Ca ²⁺ -зависимость взаимодействия γB2 транс . ( a ) Влияние обработки EGTA на FRET в местах клеточной адгезии. Клетки K562, индивидуально экспрессирующие индикаторы γB2ΔICD на основе FRET, культивировали совместно. Объединенные флуоресцентные и ДИК-изображения (верхние панели) и изображения соотношения Venus/mTQ2 (нижние панели) были получены до и после обработки 5 мМ EGTA. Масштабная линейка, 10 мкм. ( b ) Изменение соотношения Venus/mTQ2 (ΔR/R ₀ ) в месте клеточной адгезии при обработке ЭГТА с течением времени. EGTA (5 мМ) добавляли в среду через 30 с. R ₀ рассчитывали как среднее значение отношения Venus/mTQ2 для 30 кадров до обработки EGTA. ( c ) Спектры излучения до и после обработки ЭГТА. Были получены спектры излучения, возбужденные светом с длиной волны 405 нм в месте адгезии клеток до и после обработки 5 мМ EGTA. ( d ) Количественный анализ изменений соотношения при лечении ЭГТА. Были измерены значения отношения FRET в местах адгезии клеток до и после обработки 5 мМ EGTA ( n  = 38). Значительную разницу анализировали с помощью знакового рангового теста Уилкоксона для сопоставленных пар. p Значение указано на графике.

Изображение в полном размере

Обсуждение

Мы разработали индикаторы γB2 на основе FRET, γB2ΔICD-EC1-G4S-mTQ2ΔC6/γB2ΔICD-EC5-VenusΔN3C9-P3, которые позволили непосредственно визуализировать взаимодействие Pcdh Pcdh trans и 9023cd. ощущает изменения во внеклеточном уровне Ca ²⁺ в течение секунды. Ca ²⁺ — зависимость взаимодействия Pcdh транс является спорной. Ранее клеточный пулл-даун анализ с использованием клеток K562 показал, что взаимодействие Pcdhγ транс менее чувствительно к Ca ^{2+ 6} . Напротив, Рубинштейн и соавт. пришли к выводу, что Pcdhs опосредуют межклеточные взаимодействия Ca ²⁺ -зависимым образом на основе анализа агрегации клеток с использованием клеток K562 ²⁵ ; в соответствии с этими наблюдениями, наш результат для γB2ΔICD на основе FRET в клетках K562 ясно продемонстрировал, что Pcdh 9Взаимодействие 0229 транс зависит от Ca ²⁺ (рис. 4).

Чтобы показать специфичность индикаторов γB2ΔICD на основе FRET, мы сначала подготовили γA3ΔICD, в которой FRET-донорные и акцепторные FP были индивидуально вставлены в соответствующие сайты γB2. Однако мы не смогли подтвердить FRET в местах клеточной адгезии, образованных клетками, индивидуально экспрессирующими их (данные не показаны). Предыдущий отчет показал, что димерные структуры, образованные доменами EC1-EC5 γB2 и доменами EC1-EC4 γB7, тесно связаны ²⁷ . Напротив, среднеквадратические отклонения (RMSD) между структурой димера, образованной доменами EC1-EC4 γA1, и структурами димера, образованными доменами EC1-EC5 γB2 и доменами EC1-EC4 γB7, были относительно большими ²⁷ . Эти представления предполагают, что общие структуры транс- димеров между подсемействами γA и γB различаются. Кроме того, учитывая, что феномен FRET чувствителен к расстоянию и ориентации донорных и акцепторных FP, FRET встроенного FP γA3 не был обнаружен из-за неправильной относительной ориентации. Кристаллические структуры транс димеров, образованных более длинными эктодоменами, позволят в дальнейшем разработать индивидуальные индикаторы для других изоформ Pcdh.

Взаимодействие Pcdh -транс анализировали с использованием анализа клеточной агрегации в клетках K562, лишенных эндогенных молекул клеточной адгезии. Поскольку этот метод основан на наблюдении за агрегатами клеток, мы не можем строго отличить взаимодействие Pcdh -транс от других факторов, способствующих агрегации клеток. Предыдущий отчет ⁷ , и наши результаты (рис. 3e) показали, что клетки, индивидуально экспрессирующие различные изоформы Pcdh, коагрегировали в присутствии N-кадгерина, что указывает на то, что гомофильные взаимодействия Pcdh транс не могут быть подтверждены, поскольку клеточные агрегаты в присутствии других клеток молекулы адгезии. Напротив, индикаторы γB2ΔICD на основе FRET визуализировали гомофильные взаимодействия Pcdh транс даже в присутствии N-кадгерина (рис. 3f). Кроме того, объединенные изображения флуоресценции и ДИК на рис. 4а показали, что межклеточные контакты сохранялись даже после обработки ЭГТА. Однако изображения соотношений показали, что Pcdh 9Взаимодействие 0229 транс было уменьшено внеклеточным хелатированием Ca ²⁺ , что позволяет предположить, что основанные на FRET индикаторы gB2∆ICD могут обнаруживать взаимодействие Pcdh транс независимо от агрегации визуальных клеток.

Межклеточные взаимодействия были визуализированы с использованием метода бимолекулярной флуоресцентной комплементации (BiFC) ^{34,35,36,37,38,39} . Хотя индикаторы на основе BiFC являются мощными инструментами для визуализации межклеточных взаимодействий, они имеют ограничения. Реакция комплементации необратима, что затрудняет мониторинг диссоциации межклеточных взаимодействий. Напротив, поскольку FRET обратим, мы успешно отслеживали диссоциацию Pcdh 9.0229 транс взаимодействий между клетками с использованием индикаторов gB2ΔICD на основе FRET (рис. 4а).

Мы выполнили только разработку индикаторов γB2 на основе FRET и наблюдение взаимодействия Pcdh trans между клетками путем введения индикаторов в гетерологичные клетки, такие как клетки K562 и HEK293T. Одним из наиболее важных вопросов, требующих решения, является определение пространственно-временной роли взаимодействия Pcdh транс в биологических явлениях, таких как самоизбегание дендритов. Для изучения самоизбегания в нейронах следует проанализировать взаимодействия между дендритами, происходящими от идентичных нейронов. В таком случае индикаторы γB2 на основе FRET должны экспрессироваться в одних и тех же клетках. Основываясь на этой теории, чтобы выяснить, контролируют ли коэкспрессируемые индикаторы γB2ΔICD на основе FRET Pcdh транс взаимодействия между клетками, мы совместно культивировали клетки K562, совместно экспрессирующие индикаторы. Однако FRET почти не обнаруживался не только на участках клеточной адгезии, но и на участках, не связанных с клеточной адгезией, что означает, что ни транс-, ни цис--взаимодействия не могут быть визуализированы между клетками, совместно экспрессирующими индикаторы γB2ΔICD на основе FRET (дополнительная рис. 2). Таким образом, мы пришли к выводу, что индикаторы γB2∆ICD, основанные на коэкспрессии FRET, не работают. Одним из способов избежать этой проблемы является анализ мест межклеточных контактов между двумя разными нейронами, лишенными эндогенных Pcdhs. Ранее мы показали, что γA3-Venus и γA3-tdTomato совместно локализованы в местах контакта процесс-процесс, образованных Pcdhaβγ -дефицитные нейроны, индивидуально экспрессирующие их, в то время как они локализованы в отростках в виде дискретных точек в нейронах дикого типа ⁴⁰ . Кроме того, Kostadinov и Sanes обнаружили, что клетки SAC сетчатки, экспрессирующие единственную изоформу γC3, обнаруживают снижение межклеточных функциональных связей, что рассматривается как самоизбегание между клетками ¹² . Эти предыдущие данные свидетельствуют о том, что комбинаторно экспрессируемые эндогенные Pcdh предотвращают образование экзогенной изоформы Pcdh.0229 транс взаимодействие; следовательно, экзогенная изоформа Pcdh может гомофильно взаимодействовать через отростки двух разных нейронов, лишенных эндогенных Pcdh. Взаимодействия Pcdh trans можно визуализировать в процессе самоизбегания с использованием Pcdhαβγ -дефицитных нейронов, индивидуально экспрессирующих индикаторы γB2 на основе FRET. В этом исследовании мы использовали γB2ΔICD на основе FRET, в которых отсутствует ICD для эффективной локализации на плазматической мембране. Тем не менее, было доказано, что ИКД необходим для процессов самопознания и отсутствия самодискриминации в обонятельных сенсорных нейронах ¹⁵ . Следовательно, в нейронах необходимо использовать индикаторы γB2 на основе FRET с ИКД. В качестве следующего шага мы сначала планируем изучить, могут ли индикаторы γB2 на основе FRET визуализировать γB2 транс -взаимодействие между Pcdhαβγ -дефицитными нейронами. Мы ожидаем, что индикаторы γB2 на основе FRET станут началом для раскрытия пространственно-временной роли взаимодействий Pcdh trans в самораспознавании и не-саморазличении в нейронах в качестве будущих усилий.

Методы

Конструирование плазмиды

Все экспрессионные плазмиды субклонировали в вектор pCX. Полноразмерные мышиные Pcdh, слитые на С-конце с флуоресцентными белками, получали, как описано ранее ³⁸. Мы использовали мономерную Венеру (А206К) для следующих конструкций и описали их как Венеру. Аминокислотные положения Pcdh описаны в незрелой форме в этом разделе. Чтобы создать вставленные в Венеру γB2, γB2-EC1-Венера и γB2-EC5-Венера, мы вставили Венеру, фланкированную сайтами NheI, в положении аминокислоты 58 в домене EC1 и 501 в положении EC5 γB2, С-концево слитого с PA. тег ⁴¹ методом перекрывающейся ПЦР. Конструкции γB2ΔICD были созданы делецией ICD (739–940 аминокислот). Чтобы создать конструкции γB2ΔICD, вставленные с модифицированными линкером FP ​​для визуализации FRET, мы вставили продукты ПЦР, кодирующие модифицированные линкером FP, фланкированные сайтами NheI, в конструкции γB2ΔICD, слитые на С-конце с меткой PA. Для конструирования химерных конструкций γB2γA3ΔICD использовали домен EC1, содержащий пропептид (1–58 аминокислот), домены EC4–EC6, содержащие трансмембранный участок, и часть цитоплазматического участка (343–940 аминокислот) из γB2 и домены EC2-EC3 (127–340 аминокислот) из γA3 соединяли с помощью перекрывающейся ПЦР.

Культура клеток и плазмидная трансфекция

Клетки HEK293T (RIKEN BRC) содержали в модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM, Sigma-Aldrich) с добавлением 10% (об./об.) эмбриональной бычьей сыворотки (FBS, Biowest) при 37 °C во влажном воздухе, содержащем 5% CO ₂ . Клетки K562 (RIKEN BRC) содержали в модифицированной по Искову среде Дульбекко (IMDM, FUJIFILM) с добавлением 10 % (об./об.) FBS (Thermo Fisher Scientific) и 50 мкг/мл канамицина при 37 °C во влажном воздухе, содержащем 5 % CO. ₂ . Клетки HEK293T трансфицировали с использованием полиэтиленимина «MAX» (Cosmo Bio). Клетки K562 подвергали электропорации с использованием Amaxa 4D-Nucleofector (Lonza).

Визуализация клеток

Клетки HEK293T, выращенные на чашках со стеклянным дном, покрытых Cellmatrix Type I-C (желатин Nitta), временно трансфицировали экспрессионными плазмидами и инкубировали в течение ночи. Перед визуализацией среду заменяли средой DMEM/F12, не содержащей фенолового красного (Thermo Fisher Scientific). Флуоресцентные и ДИК-изображения были получены с использованием лазерного сканирующего конфокального микроскопа Olympus FV-1000 с микроскопом IX81, оснащенным иммерсионным объективом с числовой апертурой  × 60, числовой апертурой 1,35 (NA) (UPLSAPO60XO) (Olympus). Для экспериментов по совместному культивированию HEK29Клетки 3Т индивидуально трансфицировали экспрессионными плазмидами и инкубировали в течение ночи. Клетки открепляли от чашек с использованием трипсин-ЭДТА (0,25%) и фенолового красного (Thermo Fisher Scientific) и смешивали в 10% FBS/DMEM. Визуализация была выполнена через 24 часа.

Трансфицированные клетки K562 вращали со скоростью 30 об/мин в течение ночи при 37 °C во влажном воздухе, содержащем 5% CO ₂ . Перед визуализацией клетки декантировали в чашки со стеклянным дном, покрытые 0,1% (масс./об.) полиэтиленимином (Sigma-Aldrich), в течение 1 ч при 37 °C под влажным воздухом, содержащим 5% CO 9 .0495 2. Изображения были получены с использованием конфокального микроскопа LSM780, оснащенного объективом План-Апохромат × 10, числовая апертура 0,45 (для наблюдения за клеточными агрегатами) и иммерсионным объективом План-Апохромат × 63, числовая апертура 1,40 (для изображения соотношения и изображения спектра) (Carl Zeiss).

Для изображения соотношения mTQ2 возбуждали лазером с длиной волны 405 нм. Эмиссия донора и акцептора собиралась при 463–500 нм и 520–620 нм соответственно. Изображения IMD были созданы с использованием программного обеспечения MetaMorph (Molecular Devices).

Для визуализации спектра mTQ2 возбуждали лазером с длиной волны 405 нм. Эмиссия собиралась по спектру шириной 8,9 нм.

Акцепторное фотообесцвечивание

Фотообесцвечивание проводили, как описано ранее ^42,43 . mTQ2 и Venus возбуждались с помощью лазерного диода с длиной волны 405 нм и линии мультиаргонового лазера с длиной волны 515 нм, а их излучение собиралось с использованием полосовых фильтров, настроенных на 460–500 нм и 530–630 нм соответственно. Размер изображения был установлен на 512 × 512 пикселей. Диаметр пинхола был установлен на 300 мкм. Для каждой покадровой серии использовался оптический зум 3,0, и изображения были получены без интервалов с разрешением 200 × 50 пикселей. Сигналы Венеры в местах клеточной адгезии подвергали фотообесцвечиванию с использованием основного сканера в режиме сканирования торнадо с линией 515 нм мультиаргонового лазера, настроенной на 100% пропускание на одном кадре. Осветленная область была задана как круг диаметром 20 пикселей. Интенсивность флуоресценции в обесцвеченной области и области, свободной от клеток (фон), измеряли с использованием программного обеспечения Olympus FV10-ASW. После вычитания фона интенсивность флуоресценции mTQ2 и Венеры в обесцвеченной области нормализовали к средней интенсивности флуоресценции 10 кадров до фотообесцвечивания и наносили на график во времени. Рассчитывали среднюю интенсивность флуоресценции mTQ2 по 10 кадрам до и после фотообесцвечивания, а эффективность FRET рассчитывали по уравнению. (1).

$$FRET \; эффективность \left(\%\right)=1-\frac{F_{BB}}{F_{AB}} \times 100 \; \left(\%\right),$$

(1)

где F _BB и F _AB — интенсивности флуоресценции до и после фотообесцвечивания соответственно.

Доступность данных

Данные и материалы, подтверждающие это исследование, можно получить у авторов по запросу.

Каталожные номера

1. «>

   Кохмура, Н. и др. Разнообразие, обнаруженное новым семейством кадгеринов, экспрессируемых в нейронах синаптического комплекса. Нейрон 20 , 1137–1151. https://doi.org/10.1016/s0896-6273(00)80495-x (1998).

   КАС Статья пабмед Google ученый

2. Ву, К. и Маниатис, Т. Поразительная организация большого семейства генов нервной кадгериноподобной клеточной адгезии человека. Ячейка 97 , 779–790. https://doi.org/10.1016/s0092-8674(00)80789-8 (1999).

   КАС Статья пабмед Google ученый

3. Эсуми, С. и др. Моноаллельная, но комбинаторная экспрессия вариабельных экзонов кластера генов протокадгерина-α в одиночных нейронах. Нац. Жене. 37 , 171–176. https://doi.org/10.1038/ng1500 (2005 г.).

   КАС Статья пабмед Google ученый

4. «>

   Канеко Р. и др. Аллельная регуляция генов кластеров Pcdh-α и Pcdh-γ , включающая как моноаллельную, так и биаллельную экспрессию в одиночных клетках Пуркинье. Дж. Биол. хим. 281 , 30551–30560. https://doi.org/10.1074/jbc.M605677200 (2006 г.).

   КАС Статья пабмед Google ученый

5. Хирано, К. и др. Разнообразие одиночных нейронов, генерируемое кластером протокадгерина-β в центральной и периферической нервной системе мыши. Фронт. Мол. Неврологи. 5 , 90. https://doi.org/10.3389/fnmol.2012.00090 (2012).

   КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

6. Schreiner, D. & Weiner, J.A. Комбинаторное гомофильное взаимодействие между мультимерами гамма-протокадгерина значительно расширяет молекулярное разнообразие клеточной адгезии. Проц. Натл. акад. науч. США 107 , 14893–14898. https://doi.org/10.1073/pnas.1004526107 (2010 г.).

   ОБЪЯВЛЕНИЕ Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

7. Чт, Калифорния и др. Одноклеточная идентичность, генерируемая комбинаторными гомофильными взаимодействиями между протокадгеринами α, β и γ. Сотовый 158 , 1045–1059. https://doi.org/10.1016/j.cell.2014.07.012 (2014 г.).

   КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

8. Рубинштейн, Р., Гудман, К. М., Маниатис, Т., Шапиро, Л. и Хониг, Б. Структурное происхождение кластерного нейронного штрих-кодирования, опосредованного протокадгерином. Семин. Сотовый Дев. биол. 69 , 140–150. https://doi.org/10.1016/j.semcdb.2017.07.023 (2017 г.).

   КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

9. «>

   Mountoufaris, G., Canzio, D., Nwakeze, C.L., Chen, W.V. & Maniatis, T. Написание, чтение и перевод кода распознавания сгруппированного протокадгерина на клеточной поверхности для сборки нейронной цепи. год. Преподобный Cell Dev. биол. 34 , 471–493. https://doi.org/10.1146/annurev-cellbio-100616-060701 (2018 г.).

   КАС Статья пабмед Google ученый

10. Панчо, А., Аэртс, Т., Мицогианнис, М. Д. и Сентьенс, Э. Протокадгерины на перекрестке сигнальных путей. Фронт. Мол. Неврологи. 13 , 117. https://doi.org/10.3389/fnmol.2020.00117 (2020).

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

11. Лефевр, Дж. Л., Костадинов, Д., Чен, В. В., Маниатис, Т. и Санес, Дж. Р. Протокадгерины опосредуют дендритное самоизбегание в нервной системе млекопитающих. Природа 488 , 517–521. https://doi.org/10.1038/nature11305 (2012 г.).

    ОБЪЯВЛЕНИЕ КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

12. Костадинов, Д. и Санес, Дж. Р. Зависимое от протокадгерина самоизбегание дендритов регулирует нейронную связь и функцию цепи. Элиф 4 , e08964. https://doi.org/10.7554/eLife.08964 (2015 г.).

    Артикул ПабМед Центральный Google ученый

13. Инг-Эстевес, С. и др. Комбинаторные эффекты альфа- и гамма-протокадгеринов на выживание нейронов и самоизбегание дендритов. J. Neurosci. 38 , 2713–2729. https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.3035-17.2018 (2018 г.).

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

14. Hasegawa, S. et al. Семейство протокадгеринов-α участвует в слиянии аксонов обонятельных сенсорных нейронов в клубочках обонятельной луковицы у мышей. Мол. Клетка. Неврологи. 38 , 66–79. https://doi.org/10.1016/j.mcn.2008.01.016 (2008 г.).

    КАС Статья пабмед Google ученый

15. Mountoufaris, G. и др. Разнообразие Multicluster Pcdh требуется для сборки обонятельной нервной цепи мыши. Наука 356 , 411–414. https://doi.org/10.1126/science.aai8801 (2017 г.).

    ОБЪЯВЛЕНИЕ КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

16. Катори, С. и др. Семейство протокадгеринов-α необходимо для серотонинергических проекций, чтобы соответствующим образом иннервировать целевые области мозга. J. Neurosci. 29 , 9137–9147. https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.5478-08.2009 (2009 г.).

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

17. «>

    Катори, С. и др. Протокадгерин-αC2 необходим для диффузных проекций серотонинергических аксонов. Науч. Респ. 7 , 15908. https://doi.org/10.1038/s41598-017-16120-y (2017).

    ОБЪЯВЛЕНИЕ КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

18. Chen, WV et al. PcdhαC2 необходим для укладки аксонов и сборки серотонинергических цепей у мышей. Наука 356 , 406–411. https://doi.org/10.1126/science.aal3231 (2017 г.).

    ОБЪЯВЛЕНИЕ КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

19. Garrett, A.M., Schreiner, D., Lobas, M.A. & Weiner, J.A. γ-протокадгерины контролируют разветвление корковых дендритов, регулируя активность сигнального пути FAK/PKC/MARCKS. Нейрон 74 , 269–276. https://doi.org/10.1016/j.neuron.2012.01.028 (2012 г. ).

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

20. Suo, L., Lu, H., Ying, G., Capecchi, M. R. & Wu, Q. Кластеры протокадгерина и киназа клеточной адгезии регулируют сложность дендритов с помощью Rho GTPase. Дж. Мол. Клеточная биол. 4 , 362–376. https://doi.org/10.1093/jmcb/mjs034 (2012 г.).

    КАС Статья пабмед Google ученый

21. Molumby, M.J., Keeler, A.B. & Weiner, J.A. Межклеточные взаимодействия гомофильного протокадгерина способствуют усложнению дендритов. Сотовый представитель 15 , 1037–1050. https://doi.org/10.1016/j.celrep.2016.03.093 (2016 г.).

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

22. Molumby, M. J. et al. γ-Protocadherins взаимодействуют с нейролигином-1 и негативно регулируют морфогенез дендритных шипиков. Сотовый представитель 18 , 2702–2714. https://doi.org/10.1016/j.celrep.2017.02.060 (2017 г.).

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

23. Штеффен, Д. М. и др. γ-протокадгерины физически и функционально взаимодействуют с нейролигином-2, негативно регулируя плотность тормозных синапсов, и необходимы для нормального социального взаимодействия. Мол. Нейробиол. 58 , 2574–2589. https://doi.org/10.1007/s12035-020-02263-z (2021 г.).

    КАС Статья пабмед Google ученый

24. Рейсс, К. и др. Регулируемое ADAM10-зависимое выделение эктодомена гамма-протокадгерина C3 модулирует межклеточную адгезию. Дж. Биол. хим. 281 , 21735–21744. https://doi.org/10.1074/jbc.M602663200 (2006 г.).

    КАС Статья пабмед Google ученый

25. «>

    Рубинштейн, Р. и др. Молекулярная логика нейронального самопознания посредством взаимодействий протокадгериновых доменов. Сотовый 163 , 629–642. https://doi.org/10.1016/j.cell.2015.09.026 (2015 г.).

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

26. Гудман, К. М. и др. Структурная основа разнообразного гомофильного узнавания сгруппированными α- и β-протокадгеринами. Нейрон 90 , 709–723. https://doi.org/10.1016/j.neuron.2016.04.004 (2016 г.).

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

27. Гудман, К. М. и др. Структурное разнообразие γ-протокадгерина и его функциональные последствия. Элиф 5 , e20930. https://doi.org/10.7554/eLife.20930 (2016 г.).

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

28. «>

    Гудман, К. М. и др. Протокадгерин цис -димерная архитектура и разнообразие единиц распознавания. Проц. Натл. акад. науч. США 114 , E9829–E9837. https://doi.org/10.1073/pnas.1713449114 (2017 г.).

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

29. Ozawa, M. & Kemler, R. Изменение активности клеточной адгезии перванадатом из-за диссоциации α-катенина из комплекса E-кадгерин-катенин. Дж. Биол. хим. 273 , 6166–6170. https://doi.org/10.1074/jbc.273.11.6166 (1998 г.).

    КАС Статья пабмед Google ученый

30. Страйер, Л. и Хаугланд, Р. П. Перенос энергии: спектроскопическая линейка. Проц. Натл. акад. науч. США 58 , 719–726. https://doi.org/10.1073/pnas.58.2.719 (1967 г.).

    ОБЪЯВЛЕНИЕ КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

31. «>

    Гринвальд, Э. К., Мехта, С. и Чжан, Дж. Генетически закодированные флуоресцентные биосенсоры освещают пространственно-временную регуляцию сигнальных сетей. Хим. Рев. 118 , 11707–11794. https://doi.org/10.1021/acs.chemrev.8b00333 (2018 г.).

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

32. Ким С.А., Тай С.Ю., Мок Л.П., Моссер Э.А. и Шуман Э.М. Зависимая от кальция динамика взаимодействий кадгерина на межклеточных соединениях. Проц. Натл. акад. науч. США 108 , 9857–9862. https://doi.org/10.1073/pnas.101

    08 (2011 г.).

    ОБЪЯВЛЕНИЕ Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

33. Fernàndez-Monreal, M., Kang, S. & Phillips, G.R. Гомофильное взаимодействие гамма-протокадгерина и внутриклеточный перенос контролируются цитоплазматическим доменом в нейронах. Мол. Клетка. Неврологи. 40 , 344–353. https://doi.org/10.1016/j.mcn.2008.12.002 (2009 г.).

    КАС Статья пабмед Google ученый

34. Feinberg, E.H. et al. Реконструкция GFP через синаптических партнеров (GRASP) определяет клеточные контакты и синапсы в живых нервных системах. Нейрон 57 , 353–363. https://doi.org/10.1016/j.neuron.2007.11.030 (2008 г.).

    КАС Статья пабмед Google ученый

35. Ким, Дж. и др. mGRASP позволяет картировать синаптические соединения млекопитающих с помощью световой микроскопии. Нац. Методы 9 , 96–102. https://doi.org/10.1038/nmeth.1784 (2011 г.).

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

36. Цеценис Т., Букар А. А., Арак Д., Брунгер А. Т. и Зюдхоф Т. С. Прямая визуализация транссинаптических взаимодействий нейрексин-нейролигин во время образования синапсов. Дж. Неврологи. 34 , 15083–15096. https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.0348-14.2014 (2014 г.).

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

37. Чой, Дж. Х. и др. Межрегиональные синаптические карты среди клеток энграмм лежат в основе формирования памяти. Наука 360 , 430–435. https://doi.org/10.1126/science.aas9204 (2018 г.).

    ОБЪЯВЛЕНИЕ КАС Статья пабмед Google ученый

38. Киношита, Н. и др. Генетически кодируемый флуоресцентный индикатор GRAPHIC очерчивает межклеточные связи. Наука 15 , 28–38. https://doi.org/10.1016/j.isci.2019.04.013 (2019 г.).

    КАС Статья Google ученый

39. «>

    Киношита, Н., Хуанг, А.Дж.Ю., МакХью, Т.Дж., Мияваки, А. и Симогори, Т. Диффузионная ГРАФИКА для визуализации морфологии клеток после специфического межклеточного контакта. Науч. Респ. 10 , 14437. https://doi.org/10.1038/s41598-020-71474-0 (2020).

    ОБЪЯВЛЕНИЕ КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

40. Hasegawa, S. и др. Сгруппированные протокадгерины необходимы для построения функциональных нейронных цепей. Фронт. Мол. Неврологи. 10 , 114. https://doi.org/10.3389/fnmol.2017.00114 (2017).

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

41. Fujii, Y. и др. PA tag: универсальная система мечения белков с использованием сверхвысокоаффинного антитела против додекапептида, полученного из подопланина человека. Protein Expr. Очист. 95 , 240–247. https://doi.org/10.1016/j.pep.2014.01.009 (2014 г.).

    КАС Статья пабмед Google ученый

42. Шибата, Х. и др. Новая роль аннексина А11 в раннем секреторном пути посредством стабилизации белка Sec31A в местах выхода эндоплазматического ретикулума (ERES). Дж. Биол. хим. 290 , 4981–4993. https://doi.org/10.1074/jbc.M114.5

    (2015 г.).

    КАС Статья пабмед Google ученый

43. Канадоме, Т., Шибата, Х., Кувата, К., Такахара, Т. и Маки, М. Кальций-связывающий белок ALG-2 способствует локализации места выхода эндоплазматического ретикулума и полимеризации слитого с Trk гена ( белок ТФГ. FEBS J. 284 , 56–76. https://doi.org/10.1111/febs.13949 (2017).

    КАС Статья пабмед Google ученый

Ссылки на скачивание

Благодарности

Эта работа была поддержана Грантом MEXT для научных исследований (A) от JSPS (№ 18H04016) для TY, Грант в помощь для научных исследований в инновационных областях «Комплексный анализ и регуляция клеточного разнообразия» (№ 20H05035) для TY, «Взаимодействие часов развития и внеклеточной среды при формировании мозга» (№ JP16H06487) для TM, «Биология сингулярности» (№ 18H05410) для TN, JST Программа CREST (№ JPMJCR20E4) для Т. М. и программа JST PERST (№ JPMJPR2045) для Т.К.

Информация об авторе

Примечания автора

1. Эти авторы внесли равный вклад: Такаши Канадоме и Нацуми Хосино.

Авторы и филиалы

1. Департамент биомолекулярной науки и техники, SANKEN (Институт научных и промышленных исследований), Университет Осаки, 8-1 Mihogaoka, Ibaraki, 567-0047, Japan

   Takashi Kanadome, Takeshi Kanadome Нагаи и Томоки Мацуда

2. KOKORO-Biology Group, Лаборатории комплексной биологии, Высшая школа передовых биологических наук, Осакский университет, Суйта, 565-0871, Япония

   Нацуми Хосино и Такеши Яги

3. Японское агентство по науке и технологиям (JST), Precursive Research for Embryonic Science and Technology (PREST), Кавагути, Сайтама, 332-0012, Япония

   Такаси Канадоме Автор

   3 01002
   1. Takashi Kanadome

      Просмотр публикаций автора

      Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Scholar

   2. Нацуми Хосино

      Посмотреть публикации автора

      Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Scholar

   3. Takeharu Nagai

      Просмотр публикаций автора

      Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Scholar

   4. Tomoki Matsuda

      Просмотр публикаций автора

      Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Scholar

   5. Takeshi Yagi

      Просмотр публикаций автора

      Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Академия

   Взносы

   Т. К. и NH внесли равный вклад в эту работу. Т.К. спланировал и провел эксперименты, проанализировал данные и написал рукопись. NH провел эксперименты и проанализировал данные. Т.Н. давал советы по экспериментам и анализу данных. Т.М. и Т.Ю. разработал исследование и написал рукопись.

   Авторы переписки

   Переписка с Томоки Мацуда или Такэси Яги.

   Декларации этики

   Конкурирующие интересы

   Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

   Дополнительная информация

   Примечание издателя

   Springer Nature остается нейтральной в отношении юрисдикционных претензий в опубликованных картах и ​​институциональной принадлежности.

   Дополнительная информация

   Дополнительная информация.

   Права и разрешения

   Открытый доступ Эта статья находится под лицензией Creative Commons Attribution 4.0 International License, которая разрешает использование, совместное использование, адаптацию, распространение и воспроизведение на любом носителе или в любом формате, при условии, что вы укажете соответствующую ссылку на первоначальный автор(ы) и источник, предоставьте ссылку на лицензию Creative Commons и укажите, были ли внесены изменения. Изображения или другие сторонние материалы в этой статье включены в лицензию Creative Commons на статью, если иное не указано в кредитной строке материала. Если материал не включен в лицензию Creative Commons статьи, а ваше предполагаемое использование не разрешено законом или выходит за рамки разрешенного использования, вам необходимо получить разрешение непосредственно от правообладателя. Чтобы просмотреть копию этой лицензии, посетите http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

   Перепечатка и разрешения

   Об этой статье

   Комментарии

   Отправляя комментарий, вы соглашаетесь соблюдать наши Условия и правила сообщества. Если вы обнаружите что-то оскорбительное или не соответствующее нашим условиям или правилам, отметьте это как неприемлемое.

   Флуоресцентно-резонансная микроскопия с переносом энергии (FRET) визуализация локализации белков живых клеток | Журнал клеточной биологии

   Skip Nav Destination

   Мини-обзоры| 03 марта 2003 г.

   Раджеш Бабу Секар,

   Аммаси Периасами

   Информация об авторе и статье

   Адресная переписка с Аммаси Периасами, доктором философии, директором Центра, В.М. Центр клеточной визуализации Кека, факультет биологии, Гилмер-холл (064), Университет Вирджинии, Шарлоттсвилль, Вирджиния, 22904. Тел.: (434) 243-7602/(434) 982-4869. Факс: (434) 982-5210. Электронная почта: [email protected]

   Электронная версия этой статьи включает дополнительные материалы.

   *

   Сокращения, использованные в данной статье: CAM, кальмодулин; EGFR, рецептор EGF; FRET — резонансный перенос энергии флуоресценции; МП, мультифотон; SBT, спектральное просачивание.

   Полученный: 24 октября 2002 г.

   Полученная редакция: 21 января 2003 г.

   Принято: 21 января 2003 г.

   Издательство в Интернете: 1540-8140

   Издательство для печати: 0021-9525

   Издательство Рокфеллеровского университета

   2003

   J Cell Biol (6–39) 16203 1620

   https://doi.org/10.1083/jcb.200210140

   История статьи

   Получено:

   24 октября 2002 г.

   Пересмотр получено:

   21 января 2003 г.

   Принято:

   21 января 2003 г.

   • Стандартный вид
   • Просмотры
     • Содержание артикула
     • Рисунки и таблицы
     • Видео
     • Аудио
     • Дополнительные данные
     • Экспертная оценка
   • PDF
   • Делиться
     • Твиттер
     • LinkedIn
   • Инструменты

     • Получить разрешения

     • Иконка Цитировать Цитировать

   • Поиск по сайту

   Цитата

   Раджеш Бабу Секар, Аммаси Периасами; Флуоресцентно-резонансная микроскопия переноса энергии (FRET) визуализация локализации белка в живых клетках. J Cell Biol 3 марта 2003 г.; 160 (5): 629–633. doi: https://doi.org/10.1083/jcb.200210140

   Скачать файл цитаты:

   • Ris (Zotero)
   • Менеджер ссылок
   • EasyBib
   • Подставки для книг
   • Менделей
   • Бумаги
   • Конечная примечание
   • РефВоркс
   • Бибтекс
   панель инструментов поиска

   Расширенный поиск

   Современные достижения в области флуоресцентной микроскопии в сочетании с разработкой новых флуоресцентных зондов делают флуоресцентный резонансный перенос энергии (FRET) мощным методом изучения молекулярных взаимодействий внутри живых клеток с улучшенным пространственным (ангстремным) и временным (наносекундным) разрешением, диапазоном расстояний , чувствительность и более широкий спектр биологических приложений.

   Резонансный перенос энергии флуоресценции (FRET) ^* представляет собой физический процесс, зависящий от расстояния, при котором энергия безызлучательно передается от возбужденного молекулярного флуорофора (донора) к другому флуорофору (акцептору) посредством межмолекулярного дальнодействующего диполь-диполя. связь. FRET может быть точным измерением молекулярной близости на ангстремных расстояниях (10–100 Å) и высокоэффективным, если донор и акцептор расположены в пределах радиуса Фёрстера (расстояние, на котором половина энергии возбуждения донора передается акцептору, обычно 3–6 нм). Эффективность FRET зависит от обратной шестой степени межмолекулярного разделения (Förster, 19).65; Клегг, 1996; Lakowicz, 1999), что делает его чувствительным методом для исследования множества биологических явлений, вызывающих изменения молекулярной близости (dos Remedios et al., 1987). Технологические достижения в области световой микроскопии в сочетании с доступностью генетически кодируемых флуоресцентных белков обеспечивают инструменты, необходимые для получения пространственного и временного распределения белковых ассоциаций внутри живых клеток (Heim and Tsien, 1996; Day, 1998; Elangovan et al., 2002, 2003).

   Широко используемые донорные и акцепторные флуорофоры для исследований FRET происходят из класса аутофлуоресцентных белков, называемых GFP. Спектроскопические свойства, которые тщательно учитываются при выборе GFP в качестве пригодных для работы пар FRET, включают достаточное разделение в спектрах возбуждения для избирательной стимуляции донорного GFP, перекрытие (> 30%) между спектром излучения донора и спектром возбуждения акцептора для получить эффективную передачу энергии и разумное разделение в спектрах излучения между донорными и акцепторными GFP, чтобы обеспечить независимое измерение флуоресценции каждого флуорофора (Pollok and Heim, 19).99). Методы визуализации FRET, основанные на GFP, сыграли важную роль в определении компартментализации и функциональной организации живых клеток и в отслеживании движения белков внутри клеток (Hanson and Kohler, 2001).

   В этой статье мы даем краткое описание методов микроскопической визуализации FRET и анализа данных. Кроме того, обсуждаются важные биологические применения FRET-микроскопии, такие как исследования взаимодействия белков, передача сигналов Ca ²⁺ , исследования нуклеиновых кислот, характеристика экспрессии генов и анализы ПЦР в реальном времени.

   Дополнительные технические сведения о различных методах визуализации FRET на основе интенсивности и времени жизни флуоресценции доступны в Интернете по адресу http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200210140/DC1. Также включено обсуждение успехов других методов FRET-микроскопии.

   В то время как световая микроскопия положила начало нашему пониманию клеточной структуры и связанных с ней функций, молекулярно-биологические исследования за последние несколько десятилетий показали, что клеточные процессы, такие как передача сигнала и транскрипция генов, требуют сборки белков в специфические макромолекулярные комплексы. Традиционные биофизические или биохимические методы не давали прямого доступа к взаимодействиям этих белков-партнеров в их естественной среде. Впоследствии были разработаны основанные на интенсивности методы визуализации с применением метода FRET-микроскопии (широкопольная, конфокальная и многофотонная [MP]), что облегчило изучение этих взаимодействий внутри интактных живых клеток (Periasamy, 2001). Новые технологии визуализации в сочетании с разработкой новых генетически кодируемых флуоресцентных меток и датчиков, а также растущими возможностями компьютерного программного обеспечения для получения и анализа изображений позволили провести более сложные исследования функций и процессов белков, начиная от экспрессии генов и заканчивая каскадами вторичных мессенджеров и межклеточными процессами. сигнализация (Roessel and Brand, 2002).

   FRET-микроскопия основана на способности улавливать флуоресцентные сигналы от взаимодействий меченых молекул в одиночных живых или фиксированных клетках. Если происходит FRET, сигнал донорного канала подавляется, а сигнал акцепторного канала становится чувствительным или усиливается (Herman, 1998). С помощью микроскопии FRET можно увидеть не только совместную локализацию донорно- и акцепторно-меченых зондов в пределах ∼0,09 мкм ² , но также можно проверить молекулярные ассоциации на близких расстояниях.

   Существует несколько методов FRET-микроскопии, каждый из которых имеет свои преимущества и недостатки. Они используются для различных биологических приложений, включая изучение структуры органелл, конъюгированных антител, цитохимической идентификации и окислительного метаболизма (www.cyto.purdue.edu). Широкопольная микроскопия — самый простой и широко используемый метод. Он используется для количественного сравнения клеточных компартментов и покадровых исследований подвижности клеток, внутриклеточной механики и молекулярного движения (www.api.com). Например, новые флуоресцентные индикаторы позволили измерять Ca ²⁺ сигналы в цитозоле и органеллах, которые часто чрезвычайно локализованы (Miyawaki et al., 1997) и недеструктивная визуализация динамической активности протеинтирозинкиназы в отдельных живых клетках (Ting et al., 2001). Однако широкопольная микроскопия имеет существенный недостаток из-за генерации сигналов вне фокуса. Лазерная сканирующая конфокальная микроскопия и микроскопия MP-FRET обеспечивают преимущество в отбрасывании информации, находящейся не в фокусе. Они также позволяют локализовать ассоциации, происходящие внутри клетки, в трех измерениях. Конфокальное FRET-изображение (рис. 1) с улучшенным латеральным разрешением дает обширную спектральную информацию с несколькими преимуществами по сравнению с широкопольным изображением, включая контролируемую глубину резкости и возможность собирать серийные оптические срезы толстых образцов. Благодаря нанометровому разрешению по глубине и неинтрузивности конфокальный FRET обеспечивает новый подход к измерению вязкоупругости и биохимических реакций живых клеток, а также к мониторингу в реальном времени движения клеточных мембран в естественных условиях (неопубликованные данные). Однако конфокальная микроскопия ограничена стандартными лазерными линиями определенной длины волны. Микроскопия MP-FRET преодолевает это ограничение за счет использования перестраиваемого лазера (диапазон 700–1000 нм), что позволяет возбуждать широкий спектр флуорофоров с более высоким осевым разрешением, большей проникающей способностью образца, уменьшенным фотообесцвечиванием маркерных красителей и повышенной жизнеспособностью клеток. Эти преимущества позволяют проводить исследования на толстых образцах живых тканей, которые в противном случае были бы невозможны с помощью обычных методов. Однако все эти методы FRET, основанные на интенсивности, требуют программного обеспечения для удаления нежелательных компонентов просачивания в изображении FRET (рис. 2).

   Другие методы визуализации FRET.

   Временное разрешение методов визуализации может быть достигнуто с помощью метода визуализации времени жизни флуоресценции (FLIM). Этот метод отслеживает локальные изменения времени жизни флуоресценции зонда и обеспечивает огромное преимущество для визуализации динамических событий в живых клетках. В сочетании с FRET этот подход дает прямые доказательства физических взаимодействий между двумя или более белками с очень высоким пространственным и временным разрешением (Bastiaens and Squire, 19).99; Элангован и др., 2002). Корреляционная спектроскопия флуоресценции (FCS) (www.probes.com), в которой спонтанные флуктуации интенсивности флуоресценции измеряются в микроскопическом объеме обнаружения, значительно увеличила полезность и область применения FRET. FRAP, основанный на принципе наблюдения скорости восстановления флуоресценции за счет перемещения флуоресцентного маркера в область мембраны, широко используется для оценки структуры биологических мембран и измерения латеральной диффузии различных мембранных или цитоплазматических составляющие. Родственный метод, потеря флуоресценции при фотообесцвечивании (FLIP), может определить, происходит ли поток между двумя отсеками или нет. FRAP и FLIP полезны для изучения переноса Golgi/ER в клетки животных (Cole et al., 19).96). С развитием новых модальностей FRET, таких как гомоперенос или миграция энергии FRET, фотохромный FRET (Giordano et al., 2002), биолюминесцентный резонансный перенос энергии (BRET) (www.lifesciences.perkinelmer.com) и новый класс люминофоров, называемые длинноволновыми люминофорами с большим квантовым выходом и длительным сроком службы, будущее FRET светлое. Более конкретно, будущие биологические приложения микроскопии изображений FRET могут включать клеточные события, связанные со специфическими молекулярными сигнальными процессами, и одновременное наблюдение ряда обратимых молекулярных процессов в живых клетках (Truong and Ikura, 2001).

   Микроскопия FRET на основе интенсивности имеет ряд недостатков, включая аутофлуоресценцию, шум детектора, оптический шум и фотообесцвечивание. Кроме того, серьезной проблемой является спектральное просачивание (SBT) или вклад донорной и акцепторной флуоресценции в канал FRET. Из-за этих эффектов наблюдаемый сигнал FRET выше фактического сигнала. Чтобы исправить эти проблемы, были разработаны различные методы анализа данных FRET для широкопольной микроскопии (Gordon et al., 19).98; Крайнов и др., 2000; Ся и Лю, 2001). Эти методы корректируют SBT и зависимость FRET от концентраций доноров и акцепторов.

   Недавно был разработан новый алгоритм, который устраняет проблемы SBT как донора, так и акцептора, а также корректирует различия в уровне экспрессии флуорофора для всех методов FRET, основанных на интенсивности (широкое поле, конфокальный и MP), для расчета эффективности FRET (в процентах). ) и оценить расстояние (в ангстремах) между молекулами донора и акцептора в клетке с двойной меткой. Поправки на уровень экспрессии как SBT, так и флуорофора включены в математические расчеты (Elangovan et al., 2003). Из собранных данных компонент просачивания оценивается на основе отдельных образцов донора и акцептора, а затем исключается из данных FRET, пиксель за пикселем, для получения истинного (или точного) сигнала FRET (рис. 2).

   Визуализация FRET с использованием спектральных мутантов GFP дает возможность локализовать и контролировать связывание ионов и межбелковые взаимодействия в живых клетках. Например, FRET-микроскопия с парой CFP/YFP FRET позволяет обнаруживать прямые межмолекулярные взаимодействия интегринов in vivo. Интегрины являются важными трансмембранными рецепторными белками, участвующими в клеточной передаче сигналов и адгезии. Исследования активации и локализации Rac на основе FRET показали, что интегрины индуцируют локальное взаимодействие Rac-эффектор, направляя Rac к мембранам и отделяя его от Rho-GDI (ингибиторы диссоциации гуаниновых нуклеотидов), а также что, несмотря на его гомогенное распределение в клетке, конститутивно активный Rac избирательно взаимодействует с эффекторами в специфических областях клеточного края (Pozo et al. , 2002) (Fig. 1).

   Начало и прекращение передачи сигналов Ca ²⁺ в определенных клеточных компартментах, таких как цитоплазма, ядро ​​или эндоплазматический ретикулум, можно наблюдать, измеряя изменение соотношения интенсивностей флуоресценции акцепторных и донорных молекул в живых клетках (Truong и др., 2001). Cameleons, класс флуоресцентных индикаторов Ca ²⁺ на основе GFP и кальмодулина (CAM), являются полезными инструментами для измерения концентраций свободного Ca ²⁺ в живых клетках. Традиционный желтый камелеон состоит из слияния CFP, CAM, CAM-связывающего пептида киназы легкой цепи миозина (MLCKp) и YFP. С увеличением свободного Ca ²⁺ в растворе САМ-модуль камелеона связывает Ca ²⁺ и оборачивается вокруг слитого MLCKp. Это конформационное изменение уменьшает расстояние между CFP и YFP. Поскольку FRET зависит как от близости донорных и акцепторных флуорофоров, так и от ориентации их относительных диполей, взаимодействие камелеонов с Ca ²⁺ приводит к изменению степени FRET между CFP и YFP. После калибровки реакции FRET на известные концентрации Ca ²⁺ степень FRET in vivo теоретически может отражать абсолютные уровни Ca ²⁺ присутствует в клеточных компартментах.

   Помимо внутриклеточного восприятия ионов, конструкции FRET использовались для исследования нижестоящих событий передачи сигналов вторичных мессенджеров (Adams et al., 1991). Для нацеливания на сигнальный путь цАМФ была разработана сенсорная конструкция, в которой индуцируемый киназой домен белка, связывающего цАМФ-чувствительный элемент, образует линкер между синим флуоресцентным белком и GFP. Известно, что цАМФ-индуцированное РКА-зависимое фосфорилирование вызывает конформационные изменения в киназо-индуцируемом домене, и эффективность FRET изменяется в ответ на передачу сигналов цАМФ.

   FRET устанавливает возможность изучения в локализованном пространственном масштабе взаимодействий между парой рецептор-лиганд, димеризации отдельных рецепторов, а также трансбислойного распределения флуоресцентных аналогов липидов и белково-опосредованного переноса липидов между везикулами. Изменения эффективности FRET, вызванные жирными кислотами, фосфолипидами и холестерином, привели к идентификации дискретных сайтов связывания липидов на мембраносвязанном белке никотинового ацетилхолинового рецептора (www.kenes.com/cholinergic). FRET используется для обнаружения димеризации рецептора EGF (EGFR) и его конформационного состояния (Gadella and Jovin, 19).95). Флуоресцентно меченные молекулы EGF с донором флуоресцеина и акцептором родамина позволяли связывать EGFR, присутствующий на клетках. Степень олигомеризации рецепторов контролировали по эффективности FRET с пространственным разрешением в зависимости от соотношения донор/акцептор и условий лечения. Увеличение средней эффективности FRET указывало на минимальную димеризацию рецепторов для субпопуляции высокоаффинных рецепторов. Эти результаты доказывают, что связывание EGF приводит к быстрой и зависящей от температуры микрокластеризации EGFR, который присутствует в предварительно димеризованном или олигомеризованном состоянии.

   FRET также используется для изучения структуры, конформации, гибридизации и автоматического секвенирования нуклеиновых кислот. Хромосомный FISH, основанный на гибридизации фрагмента нуклеиновой кислоты с его комплементом, стал чрезвычайно важным для картирования генов, идентификации мутаций, клинической диагностики и изучения хромосомной и ядерной архитектуры. Для обнаружения мутаций и высокопроизводительного анализа генома был разработан диагностический анализ гомогенной ДНК, основанный на направленном на матрицу удлинении праймера, обнаруженном с помощью FRET, названный анализом включения терминатора красителя на матрицу, который был разработан для обнаружения мутаций и высокопроизводительного анализа генома (Chen et al., 19).97).

   Более современный подход к характеристике экспрессии генов включает использование «флуоресцентного таймера», мутанта флуоресцентного белка dsRed, который со временем меняет цвет с зеленого на красный. Зеленая флуоресценция указывает на недавно транслированный белок, который в течение нескольких часов подвергается кислородзависимой автокаталитической реакции с образованием красной флуоресценции, обозначающей созревший белок. Поскольку белок-таймер переключает флуоресценцию с течением времени, его можно использовать в качестве таймера для экспрессии генов. Таким образом, ткань указывает на историю своего флуоресцентного таймера по соотношению зеленой и красной флуоресценции; ткани, которые недавно инициировали экспрессию гена, выглядят зелеными, ткани с непрерывной экспрессией — от желтого до оранжевого, а те, экспрессия которых прекратилась, — полностью красными.

   FRET также находит значительное применение в анализах слияния мембран и ПЦР в реальном времени. В анализах смешения липидов, основанных на переносе энергии NBD-rhodamine (Struck et al., 1981), мембраны, меченные комбинацией донорных и акцепторных липидных зондов FRET, смешиваются с немечеными мембранами. FRET уменьшается, когда среднее пространственное разделение зондов увеличивается при слиянии меченых мембран с немечеными мембранами. В ПЦР в реальном времени отслеживают количество испускаемой флуоресценции в каждом цикле как показатель продукции ампликона. Флуоресцентный мониторинг ПЦР для обнаружения и количественного определения стал стандартным методом со многими приложениями, включая анализ экспрессии и обнаружение патогенов.

   Иммуноанализы FRET, включающие фосфопептид, меченный на конце Cy5 NH ₂ , который распознается первичным мышиным антителом против фосфотирозина, за которым следует меченное Cy3 вторичное антитело, полезны для измерения специфических взаимодействий антитело-антиген. FRET возникает, когда компоненты последовательно связаны друг с другом, и возбуждение на длинах волн Cy3 приводит к излучению на длинах волн Cy5. Нарушение взаимодействия между фосфопептидом и первичным антителом приведет к уменьшению наблюдаемого сигнала FRET. FRET также используется при разработке и синтезе субстратов флуорогенных ферментов на основе FRET, полезных для мониторинга ферментативной активности.

   Биология, визуализация и спектроскопия недавно были объединены в мощные инструменты для исследований и клинических применений. Методы FRET и флуоресцентные реагенты, такие как GFP, которые широко используются для исследования присутствия и активности генов, клеточных компонентов и метаболических или сигнальных путей, могут стать более мощными и гибкими при использовании инструментов мультиспектральной визуализации. Спектральная визуализация начала улучшать методы хромосомного анализа и генотипирования благодаря легкому и точному обнаружению хромосомных перестроек, связанных с раком и генетическими аномалиями. Методы оптической биопсии используют спектроскопическую информацию, присутствующую во внутренних или экзогенных хромофорах и флуорофорах, для дифференциации опухолей и дисплазий от нормальных тканей. Потенциальные приложения для FRET-визуализации тканей также расширяются. Благодаря последним достижениям в области флуоресцентных зондов, инструментов и методологий FRET, несомненно, произведет революцию в научных исследованиях в ближайшем будущем.

   Благодарим Drs. Ричарду Дэю и Мартину Шварцу за полезные обсуждения. Мы благодарим Колтена Ноукса и г-жу Йе Чен за их квалифицированную помощь.

   Работа выполнена при поддержке W.M. Фонд Кека.

   Электронная версия этой статьи включает дополнительные материалы.

   *

   Сокращения, использованные в данной статье: CAM, кальмодулин; EGFR, рецептор EGF; FRET — резонансный перенос энергии флуоресценции; МП, мультифотон; SBT, спектральное просачивание.

   Адамс С.Р., А.Т. Харотунян, Ю.Дж. Бюхлер, С.С. Тейлор и Р.Ю. Циен.

   1991

   . Визуализация коэффициента флуоресценции циклического AMP в одиночных клетках.

   Природа.

   349

   :

   694

   –697.

   Бастианс, П.И. и А. Сквайр.

   1999

   . Микроскопия времени жизни флуоресценции: пространственное разрешение биохимических процессов в клетке.

   Trends Cell Biol.

   9

   :

   48

   –52.

   Чен, X., Б. Ценбауэр, А. Гнирке и П.Ю. квок.

   1997

   . Обнаружение переноса энергии флуоресценции как метод диагностики гомогенной ДНК.

   Проц. Натл. акад. науч. США.

   94

   :

   10756

   –10761.

   Клегг, Р.М. 1996. Резонансный перенос энергии флуоресценции. Флуоресцентная визуализирующая спектроскопия и микроскопия. Том. 137. Х.Ф. Ван и Б. Герман, редакторы. John Wiley & Sons Inc., Нью-Йорк. 179–251.

   Коул, Н.Б., К.Л. Смит, Н. Скиаки, М. Терасаки, М. Эдидин и Дж. Л. Шварц.

   1996

   . Диффузионная подвижность белков Гольджи в мембранах живых клеток.

   Наука.

   273

   :

   797

   –801.

   Дэй, Р.Н.

   1998

   . Визуализация взаимодействий фактора транскрипции Pit-1 в ядре живой клетки с помощью флуоресцентной резонансной микроскопии с переносом энергии.

   Мол. Эндокринол.

   12

   :

   1410

   –1419.

   душ Ремедиос, К.Г., М. Мики и Дж.А. Барден.

   1987

   . Измерения переноса энергии флуоресцентного резонанса на расстояния в актине и миозине: критическая оценка.

   J. Muscle Res. Селл Мотил.

   8

   :

   97

   –117.

   Элангован М., Р.Н. Дэй и А. Периасами.

   2002

   . Наносекундная флуоресцентная резонансная флуоресцентная микроскопия с переносом энергии и флуоресцентной визуализацией для локализации белковых взаимодействий в одной живой клетке.

   J. Microsc.

   205

   :

   3

   –14.

   Элангован М., Х. Валрабе, Ю. Чен, Р.Н. Дэй, М. Баррозу и А. Периасами.

   2003

   . Характеристика одно- и двухфотонного возбуждения флуоресцентной резонансной микроскопии переноса энергии.

   Методы.

   29

   :

   58

   –73.

   Фёрстер, Т. 1965. Делокализованное возбуждение и передача возбуждения. Современная квантовая химия. Том. 3. Синаноглу О., редактор. Academic Press Inc., Нью-Йорк. 93–137.

   Гаделла, Т.В.Дж., младший, и Т.М. Джовин.

   1995

   . Олигомеризацию рецепторов эпидермального фактора роста на клетках A431 изучали с помощью флуоресцентной микроскопии с временным разрешением. Стереохимическая модель активации рецептора тирозинкиназы.

   J. Cell Biol.

   129

   :

   1543

   –1548.

   Джордано, Л., Т.М. Джовин, М. Ири и Э.А. Джарес-Эриджман.

   2002

   . Дигетероарилетены как термостабильные фотопереключаемые акцепторы в фотохромной флуоресцентной резонансной передаче энергии (pcFRET).

   Дж. Ам. хим. соц.

   124

   :

   7481

   –7489.

   Гордон, Г.В., Г. Берри, X.Х. Лян, Б. Левин и Б. Герман.

   1998

   . Количественные измерения переноса энергии флуоресцентного резонанса с использованием флуоресцентной микроскопии.

   Биофиз. J.

   74

   :

   2702

   –2713.

   Хэнсон М. Р. и Р. Х. Колер.

   2001

   . Визуализация GFP: методология и применение для исследования клеточных компартментов у растений.

   Дж. Эксп. Бот.

   52

   :

   529

   –539.

   Хейм Р. и Р.Ю. Циен.

   1996

   . Разработка зеленого флуоресцентного белка для улучшения яркости, увеличения длины волны и резонансной передачи энергии флуоресценции.

   Курс. биол.

   6

   :

   178

   –182.

   Герман Б. 1998. Флуоресцентная микроскопия. 2-е изд. Springer-Verlag New York Inc., Нью-Йорк. 170 стр.

   Крайнов В.С., К. Чемберлен, Г.М. Бокох, М.А. Шварц, С. Слабо и К.М. Хан.

   2000

   . Локализованная динамика активации Rac визуализируется в живых клетках.

   Наука.

   290

   :

   333

   –337.

   Лакович, Дж. Р. 1999. Принципы флуоресцентной спектроскопии. 2-е изд. Plenum Publishing Corp., Нью-Йорк. 692 стр.

   Мияваки, А., Дж. Ллопис, Р. Хейм, Дж. М. МакКаффери, Дж. А. Адамс, М. Икура и Р.Ю. Циен.

   1997

   . Флуоресцентные индикаторы Ca2+ на основе зеленых флуоресцентных белков и кальмодулина.

   Природа.

   388

   :

   882

   –887.

   Периасами, А. 2001. Методы клеточной визуализации. Издательство Оксфордского университета, Нью-Йорк. 434 стр.

   Поллок, Б.А., и Р. Хейм.

   1999

   . Использование GFP в приложениях на основе FRET.

   Trends Cell Biol.

   9

   :

   57

   –60.

   Позо, М.А.Д., В.Б. Киоссес, Н.Б. Алдерсон, Н. Меллер, К.М. Хан и М.А. Шварц.

   2002

   . Интегрины регулируют локализованные эффекторные взаимодействия GTP-Rac посредством диссоциации Rho-GDI.

   Нац. Клеточная биол.

   4

   :

   232

   –239.

   Россель П.В. и А.Х. Бранд.

   2002

   . Визуализация в будущее: визуализация экспрессии генов и взаимодействия белков с флуоресцентными белками.

   Нац. Клеточная биол.

   4

   :

   E15

   –E20.

   Струк, Д.К., Д. Хукстра и Р.Э. Пагано.

   1981

   . Использование резонансной передачи энергии для мониторинга слияния мембран.

   Биохимия.

   20

   :

   4093

   –4099.

   Труонг К. и М. Икура.

   2001

   . Использование микроскопии визуализации FRET для обнаружения межбелковых взаимодействий и конформационных изменений белков in vivo.

   Тек. мнение Структура биол.

   11

   :

   573

   –578.

   Труонг К., А. Савано, Х. Мидзуно, Х. Хама, К. Тонг, Т.К. Мал, А. Мияваки и М. Икура.

   2001

   . Визуализация Ca2+ in vivo на основе FRET с помощью новой слитой молекулы кальмодулин-GFP.

   Нац. Структура биол.

   8

   :

   1069

   –1073.

   Тинг А.Ю., К.Х. Каин, Р.Л. Клемке и Р. Ю. Циен.

   2001

   . Генетически кодируемые флуоресцентные репортеры активности протеинтирозинкиназы в живых клетках.

   Проц. Натл. акад. науч. США.

   98

   :

   15003

   –15008.

   Ся, З. и Ю. Лю.

   2001

   . Надежное и глобальное измерение переноса энергии резонанса флуоресценции с использованием флуоресцентных микроскопов.

   Биофиз. J.

   81

   :

   2395

   –2402.

   Дополнительные данные

   Методы визуализации FRET на основе интенсивности и времени жизни флуоресценции — файл в формате pdf

   данные и цифры

   Данные и цифры

   содержимое

   Содержимое

   добавки

   Дополнения

   ссылок

   Ссылки

   Рисунок 1.

   Конфокальный FRET-анализ демонстрирует, что интегрины индуцируют локальную Rac-эффекторную связь. 9В клетки 0082 NIH-3T3 микроинъецировали кДНК, кодирующие указанные слитые белки GFP-V12-Rac, а затем белок Alexa-PBD (Pozo et al., 2002). Показаны изображения донора (A), нескорректированного FRET (B) и скорректированного FRET (C). На цветовой шкале красный цвет соответствует высокому уровню сигнала FRET, а синий — низкому.

   Рисунок 1.

   Конфокальный FRET-анализ демонстрирует, что интегрины индуцируют локальную Rac-эффекторную связь. В клетки NIH-3T3 микроинъецировали кДНК, кодирующие указанные слитые белки GFP-V12-Rac, а затем белок Alexa-PBD (Pozo et al., 2002). Показаны изображения донора (A), нескорректированного FRET (B) и скорректированного FRET (C). На цветовой шкале красный цвет соответствует высокому уровню сигнала FRET, а синий — низкому.

   Закрыть модальное окно

   Рисунок 2.

   Локализация белков CFP- и YFP-C/EBP α , экспрессированных в клетках гипофиза GHFT1-5 живых мышей, изученных с помощью микроскопии Bio-Rad Laboratories MP-FRET. Донорское (A), нескорректированное FRET (B) и обработанное FRET (C) изображения и их соответствующие гистограммы (D, E и F), представляющие силу сигнала выбранного белка (Elangovan et al., 2003).

   Рисунок 2.

   Локализация белков CFP- и YFP-C/EBP α , экспрессированных в клетках гипофиза GHFT1-5 живых мышей, изученных с помощью микроскопии Bio-Rad Laboratories MP-FRET. Донорское (A), нескорректированное FRET (B) и обработанное FRET (C) изображения и их соответствующие гистограммы (D, E и F), представляющие силу сигнала выбранного белка (Elangovan et al., 2003).

   Закрыть модальное окно

   • Предыдущая статья
   • Следующая статья

   Адамс С. Р., А.Т. Харотунян, Ю.Дж. Бюхлер, С.С. Тейлор и Р.Ю. Циен.

   1991

   . Визуализация коэффициента флуоресценции циклического AMP в одиночных клетках.

   Природа.

   349

   :

   694

   –697.

   Бастианс, П.И. и А. Сквайр.

   1999

   . Микроскопия времени жизни флуоресценции: пространственное разрешение биохимических процессов в клетке.

   Trends Cell Biol.

   9

   :

   48

   –52.

   Чен, X., Б. Ценбауэр, А. Гнирке и П.Ю. квок.

   1997

   . Обнаружение переноса энергии флуоресценции как метод диагностики гомогенной ДНК.

   Проц. Натл. акад. науч. США.

   94

   :

   10756

   –10761.

   Клегг, Р.М. 1996. Резонансный перенос энергии флуоресценции. Флуоресцентная визуализирующая спектроскопия и микроскопия. Том. 137. Х.Ф. Ван и Б. Герман, редакторы. John Wiley & Sons Inc., Нью-Йорк. 179–251.

   Коул, Н.Б., К.Л. Смит, Н. Скиаки, М. Терасаки, М. Эдидин и Дж. Л. Шварц.

   1996

   . Диффузионная подвижность белков Гольджи в мембранах живых клеток.

   Наука.

   273

   :

   797

   –801.

   Дэй, Р.Н.

   1998

   . Визуализация взаимодействий фактора транскрипции Pit-1 в ядре живой клетки с помощью флуоресцентной резонансной микроскопии с переносом энергии.

   Мол. Эндокринол.

   12

   :

   1410

   –1419.

   душ Ремедиос, К. Г., М. Мики и Дж.А. Барден.

   1987

   . Измерения переноса энергии флуоресцентного резонанса на расстояния в актине и миозине: критическая оценка.

   J. Muscle Res. Селл Мотил.

   8

   :

   97

   –117.

   Элангован М., Р.Н. Дэй и А. Периасами.

   2002

   . Наносекундная флуоресцентная резонансная флуоресцентная микроскопия с переносом энергии и флуоресцентной визуализацией для локализации белковых взаимодействий в одной живой клетке.

   Дж. Микроск.

   205

   :

   3

   –14.

   Элангован М., Х. Валрабе, Ю. Чен, Р.Н. Дэй, М. Баррозу и А. Периасами.

   2003

   . Характеристика одно- и двухфотонного возбуждения флуоресцентной резонансной микроскопии переноса энергии.

   Методы.

   29

   :

   58

   –73.

   Фёрстер, Т. 1965. Делокализованное возбуждение и передача возбуждения. Современная квантовая химия. Том. 3. Синаноглу О., редактор. Academic Press Inc., Нью-Йорк. 93–137.

   Гаделла, Т.В.Дж., младший, и Т.М. Джовин.

   1995

   . Олигомеризацию рецепторов эпидермального фактора роста на клетках A431 изучали с помощью флуоресцентной микроскопии с временным разрешением. Стереохимическая модель активации рецептора тирозинкиназы.

   J. Cell Biol.

   129

   :

   1543

   –1548.

   Джордано, Л., Т.М. Джовин, М. Ири и Э.А. Джарес-Эриджман.

   2002

   . Дигетероарилетены как термостабильные фотопереключаемые акцепторы в фотохромной флуоресцентной резонансной передаче энергии (pcFRET).

   Дж. Ам. хим. соц.

   124

   :

   7481

   –7489.

   Гордон, Г.В., Г. Берри, X.Х. Лян, Б. Левин и Б. Герман.

   1998

   . Количественные измерения переноса энергии флуоресцентного резонанса с использованием флуоресцентной микроскопии.

   Биофиз. J.

   74

   :

   2702

   –2713.

   Хэнсон М. Р. и Р. Х. Колер.

   2001

   . Визуализация GFP: методология и применение для исследования клеточных компартментов у растений.

   J. Расшир. Бот.

   52

   :

   529

   –539.

   Хейм Р. и Р.Ю. Циен.

   1996

   . Разработка зеленого флуоресцентного белка для улучшения яркости, увеличения длины волны и резонансной передачи энергии флуоресценции.

   Курс. биол.

   6

   :

   178

   –182.

   Герман Б. 1998. Флуоресцентная микроскопия. 2-е изд. Springer-Verlag New York Inc., Нью-Йорк. 170 с.

   Крайнов В.С., К. Чемберлен, Г.М. Бокох, М.А. Шварц, С. Слабо и К.М. Хан.

   2000

   . Локализованная динамика активации Rac визуализируется в живых клетках.

   Наука.

   290

   :

   333

   –337.

   Лакович, Дж. Р. 1999. Принципы флуоресцентной спектроскопии. 2-е изд. Plenum Publishing Corp., Нью-Йорк. 692 стр.

   Мияваки, А., Дж. Ллопис, Р. Хейм, Дж. М. МакКаффери, Дж. А. Адамс, М. Икура и Р.Ю. Циен.

   1997

   . Флуоресцентные индикаторы Ca2+ на основе зеленых флуоресцентных белков и кальмодулина.

   Природа.

   388

   :

   882

   –887.

   Периасами, А. 2001. Методы клеточной визуализации. Издательство Оксфордского университета, Нью-Йорк. 434 стр.

   Поллок, Б.А., и Р. Хейм.

   1999

   . Использование GFP в приложениях на основе FRET.

   Trends Cell Biol.

   9

   :

   57

   –60.

   Позо, М.А.Д., В.Б. Киоссес, Н.Б. Алдерсон, Н. Меллер, К.М. Хан и М.А. Шварц.

   2002

   . Интегрины регулируют локализованные эффекторные взаимодействия GTP-Rac посредством диссоциации Rho-GDI.

   Нац. Клеточная биол.

   4

   :

   232

   –239.

   Россель П.В. и А.Х. Бранд.

   2002

   . Визуализация в будущее: визуализация экспрессии генов и взаимодействия белков с флуоресцентными белками.

   Нац. Клеточная биол.

   4

   :

   E15

   –E20.

   Струк, Д.К., Д. Хукстра и Р.Э. Пагано.

   1981

   . Использование резонансной передачи энергии для мониторинга слияния мембран.

   Биохимия.

   20

   :

   4093

   –4099.

   Труонг К. и М. Икура.

   2001

   . Использование микроскопии визуализации FRET для обнаружения межбелковых взаимодействий и конформационных изменений белков in vivo.

   Курс. мнение Структура биол.

   11

   :

   573

   –578.

   Труонг К., А. Савано, Х. Мидзуно, Х. Хама, К. Тонг, Т.К. Мал, А. Мияваки и М. Икура.

   2001

   . Визуализация Ca2+ in vivo на основе FRET с помощью новой слитой молекулы кальмодулин-GFP.

   Нац. Структура биол.

   8

   :

   1069

   –1073.

   Тинг А.Ю., К.Х. Каин, Р.Л. Клемке и Р.Ю. Циен.

   2001

   . Генетически кодируемые флуоресцентные репортеры активности протеинтирозинкиназы в живых клетках.

   Проц. Натл. акад. науч. США.

   98

   :

   15003

   –15008.

   Ся З. и Ю. Лю.

   2001

   . Надежное и глобальное измерение переноса энергии резонанса флуоресценции с использованием флуоресцентных микроскопов.

   Биофиз. J.

   81

   :

   2395

   –2402.

   Brookfield, Toll JV Долгая игра как наиболее раздражающий краткосрочный риск

   Brookfield, Toll JV Долгосрочная игра как наиболее раздражающий краткосрочный риск

   ПОДЕЛИТЬСЯ:

   Джон МакМанус

   17 августа 2022 г.

   • Неопровержимое будущее требует, чтобы строители и застройщики строили гораздо больше новых домов и сообществ для людей, которые нуждаются в них, могут заплатить за них и мечтают жить в них.
   • Эпически неопределенное настоящее тянет — по крайней мере временно, пока те же самые люди решают двигаться вперед, а не ждать более подходящего момента — в противоположную сторону.

   Между двумя висит период времени, который испускает один сигнал для одного типа игроков и другой сигнал для другого, каждый ловит рыбу не только для того, чтобы выжить в турбулентности, но и – на один день – для того, чтобы доминировать над следующей восходящей волной. Сегодняшняя коррекция цикла недвижимости со смешанными сигналами кричит: «Подождите!» для игроков, сталкивающихся с грызущим и сбивающим с толку настоящим раскаянием покупателя «падающего ножа», даже если многие из них сидят на надежных балансах и с низким кредитным плечом. В то же время расширяющийся круговорот головокружения и волнения может также шептать: «Сделай это, сейчас же!» другим. У них достаточно сухого порошка, очень терпеливый капитал и особый стратегический импульс, который связывает это неопровержимое будущее с их собственным брендом и моделью создания ценности для покупателей и арендаторов жилья.

   Добро пожаловать в лимб теста Роршаха каждого жилищного цикла, временной диапазон недель или месяцев, когда — особенно среди игроков, приобретающих землю и объекты — стратегический оппортунизм и тактическая нерешительность сталкивают соперников друг с другом. В такое время сделка, которая может показаться опрометчивой и безрассудной ошибкой для большинства фирм, может показаться идеальным моментом для смелого удара для немногих немногих.

   Для тех избранных, что сейчас выглядит и ощущается как превосходный момент, чтобы зажечь всплеск роста после экономического спада, создав бочку земли и развития для жемчужины общественного объекта, торжественное открытие которого запланировано примерно на весну 2024 года. большинство строителей становятся все более брезгливыми, чтобы смотреть дальше сложного конца года в 2022 году и дерьма на год вперед, эта крошечная группа исключений считает, что они не могут позволить себе упустить единственные в своем роде возможности, которые охватывает цикл роста жилищного строительства, простирающийся до начала следующего десятилетия и далее.

   У некоторых строителей будут натянуты шоры, потому что мы больше не находимся в периоде «златовласки», — говорит Тони Авила, генеральный директор Builder Advisor Group, которая выступает в качестве стратегического консультанта по вопросам слияний и поглощений, а также сделок с земельными участками в текущем бизнес-контексте. «Они прекратят приобретение земли, уволят земельный персонал и засунут голову в песок в отношении приобретения земли. Другие будут более смелыми и посмеют быть великими. процветать в долгосрочной перспективе».

   На этом фоне материнская компания Brookfield Properties, Brookfield Asset Management, и Toll Brothers согласились выделить 43 миллиона долларов компании Bellevue, штат Вашингтон, отмеченной наградами компании Oakpointe Communities, за участок площадью 214 акров, зонированный для 1750 жилых домов в LakePointe. Городская деревня в Ковингтоне, штат Вашингтон. Отель находится на равном расстоянии от Сиэтла и Такомы.

   Изображение предоставлено Brookfield Properties

   The News

   Согласно заявлению для прессы:

   LakePointe, бывший участок добычи гравия, зонирован на 1750 жилых домов, включая как пристроенные, так и отдельные дома на одну семью, а также два многоквартирных дома. — семейные посылки. Он также одобрен для коммерческих площадей площадью до 1,3 миллиона квадратных футов, включая торговые, офисные и гостиничные помещения, а также жилые помещения для престарелых.

   Участок был приобретен дочерней компанией Brookfield Asset Management по недвижимости и Toll Brothers, и будет разрабатываться совместно Brookfield Properties и Toll Brothers. На сегодняшний день эта сделка является крупнейшей в регионе для Toll Brothers и представляет собой значительное расширение рынка Сиэтла для Brookfield, которая уже имеет значительное присутствие в регионе в сфере недвижимости, включая офисы, магазины, логистику и многоквартирные дома. семейный бизнес, а также спланированное мастером развитие сообщества.

   Лейк-Пойнт расположен в популярном пригородном коридоре округа Кинг, на основном пути роста MSA Сиэтла. Недвижимость расположена в северной части города Ковингтон, всего в 35 минутах от центра Сиэтла, и считается одним из немногих оставшихся больших участков земли в регионе, подходящих для развития сообщества.

   Согласно более раннему отчету Реестра, Pacific North West Real Estate:

   Проект, который был совместным предприятием Oakpointe Communities и Presidio Residential Capital, был разработан KTGY Architecture. Комплекс должен был быть построен на полуострове, простирающемся наружу к озеру площадью 20 акров, и предлагать различные варианты использования, а также парк, открытое пространство и пешеходные тропы. В то время предполагалось, что проект будет стоить около 670 миллионов долларов.

   Хотя неясно, продолжит ли Toll Brothers проект в соответствии с планом, компания строит роскошные дома в Соединенных Штатах с момента своего основания в 1967 году. В 2011 году компания вышла на рынок Вашингтона, приобретя жилой комплекс CamWest. .

   Скотт Джонс, старший вице-президент по операциям группы развития Тихоокеанского Северо-Запада Brookfield Properties — часть исполнительной команды, перешедшей в Brookfield после приобретения чуть более года назад Newland Communities, — шутит, что два из самых больших изменений со времен Newland стал Брукфилд:

   Наши электронные письма и решительный, постоянный толчок к росту», — говорит Джонс.

   Императив роста, который Джонс имеет в виду, направлен на достижение двух целей — одна из которых заключается в более глубоком масштабе и большей доле в текущем охвате империи развития — как совместное предприятие с Toll Brothers, чтобы интегрировать LakePointe в и без того надежное присутствие запланированного сообщества Тихоокеанского Северо-Запада иллюстрирует влияние Брукфилда там уже включает в себя близлежащее многофункциональное сообщество Tehaleh площадью 4700 акров, а также торговые, логистические и офисные объекты в районе Сиэтл-Такома. Другое сообщество Brookfield Properties на тихоокеанском северо-западе — это многофункциональное сообщество площадью 463 акра в Хиллсборо, всего в 12 милях от центра Портленда, штат Орегон.0005

   Это приобретение является инвестицией в нашу долгосрочную приверженность Тихоокеанскому северо-западу, что позволяет нам использовать наш накопленный опыт в области землеустройства и расширять наше присутствие на динамичном, растущем рынке», — сказал Адриан Фоули, управляющий партнер по недвижимости и генеральный директор. , Развитие с Brookfield Properties. «Партнерство с Toll Brothers и использование нашего коллективного опыта демонстрируют нашу способность сотрудничать с другим лидером отрасли. Это совместное предприятие предлагает еще одну феноменальную возможность смешанного использования на этом захватывающем и востребованном рынке, на котором Brookfield Properties продолжает бурно расти».

   Что касается сроков проведения теста Роршаха, Джонс подтверждает деловой послужной список как Brookfield, так и Toll Brothers как контрциклических игроков в долгосрочную игру.

   Мы согласны с тем, как мы рассматриваем динамику смягчения и вызовов в данный момент как как долгосрочную возможность, так и в более среднесрочной перспективе, чтобы добиться хороших результатов, особенно на рынке Сиэтла, который продолжает показывать признаки силы, но которая хронически ограничена в новом домашнем снабжении. LakePointe — одно из немногих настоящих сокровищ, которые можно вывести в онлайн, и мы рады, что будем работать с Toll Brothers, чтобы сделать это». 2329

   Одновременно продавец Oakpointe и его основатель Брайан Росс также – возвращаясь к своей работе над гигантской сделкой в ​​середине нулевых по продаже Black Diamond Ranch тогдашней Standard Pacific, которая стала CalAtlantic, которая теперь называется Lennar. Сверхъестественный набор навыков Росса состоит в том, чтобы брать сырую грязь и превращать ее в золото, как он неоднократно делал на Тихоокеанском Северо-Западе.

   Создав структуру СП для осуществления приобретения в это время, оба партнера получают, по крайней мере, возможность управлять предприятием за балансом. Несмотря на то, что они разделяют риски, эксклюзивному партнеру по строительству домов на одну семью Toll Brothers не нужно поглощать землю как «собственное» бремя капитальных вложений на свой собственный баланс, что является более легким механизмом для передачи участков.

   Компания Toll Brothers, входящая в пятерку лучших строителей жилья на оси Вашингтон-Орегон, теперь стремительно поднимается в тройку лучших строителей Тихоокеанского Северо-Запада, на рынок, на который она вышла 11 лет назад.

   Структура совместного предприятия, в которой мы занимаемся всей горизонтальной разработкой и созданием мест, а Toll Brothers — вертикальным продуктом, позволяет каждой из наших организаций использовать наши самые сильные стороны», — говорит Джонс. из Сиэтла и Такомы, и является родным городом для сотрудников Microsoft, Amazon, T-Mobile, Boeing и т. д. — это то, что я называю золотым пятном как для легкой поездки на работу, так и для прекрасной удаленной работы из дома. ощущение провинциального городка».

   В то время как торжественное открытие сообщества и продажа первых домов не начнутся в течение почти двух лет, Джонс характеризует планировку участка площадью 214 акров, плотность, разнообразие односемейных отдельно стоящих, пристроенных и многоквартирных домов, предназначенных для сдачи в аренду. Джонс говорит, что это более доступная возможность в ценовом диапазоне.

   Согласно заявлению для прессы:

   Мы рады сотрудничать с Brookfield Properties в рамках совместного предприятия по развитию этого особенного участка земли в районе Сиэтла», — сказал Дуглас С. Йерли-младший, председатель и главный исполнительный директор Братья Толл. «Это приобретение открывает множество возможностей на желанном участке застройки на северо-западе Тихого океана. Мы с нетерпением ждем расширения нашего присутствия в регионе и работы с нашими партнерами, чтобы воплотить в жизнь это важное развитие сообщества».

   Таким образом, в то время как другие беспокоятся об эпических неопределенностях и рисках настоящего, Брукфилд и Толл стремятся зафиксировать неопровержимое ближайшее и более отдаленное будущее, и не будет сюрпризом увидеть их в тандеме в других смелые движения в течение дня, многие другие внимательно следят за каждым долларом.

   Присоединиться к разговору

   Земельные участки приобретение земли Приобретение, разработка и строительство много Землеустройство Жилая застройка разработчик Сообщество по вопросам развития местные рынки данные о местном жилье домостроитель Домостроение Разработка генерального плана оценка земли

   ОБ АВТОРЕ

   Президент и основатель

   ОБ АВТОРЕ

   Веб-сайт

   MORE IN Land

   Великие южные развороты через сделку SPAC в новейшую государственную власть расти .

   .. быстро и далеко.

   
   

   Количество участников торгов на фронте приобретения земли сокращается: пора набрасываться

   По мере того, как строители начинают сдерживать некогда ненасытный аппетит к лотам, контрциклические игроки активизируют свои покупки земли, чтобы смягчить риски строителей.

   
   

   Manifest Destiny 2.0 заставляет технологии работать, пока люди ищут лучшую жизнь

   Новые правила новой географии возвращаются к основополагающему правилу на все времена — правилу, которое сочетает средства к существованию и дом максимально возможным синхронным образом. Люди тяготеют к тому, где дом, работа и средства лучше всего сочетаются.

   
   

   Земельные участки приобретение земли Приобретение, разработка и строительство много Землеустройство Жилая застройка разработчик Сообщество по вопросам развития местные рынки данные о местном жилье домостроитель Домостроение Разработка генерального плана оценка земли

   MORE IN Land

   Великие южные развороты через сделку SPAC в новейшую государственную власть расти .

   .. быстро и далеко.

   
   

   Количество участников торгов на фронте приобретения земли сокращается: пора наступать

   По мере того, как строители начинают сдерживать некогда ненасытный аппетит к лотам, контрциклические игроки активизируют свои покупки земли, чтобы смягчить риски строителей.

   
   

   Manifest Destiny 2.0 заставляет технологии работать, поскольку люди ищут лучшую жизнь

   Новые правила новой географии возвращаются к основополагающему правилу на все времена — правилу, которое сочетает средства к существованию и дом максимально возможным синхронным образом. Люди тяготеют к тому, где дом, работа и средства лучше всего сочетаются.

   
   
   

   Инструменты LanthaScreen TR-FRET для разработки тестов | Термо Фишер Научный

   Гибкие инструменты для разработки тестов TR-FRET:
   

   • Выберите из донорских хелатных этикеток европия или тербия 
     
   • Получите меченые антивидовые, антиэпитопные и стрептавидиновые препараты, сопоставимые с эффективностью вашего проекта разработки анализа 0073
     
     
     
   • другие доступные инструменты TR-FRET
     
   • Маркируйте свои собственные молекулы или позвольте нам сделать это за вас
     

   Независимо от того, регулярно ли вы проводите собственные анализы для поддержки программ исследования или вам нужны универсальные реагенты для быстрого создания новых анализов TR-FRET , наш портфель реагентов LanthaScreen может помочь вам в программе разработки анализов. Наш набор инструментов LanthaScreen предлагает коллекцию реагентов тербия и европия для истинного опыта «смешивания и подбора». Наши меченные европием антитела совместимы не только с флуорофорами от Life Technologies (такими как Alexa Fluor 633 и 647), но и с другими красными флуорофорами, такими как красители CyDyes и ULight.
   

   Choose from:

   • anti-Epitope Tag Antibodies
   • Secondary antibodies
   • Streptavidin and Biotin
     
   • Reactive chelate labeling reagents and labeling services

   LanthaScreen anti-Epitope Tag Antibodies

   Эпитопные метки облегчают очистку белков для использования во многих областях. Такие метки также можно использовать для косвенной маркировки белков с помощью антител против эпитопной метки LanthaScreen.

   Косвенное мечение белка с помощью антител против эпитопной метки может быть полезным при работе с частично очищенным белком или в случаях, когда прямое мечение белка может отрицательно повлиять на активность белка.

   Наши продукты доступны в виде наборов или отдельных антител. Пробные наборы содержат 100 мл буфера для разведения TR-FRET (PV3574), который рекомендуется для разведения антител, и пептид положительного контроля для антител, если он доступен. Антитела к европию совместимы с флуорофорами, приобретенными у Life Technologies или других поставщиков, включая красители Alexa Fluor 647, Cy3, Cy5 и ULight, но не ограничиваясь ими. Антитела к тербию совместимы с флуоресцеином или GFP.

   Информация для заказа

   Product	Label	Trial Pack	25ug	1mg
   LanthaScreen Eu-anti-DYKDDDDK	Europium	PV6034	PV6026	PV6027
   LanthaScreen Eu-анти-GST	Европий		PV5594	PV5595
   LanthaScreen Eu -anti-His	Europium		PV5596	PV5597
   LanthaScreen Eu-anti-GFP	Europium	A14173	A14190
   LanthaScreen Tb-анти-GST	Тербий		PV3550	PV3551
   LanthaScreen
   LanthaScreen2495	Terbium		PV5863	PV5895
   LanthaScreen Tb-anti-GFP	Terbium		A13391	A13392

   LanthaScreen Secondary Antibodies

   Наши вторичные антивидовые антитела связываются с соответствующими видами IgG с низкими наномолярными кажущимися Kds и проявляют незначительную перекрестную реактивность с другими видами. Эти антитела можно использовать для быстрой разработки анализов, когда антитело против мишени уже доступно. Меченое антивидовое антитело будет связываться с IgG против мишени, завершая пару TR-FRET для упрощения разработки анализа.

   Наши продукты доступны в виде наборов или отдельных антител. Наборы содержат пептид положительного контроля для антитела и 100 мл буфера для разведения TR-FRET (PV3574) в качестве разбавителя для антител во время разработки биохимического анализа.
   

   Информация для заказа

   LanthaScreen Стрептавидин и биотин

   Стрептавидин и антитело к биотину представляют собой реагенты, которые можно использовать для простой маркировки биотинилированных биомолекул хелатом лантанидов для использования в анализах TR-FRET. Хотя хелатный донор может быть непосредственно присоединен к биомолекуле, эти реагенты предлагают средства для быстрого опосредования этой ассоциации.

   Наши продукты доступны в виде наборов или отдельных антител. Пробные наборы содержат 100 мл буфера для разведения TR-FRET (PV3574), который рекомендуется для разбавления, и пептид положительного контроля.

   Информация для заказа

   Product	Label	Trial kit (10ug)	Trial kit (50ug)	50ug Streptavidin only	1mg Streptavidin only
   LanthaScreen Eu-Streptavidin	Europium	PV6030		PV5899	PV6025
   LanthaScreen Tb-Streptavidin	Terbium		PV3965	PV3965	PV3966

    

   9 Пробный набор035555

   Продукт	Этикетка	Trial kit (25ug)	25ug Ab only	1mg Ab only
   LanthaScreen Eu-anti-Biotin	Europium	PV6033		PV5901	PV5900
   Lanthascreen TB-Anti-Biotin	Тербия		PV4749	9245	PV4746
   PV4746
   . Разное Добавить комментарий Отменить ответ Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены * Комментарий * Имя * Email * Сайт Copyright © 2013 - 2019 KS-MOTO +7 (911) 924 3 942 +7 (812) 924 3 942 г. Санкт-Петербург,