспоненциальным спадом, чтобы получить время жизни, обратное скорости распада. Метод коробчатого вагона может быть очень медленным, особенно при длительном распаде и слабых излучателях. Однако, в зависимости от ширины ксенонового импульса, время жизни от 10 мкс до секунд может быть решено относительно недорогим способом с использованием перестраиваемого источника света.

Что такое технология SSTD?

Пример применения SSTD: фосфоресценция при комнатной температуре (RTP) триптофана Nase T1. Метод SSTD использует импульсный источник света, либо импульсный лазер, либо ксеноновую лампу-вспышку, чтобы получить полную кривую затухания фосфоресценции от каждой вспышки импульсного источника. После каждого импульса затухание захватывается и оцифровывается в реальном времени с помощью ФЭУ и преобразователя переходных процессов. Можно легко добиться быстрого усреднения сигнала, поскольку полное затухание измеряется после каждого импульса. Спектры с временным разрешением можно легко измерить путем численного интегрирования сигнала затухания в заданном пользователем временном диапазоне и сканирования монохроматора. Это позволяет различать спектры на основе времени жизни соответствующего возбужденного состояния.

Спектры флуоресценции и фосфоресценции фенантрена, измеренные при увеличении времени задержки с шагом 2 мкс для интегрирования сигнала.

Испускание флуоресценции происходит в масштабе времени от пикосекунды до наносекунды, в то время как фосфоресценция, измеренная с помощью SSTD, происходит в масштабе времени от микросекунды до секунды. Изменяя временное положение и ширину ворот обнаружения сигнала, вы можете выборочно обнаруживать спектры флуоресценции и фосфоресценции, о чем свидетельствуют спектры фенантрена на прилагаемом рисунке. Здесь эмиссия фенантрена в замороженном стекле измерялась с постепенно увеличивающейся временной задержкой ворот обнаружения, чтобы уменьшить вклад флуоресценции.

Различие между сильной флуоресценцией и слабой фосфоресценцией при комнатной температуре от триптофана РНКазы T1.

Пример применения SSTD можно увидеть в случае фосфоресценции при комнатной температуре (RTP) триптофана Nase T1. Здесь сигнал извлекался путем подавления чрезмерной флуоресценции триптофана, что было бы чрезвычайно сложно сделать с использованием источника непрерывного возбуждения. Затухание фосфоресценции очень слабого излучения также было измерено на том же приборе с использованием функции Single Shot Transient Digitizer (SSTD) (серия HORIBA PTI QuantaMaster, 2017).

Что такое техника стробоскопа?

Схематическая диаграмма стробоскопа

Метод стробоскопического оптического товарного вагона также называется методом стробоскопа. Это импульсный метод во временной области, при котором импульсный источник света вспыхивает, а затем активируется ФЭУ путем прохождения высоковольтного импульса очень короткой продолжительности по динодной цепи ФЭУ. Впоследствии эти вспышки повторяются, и с помощью генератора затвора с задержкой интенсивность измеряется в другое время после вспышки, чтобы построить кривую затухания. Затем этот метод использует несколько вспышек и усреднение для улучшения отношения сигнала к шуму затухания.

Стробоскопический метод — это аналоговый метод, который по своей природе менее чувствителен, чем TCSPC, и не использует истинную пуассоновскую статистику, как TCSPC. Тем не менее, он имеет то преимущество, что обеспечивает затухание от примерно 150 пс до секунд с источниками с низкой частотой повторения, такими как лазерные диоды, светодиоды, перестраиваемый оптический генератор с модуляцией добротности или лазеры на азоте / красителе. Техника стробоскопа позволяет напрямую измерять спектры с временным разрешением в несколько нс, фиксируя положение затвора задержки и сканируя эмиссионный монохроматор.

Одним из преимуществ Строба является то, что он может регистрировать затухание как в линейной, так и в нелинейной (то есть арифметической прогрессии и логарифмической) шкале времени. Последнее очень помогает в разрешении многоэкспоненциальных распадов, когда время жизни может различаться на порядки. Еще одно преимущество метода Strobe заключается в том, что он может работать с перестраиваемыми лазерами с низкой частотой повторения, такими как Q-switched/OPO или азот/краситель, которые нельзя использовать с TCSPC. Он также может работать со светодиодами и лазерными диодами, работающими на частоте до 25 кГц.

Комплексный распад твердого образца ZnO.

Примером срока службы, измеренного с помощью стробоскопа, является анализ затухания и распределения времени жизни слайдов ZnO, как показано на следующем рисунке.

Что такое ап-конверсия флуоресценции?

Повышающее преобразование флуоресценции — это 2-фотонный процесс, при этом образец возбуждается двумя одновременными фотонами, прибывающими одновременно в ближнем инфракрасном диапазоне длин волн, а флуоресценция излучается с более высокой энергией (более низкой длиной волны) в видимой области спектра.

Как можно измерить ап-конверсию флуоресценции?

Аксессуар для преобразования флуоресценции с повышением частоты для Fluorolog-3 (слева) и QuantaMaster (справа).

Хотя необходимая мощность возбуждения будет зависеть от рассматриваемого образца, для преобразования с повышением частоты обычно требуется источник возбуждения с более высоким потоком фотонов, например лазер. Из-за этого стандартные источники TCSPC могут не иметь потока, необходимого для выполнения измерений с повышающим преобразованием. Лазеры с длиной волны 980 нм можно установить непосредственно в отделение для образцов, чтобы непосредственно возбуждать образцы для измерения спектров преобразования с повышением частоты, времени жизни или даже квантовых выходов. ОПГ-лазеры с модуляцией добротности и эффективным выходом в ближней ИК-области также можно использовать для измерения ап-конверсии флуоресценции.

Стационарное ап-конверсионное излучение наночастиц, легированных Er3+.

Полезны молекулы, которые поглощают свет в ближнем ИК-диапазоне и могут быть обнаружены или даже отображены в видимом диапазоне. Это связано с тем, что высокоэнергетические источники УФ-возбуждения склонны к фотообесцвечиванию или фотоповреждению биологических образцов. Источники NIR интересны при более низкой энергии и обычно не имеют этой проблемы. Молекулы, которые демонстрируют преобразование флуоресценции с повышением частоты, включают лантаноиды, полупроводниковые наночастицы и квантовые точки. Тот самый 9Лазер DPSS с длиной волны 80 нм может работать в импульсном режиме с помощью импульсов TTL и использоваться для измерения срока службы ФЛ с повышением частоты, либо с функцией MCS платы TCSPC, либо методом SSTD.

Хотя флуоресценция (и фосфоресценция) имеет широкий спектр применений, есть две основные области исследований, в которых это явление наиболее эффективно используется:

Науки о жизни

Материаловедение обнаружена флуоресценция, для получения информации может оказаться выгодным использовать прижизненные методы. Некоторые из этих приложений и методов флуоресценции, которые можно использовать при их изучении, проиллюстрированы ниже.

Life Sciences

STRUCTURE/CONFORMATION

SIZE/MOBILITY

FUNCTION

Monitor

Viscosity
Rotational diffusion
Ограниченная подвижность

Использование таких методов, как

Время жизни флуоресценции
TRES
FRET
TR Anisotropy
Phosphorescence lifetime

Monitor

Viscosity
Rotational diffusion
Binding
Restricted mobility

Using techniques such as

Fluorescence lifetime
FRET
TR Анизотропия

Монитор

Связывание белков, лигандов, лекарств и др.
Bound vs. unbound
Change in rate of rotation of species upon binding

Using techniques such as

Fluorescence lifetime
TR Anisotropy
Fluorescence quenching

Материаловедение

ПОЛУПРОВОДНИКИ

СТЕКЛА И ПОЛИМЕРЫ

NANOPARTICLAS INCLUDING QUANTUM DOTS

Monitor

Effects of electronic changes
Efficiency of charge separation
Effect of dopants

Using techniques such as

Fluorescence срок службы
TRES
FRET
TR Анизотропия

Применение

Solar panels
Photovoltaics
Lab on a chip

Monitor

Rotational diffusion
Viscosity
Lanthanide luminescence
Binding
Restricted mobility

Using techniques such as

Время жизни флуоресценции
FRET

Анизотропия TR
Время жизни фосфоресценции

Applications

Telecommunications
Optoelectronics
Biosensors
Display panels
Laser technology

Monitor

Binding of biomolecules
Biosensing
Bound vs. unbound
Change скорости вращения видов при связывании

Использование таких методов, как

Fluorescence lifetime
TR Anisotropy
Fluorescence quenching
FRET

Applications

Biosensors
Nanocrystal lasers
Clinical applications
Cell labelling
Cellular imaging general

Загрузите техническое примечание по измерениям времени жизни флуоресценции с временным разрешением

Запрос информации

У вас есть вопросы или пожелания? Используйте эту форму для связи с нашими специалистами.

Сравнение кристаллографии, ЯМР и ЭМ

Запрос

Структурная биология включает методы и принципы молекулярной биологии, биохимии и биофизики в качестве средства выяснения молекулярной структуры и динамики биологически значимых молекул. Недавний прогресс в приборостроении способствовал новому развитию структурной биологии, поскольку сложные биологические молекулы теперь можно анализировать с беспрецедентной легкостью и эффективностью. Трехмерная структура белков и белковых комплексов позволяет лучше понять законы жизнедеятельности и механизмы заболеваний, тем самым позволяя рационально разрабатывать новые диагностические и терапевтические средства. В структурной биологии существует три основных метода исследования: дифракция рентгеновских лучей на монокристаллах (SC-XRD), ядерный магнитный резонанс (ЯМР) и криоэлектронная микроскопия (Крио-ЭМ). Однако не существует «универсального» метода, поскольку все три из них предлагают уникальные преимущества, а также ограничения.

Рис.1. Три основных метода исследования структурной биологии. Согласно статистике PDB (https://www.rcsb.org/), с помощью SC-XRD разрешено более 120 000 белковых структур, что составляет почти 90% от общего числа. С помощью ЯМР получено около 12 000 белковых структур. Хотя общее количество белковых структур, разрешенных с помощью крио-ЭМ, несопоставимо с первыми двумя методами, взрывной рост структур, полученных с помощью этого метода, заметен в последние годы.

1. Монокристалл Рентгеновская дифракция

Основы теории

Рентгеновская кристаллография использует рентгеновские лучи для определения положения и расположения атомов в кристалле. Наиболее классическим методом рентгеновской кристаллографии является дифракция рентгеновских лучей на монокристалле, при которой атомы кристалла заставляют падающий рентгеновский луч создавать рассеянные лучи. Когда рассеянные лучи попадают на детектор, эти лучи создают спекл-дифракционную картину. По мере постепенного вращения кристалла можно измерить угол и интенсивность этих дифрагированных лучей, а затем создать трехмерное изображение электронной плотности внутри кристалла. На основе этой электронной плотности можно определить среднее положение атомов в кристалле, химические связи, кристаллические барьеры и различную информацию. Для монокристалла достаточной чистоты, однородности и регулярности данные рентгеноструктурного анализа позволяют определить средний угол и длину химической связи с точностью до нескольких десятых градуса и до нескольких тысячных ангстрема соответственно.

Рис.2. Физико-математические основы рентгеновской кристаллографии для решения структуры

История и актуальность

Метод дифракции рентгеновских лучей на монокристаллах был предложен и разработан в 1912 году и стал наиболее важным и полезным инструментом для определения структуры белка, так как структура белка миоглобина была впервые определена в 1958 году. В настоящее время известно более 140 000 белковых структур. были депонированы в банке белковых данных (https://www.rcsb.org/), почти 90% из которых разрешены с помощью метода рентгеновской дифракции монокристаллов, что свидетельствует о его преимуществах при изучении структуры кристаллов биологических макромолекул.

Процедуры

Процесс метода рентгеновской дифракции монокристалла можно условно разделить на четыре этапа.

Первым этапом является получение качественных монокристаллов целевого белка, который называется кристаллизацией белка. Когда раствор солюбилизированного белка достигает пересыщения, он способствует агрегации белка и зародышеобразованию. В конце концов, отдельные белковые молекулы выстраиваются в повторяющийся ряд элементарных ячеек, принимая однородную ориентацию. Квалифицированные кристаллы должны быть достаточного размера (обычно более 50 мкм по всем измерениям) и качества (правильной структуры, без трещин или двойников). Получение монокристаллов высокого качества является ограничивающим шагом для решения структуры с помощью этого метода.
После получения монокристалла необходим дифракционный эксперимент. Кристалл иммобилизуют в интенсивном рентгеновском луче, создавая дифракционную картину, которая регистрируется как данные дифракции (угол и интенсивность дифрагированных рентгеновских лучей). По мере постепенного вращения кристалла прежние отражения исчезают и появляются новые.
Интенсивность дифракции в каждом пятне регистрируют с каждого направления кристалла.
Затем дифракционные данные, полученные из дифракционной картины, объединяются с различными методами структурного анализа и подгонки данных для анализа распределения электронной плотности в трехмерном пространстве внутри элементарной ячейки.
На последнем этапе на основе карты электронной плотности можно создать и уточнить модель расположения атомов в кристалле.
Рис.3. Процесс рентгеноструктурного анализа монокристаллов
Преимущества
Этот метод может обеспечивать высокое атомное разрешение и не ограничивается молекулярной массой образца. Он подходит для водорастворимых белков, мембранных белков, а также макромолекулярных комплексов. При правильном манипулировании он становится мощным инструментом для предоставления надежных структурных данных биологических макромолекул и определения положения и структуры активного центра, а также помогает понять, как белок распознает и связывает молекулы лиганда на атомном уровне.

Недостатки
Однако метод дифракции рентгеновских лучей на монокристаллах также имеет ряд недостатков. Во-первых, образец должен быть кристаллизуемым, но кристаллизация биологических макромолекул с большой молекулярной массой может быть затруднена, в частности, мембранные белки сложнее кристаллизовать из-за их большого размера и плохой солюбилизации. Во-вторых, необходимо получить организованный монокристалл, чтобы обеспечить соответствующую дифракцию. Наконец, полученная трехмерная структура биологического образца представляет собой лишь статическую форму тестируемой молекулы (одна из многих возможностей), а не динамическую.

2. Ядерный магнитный резонанс (ЯМР)
Основы теории
Второй метод — ядерно-магнитный резонанс (ЯМР). Ядра представляют собой заряженные, быстро вращающиеся частицы, подобные внешним электронам. Гиромагнитные отношения различных атомных ядер различны и поэтому имеют разные резонансные частоты. Движение ядра не изолировано — оно взаимодействует с окружающими атомами как внутри-, так и межмолекулярно. Следовательно, с помощью спектроскопии ядерного магнитного резонанса можно получить информацию о структуре данной молекулы. Взяв в качестве примера белок, его вторичная структура, такая как α-спираль, β-лист, поворот, кольцо и завиток, отражает различное расположение атомов основной цепи белковых молекул в трехмерном пространстве. Расстояние между атомными ядрами в различных вторичных доменах, взаимодействие между ядрами и динамические характеристики полипептидных сегментов напрямую отражают трехмерную структуру белков. Все эти ядерные особенности вносят вклад в спектроскопическое поведение анализируемого образца, обеспечивая, таким образом, характерные сигналы ЯМР. Интерпретация этих сигналов компьютерными методами приводит к расшифровке трехмерной структуры.
Рис.4. Ядерный спин
История и действительность
С момента первого наблюдения сигналов ЯМР в конденсированном состоянии в 1946 году технология ЯМР претерпела быстрое развитие в течение более 70 лет, и ее применение было расширено из области физики, такой как определение магнитного момента ядра, в химию, медицину, материаловедение, науки о жизни и многие другие. Примечательно, что в 1980-х годах технология ЯМР творчески применялась в структурном анализе белка, что способствовало применению ЯМР в биологической области. Хотя количество данных о трехмерной структуре белков, полученных с помощью технологии ЯМР, несопоставимо с данными, полученными с помощью рентгеновской дифракции монокристаллов, уникальные преимущества технологии ЯМР широко известны: ЯМР может предоставить информацию на кинетической основе, таким образом, можно решить внутреннее движение белков в нескольких временных масштабах и механизм их связывания с лигандами.
Процедуры
ЯМР-эксперимент состоит из четырех основных этапов: подготовка образца, сбор данных, спектральная обработка и структурный анализ. ЯМР-анализ проводят на водных образцах белка высокой чистоты, высокой стабильности и высокой концентрации. Объем образца от 300 до 600 мкл с диапазоном концентраций 0,1-3 мМ. Использование стабильных изотопов 15N, 13C и 2H для мечения белков может эффективно увеличить интенсивность сигнала и разрешение. Избирательное мечение определенных аминокислот или химических групп белков может значительно уменьшить перекрытие сигналов. Многомерные эксперименты ЯМР используются для получения информации о белке. Затем проводят спектральную обработку для определения атомов белка, соответствующих каждому спектральному пику на разных спектрах ЯМР. Наконец, ряд пространственно структурированной информации, такой как константы связи NOE и J, используется для расчета пространственной структуры с использованием методов дистанционной геометрии или молекулярной динамики.
Рис.5. Процесс технологии ядерного магнитного резонанса
Преимущества
Важнейшей особенностью метода ЯМР является то, что трехмерная структура макромолекул в естественном состоянии может быть измерена непосредственно в растворе, а ЯМР может предоставить уникальную информацию о динамике и межмолекулярных взаимодействиях. Разрешение макромолекулярной трехмерной структуры может быть всего субнанометровым.
Недостатки
Однако спектр ЯМР биомолекул с большой молекулярной массой очень сложен и труден для интерпретации, что ограничивает применение ЯМР для анализа больших биомолекул. Кроме того, этот метод требует относительно большого количества чистых образцов (порядка нескольких мг) для достижения разумного отношения сигнал-шум.
3. Криоэлектронная микроскопия (Крио-ЭМ)
Основы теории
Третий подход — это метод криоэлектронной микроскопии (Крио-ЭМ), который включает в себя три разных метода: анализ отдельных частиц, электронную томографию и электронную кристаллографию. Основным механизмом крио-ЭМ является рассеяние электронов. Основной принцип описывается следующим образом. Образцы готовят путем криоконсервации перед анализом. Когерентные электроны используются в качестве источника света для измерения образца. После прохождения электронного луча через образец и близлежащий слой льда система линз преобразует рассеянный сигнал в увеличенное изображение, регистрируемое на детекторе. И выполняется обработка сигнала для получения трехмерной структуры образца.
История и действительность
Технология трехмерной реконструкции с помощью электронной микроскопии была впервые открыта в 1968 году. Трехмерная структура хвоста фага Т4 была реконструирована с помощью электронных микрофотографий. И тогда были предложены общая концепция и методы трехмерной реконструкции электронной микроскопии. Для уменьшения лучевого поражения в 1974 году была создана криогенная электронная микроскопия. После более чем 30-летнего развития Крио-ЭМ стала мощным инструментом для изучения структуры биологических макромолекул. В последние годы технология Cryo-EM сделала революционный прогресс, особенно в анализе одиночных частиц. С 2013 года, благодаря огромному прогрессу в области электронных детекторов и обработки изображений, крио-ЭМ анализ отдельных частиц развивался так быстро, что разрешение крио-ЭМ теперь сравнимо с рентгеновской дифракцией монокристаллов. В настоящее время Крио-ЭМ становится мощным инструментом для определения структуры биологических макромолекул с высоким разрешением.
Процедуры
Прежде чем использовать крио-ЭМ для наблюдения за образцом, можно использовать ЭМ с отрицательным окрашиванием для быстрого скрининга гомогенного образца. Метод крио-ЭМ анализа отдельных частиц начинается с витрификации образца. Во время этого процесса белковый раствор мгновенно охлаждается, благодаря чему молекулы воды не кристаллизуются, образуя аморфное твердое вещество. Затем замороженный образец подвергается скринингу, и данные собираются в системе. В этот период можно сделать серию двумерных изображений. Затем, на основе большого количества полученных двумерных изображений, выполняется выравнивание и классификация частиц. В конце данные обрабатываются программным обеспечением реконструкции для создания трехмерной структурной модели.
Рис.6. Процесс крио-ЭМ метода анализа отдельных частиц
Преимущества
По сравнению с рентгеновской дифракцией монокристалла, обработка образца быстрым замораживанием сохраняет его состояние, близкое к исходному. Кроме того, для этого метода требуется лишь небольшое количество образца (около 0,1 мг), он более прост в отношении чистоты образца и не требует кристаллизации белка.
Недостатки
Основной недостаток этого метода заключается в том, что частицы обнаруживаются в неизвестной ориентации. Высокий уровень шума из-за использования ограниченных доз электронов для минимизации радиационного повреждения, особенно при высоком разрешении, имеет тенденцию усложнять определение этих ориентаций, и это особенно касается более мелких частиц. Следовательно, определение структуры биологических макромолекул с помощью крио-ЭМ в последние несколько лет ограничивалось большими комплексами или моделями с низким разрешением.
Рис.7. Криоэлектронная микроскопия
4. Резюме
Основы теории
Таким образом, каждая технология имеет свои преимущества в определенных приложениях, так что один метод может широко использоваться в одних случаях и редко в других. Таким образом, понимание природы анализа является ключом к выбору метода. Мало того, что неправильный выбор метода приведет к сомнительным результатам, он также может привести к значительным задержкам проекта и привести к финансовым потерям. Для получения дополнительной информации см. Таблицу 1.
Advantages Disadvantages Objects Resolution
X-ray Crystallography • Хорошо проработанный
• Высокое разрешение
• Широкий диапазон молекулярной массы
• Простота построения модели • Трудно кристаллизуется
• Трудно дифракционно
• Предпочтительна твердая структура
• Структура в статическом кристаллическом состоянии • Кристаллизуемые образцы
• Растворимые белки, мембранные белки, рибосомы, ДНК/РНК и белковые комплексы Высокая
ЯМР • Высокое разрешение
• Трехмерная структура в растворе
• Подходит для динамического исследования • Необходимость высокой чистоты пробы
• Сложность пробоподготовки
• Сложность вычислительного моделирования • Молекулярная масса ниже 40–50 кДа
• Водорастворимые образцы Высокая
Крио-ЭМ • Простая пробоподготовка
• Структура в естественном состоянии
• Малый объем выборки • Относительно низкое разрешение
• Применимо только к образцам с высокой молекулярной массой
• Сильно зависит от методов ЭМ
• Дорогостоящее оборудование ЭМ • >150 кДа
• Вирионы, мембранные белки, крупные белки, рибосомы, комплексные соединения Относительно низкий (
Таблица 1 Сравнение рентгеновской кристаллографии, ЯМР и крио-ЭМ
Каталожные номера
Ван, HW; Ван В.

Разное