Обзор лада xray: Lada XRAY 2021 купить в Москве, комплектации и цены Лада Икс Рей 2020

Содержание

дилер LADA в г. Москва (Москва и МО)

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира с функцией отключения
• Подголовники задних сидений 2 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Автоматическое запирание дверей при начале движения
• Автоматическое включение аварийной сигнализации при экстренном торможении
• Автоматическое отпирание дверей и включение аварийной сигнализации при столкновении
• Иммобилайзер
• Охранная сигнализация
• LED-дневные ходовые огни
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)
• Система электронного контроля устойчивости (ESC) с функцией отключения
• Противобуксовочная система (TCS)
• Система помощи при трогании на подъеме (HSА)
• Защита двигателя и подкапотного пространства

• Бортовой компьютер

• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов
• Заднее сиденье с раскладной спинкой в пропорции 60/40
• Панель приборов. Цвет черный
• Обивка сидений ткань. Цвет черный
• Розетка 12V на центральной консоли

• Усилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Аудиоподготовка

• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота в цвет кузова
• 15» стальные диски
• Колпаки колес декоративные
• Запасное стальное колесо временного использования 15»

• Автоматическое запирание дверей при начале движения
• Автоматическое включение аварийной сигнализации при экстренном торможении
• Автоматическое отпирание дверей и включение аварийной сигнализации при столкновении
• Иммобилайзер
• Охранная сигнализация
• LED-дневные ходовые огни
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)
• Система электронного контроля устойчивости (ESC) с функцией отключения
• Противобуксовочная система (TCS)
• Система помощи при трогании на подъеме (HSА)
• Защита двигателя и подкапотного пространства

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов
• Заднее сиденье с раскладной спинкой в пропорции 60/40
• Панель приборов. Цвет черный
• Обивка сидений ткань. Цвет черный
• Розетка 12V на центральной консоли

• Автоматическое отпирание дверей и включение аварийной сигнализации при столкновении
• Иммобилайзер
• Охранная сигнализация
• LED-дневные ходовые огни
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)
• Система электронного контроля устойчивости (ESC) с функцией отключения
• Противобуксовочная система (TCS)
• Система помощи при трогании на подъеме (HSА)
• Защита двигателя и подкапотного пространства

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов
• Заднее сиденье с раскладной спинкой в пропорции 60/40
• Панель приборов. Цвет черный
• Обивка сидений ткань. Цвет черный
• Противосолнечный козырек пассажира с зеркалом
• Розетка 12V на центральной консоли

• Усилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте

• Сиденье водителя с регулировкой по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Электростеклоподъемники задних дверей
• Подогрев передних сидений
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Кондиционер
• Охлаждаемый вещевой ящик
• Мультифункциональное рулевое колесо
• Аудиосистема (2DIN, FM/AM с функцией RDS, USB, AUX, Bluetooth, Hands free), 4 динамика

• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота в цвет кузова
• Наружные ручки дверей в цвет кузова
• 15» стальные диски
• Колпаки колес декоративные
• Запасное стальное колесо временного использования 15»

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира с функцией отключения
• Подголовники задних сидений 2 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX

• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Автоматическое запирание дверей при начале движения
• Автоматическое включение аварийной сигнализации при экстренном торможении
• Автоматическое отпирание дверей и включение аварийной сигнализации при столкновении
• Иммобилайзер
• Охранная сигнализация
• LED-дневные ходовые огни
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)
• Система электронного контроля устойчивости (ESC) с функцией отключения
• Противобуксовочная система (TCS)
• Система помощи при трогании на подъеме (HSА)
• Защита двигателя и подкапотного пространства

• Противосолнечный козырек пассажира с зеркалом
• Розетка 12V на центральной консоли

• Усилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Усиленная тонировка задних стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Электростеклоподъемники задних дверей
• Подогрев передних сидений
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Обогрев ветрового стекла
• Датчики парковки задние
• Датчики дождя и света
• Климат-контроль
• Охлаждаемый вещевой ящик
• Мультифункциональное рулевое колесо
• Аудиосистема (2DIN, FM/AM с функцией RDS, USB, AUX, Bluetooth, Hands free), 4 динамика

• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота черного цвета

• Наружные ручки дверей в цвет кузова
• 16» легкосплавные диски оригинальные
• Запасное стальное колесо временного использования 15»

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира с функцией отключения
• Подголовники задних сидений 2 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Автоматическое запирание дверей при начале движения
• Автоматическое включение аварийной сигнализации при экстренном торможении
• Автоматическое отпирание дверей и включение аварийной сигнализации при столкновении
• Иммобилайзер
• LED-дневные ходовые огни
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)
• Система электронного контроля устойчивости (ESC) с функцией отключения
• Противобуксовочная система (TCS)
• Система помощи при трогании на подъеме (HSА)

• Защита двигателя и подкапотного пространства

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов
• Заднее сиденье с раскладной спинкой в пропорции 60/40
• Панель приборов. Цвет черный
• Обивка сидений ткань. Цвет черный
• Противосолнечный козырек пассажира с зеркалом
• Розетка 12V на центральной консоли

• Аудиосистема (2DIN, FM/AM с функцией RDS, USB, AUX, Bluetooth, Hands free), 4 динамика

• Система вспомогательного торможения (BAS)
• Система электронного контроля устойчивости (ESC) с функцией отключения
• Противобуксовочная система (TCS)
• Система помощи при трогании на подъеме (HSА)
• Защита двигателя и подкапотного пространства

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов
• Заднее сиденье с раскладной спинкой в пропорции 60/40
• Панель приборов. Цвет черный
• Обивка сидений ткань. Цвет черный
• Противосолнечный козырек пассажира с зеркалом
• Розетка 12V на центральной консоли

• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота черного цвета
• Наружные ручки дверей в цвет кузова
• 16» легкосплавные диски оригинальные
• Запасное стальное колесо временного использования 15»

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира с функцией отключения
• Подголовники задних сидений 3 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Автоматическое запирание дверей при начале движения
• Автоматическое включение аварийной сигнализации при экстренном торможении
• Автоматическое отпирание дверей и включение аварийной сигнализации при столкновении
• Иммобилайзер
• Охранная сигнализация
• LED-дневные ходовые огни
• Противотуманные фары
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)
• Система электронного контроля устойчивости (ESC) с функцией отключения
• Противобуксовочная система (TCS)
• Система помощи при трогании на подъеме (HSА)
• Защита двигателя и подкапотного пространства

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов
• Заднее сиденье с раскладной спинкой в пропорции 60/40
• Панель приборов. Цвет (по выбору) черный/коричневый
• Обивка сидений комбинированная ткань/экокожа. Цвет (по выбору) черный/коричневый
• Противосолнечный козырек пассажира с зеркалом
• Розетка 12V на центральной консоли
• Подсветка мест входа-выхода в передних дверях

• Усилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Электростеклоподъемники задних дверей
• Подогрев передних сидений
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Обогрев ветрового стекла
• Датчики парковки задние
• Датчики дождя и света
• Климат-контроль
• Охлаждаемый вещевой ящик
• Мультифункциональное рулевое колесо
• Аудиосистема (2DIN, FM/AM с функцией RDS, USB, AUX, Bluetooth, Hands free), 4 динамика

• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота в цвет кузова
• Наружные ручки дверей в цвет кузова
• 16» легкосплавные диски
• Запасное стальное колесо временного использования 15»

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира с функцией отключения
• Подголовники задних сидений 3 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Автоматическое запирание дверей при начале движения
• Автоматическое включение аварийной сигнализации при экстренном торможении
• Автоматическое отпирание дверей и включение аварийной сигнализации при столкновении
• Иммобилайзер
• LED-дневные ходовые огни
• Противотуманные фары
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)
• Система электронного контроля устойчивости (ESC) с функцией отключения
• Противобуксовочная система (TCS)
• Система помощи при трогании на подъеме (HSА)
• Защита двигателя и подкапотного пространства

• Усилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Усиленная тонировка задних стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Электростеклоподъемники задних дверей
• Подогрев передних сидений
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Обогрев ветрового стекла
• Датчики парковки задние
• Kамера заднего вида с динамическими линиями
• Датчики дождя и света
• Климат-контроль
• Охлаждаемый вещевой ящик
• Мультифункциональное рулевое колесо
• Мультимедийная система LADA EnjoY Pro с встроенными сервисами Яндекс.Авто (8’’ TFT-IPS ёмкостный HD дисплей, FM, 2 USB, Bluetooth, голосовое управление, Hands Free со сдвоенным микрофоном и функцией шумоподавления, Apple CarPlay, Android Auto), 6 динамиков

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира с функцией отключения
• Подголовники задних сидений 3 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Автоматическое запирание дверей при начале движения
• Автоматическое включение аварийной сигнализации при экстренном торможении
• Автоматическое отпирание дверей и включение аварийной сигнализации при столкновении
• Иммобилайзер
• LED-дневные ходовые огни
• Противотуманные фары
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)
• Система электронного контроля устойчивости (ESC) с функцией отключения
• Противобуксовочная система (TCS)
• Система помощи при трогании на подъеме (HSА)
• Защита двигателя и подкапотного пространства

• Усилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Усиленная тонировка задних стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Электростеклоподъемники задних дверей
• Подогрев передних сидений
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Обогрев ветрового стекла
• Датчики парковки задние
• Kамера заднего вида с динамическими линиями
• Датчики дождя и света
• Климат-контроль
• Охлаждаемый вещевой ящик
• Мультифункциональное рулевое колесо
• Мультимедийная система LADA EnjoY Pro с встроенными сервисами Яндекс.Авто (8’’ TFT-IPS ёмкостный HD дисплей, FM, 2 USB, Bluetooth, голосовое управление, Hands Free со сдвоенным микрофоном и функцией шумоподавления, Apple CarPlay, Android Auto), 6 динамиков

LADA XRAY Cross – загородный тест-драйв

LADA XRAY Cross – загородный тест-драйв — Новости — LADA XRAY Cross – автомобиль спортивный и динамичный. Он отличается от стандартной версии увеличенным клиренсом (215 мм), новыми пружинами и амортизаторами, 17-дюймовыми колёсными дисками, а также контрастным пластиковым обвесом. Колея расширена как спереди (на 19 мм), так и сзади (на 54 мм).

Что касается подвески, то спереди установлены рычаги в виде буквы «L», как у LADA Vesta, а сзади – дисковые тормоза. Приводные валы здесь усилены, а стабилизаторы поперечной устойчивости модернизированы. Уровень вибрации снижен за счёт изменения точки крепления электоромотора к рулевой рейке. При этом сам руль подогревается и регулируется и по углу наклона, и по вылету – от себя/на себя и вверх/вниз.

Багажник LADA XRAY Cross достаточно вместительный. Так называемый подпол подойдёт для небольших вещей, а на боковой стенке есть розетка на 12В. Примечательно, что в комплектацию кроссовера входит полноценное запасное колесо с шиной Pirelli.

Задние кресла в салоне подогреваются, а места для ног здесь больше, чем в обычном XRAY, благодаря оптимизированному положению спинок передних сидений. На передней панели появился контроллер LADA Ride Select в виде шайбы. Он позволяет настраивать режимы работы системы стабилизации. Здесь четыре кнопки – снег, песок, отключение и Sport. Последняя «оживляет» педаль газа.

Как этот кроссовер показывает себя в сложных условиях выяснил пилот команды LADA Sport ROSNEFT Владимир Шешенин. Вместе с LADA XRAY Cross он отправился в село Сосновка самарской области, где расположен полигон ПАО Роснефть.

Автомобиль остро реагирует на руление, поэтому движение легко контролировать. Несмотря на внушительный клиренс LADA XRAY Cross, у водителя отсутствует ощущение высокого центра тяжести, а ход автомобиля плавный, неровности практически не ощущаются.

Внутри установлен двигатель объёмом 1,8 литра, работающий в паре с пятиступенчатой «механикой». Коробка передач обеспечивает быстрое и точное переключение. Машина хорошо реагирует при разгоне и остановке. Система стабилизации отлично корректирует «уводы». Режим Sport, активируемый кнопкой на шайбе LADA Ride Select, задействует несколько систем стабилизации. В результате машина лучше отзывается на нажатие педали газа.

Что можно сказать в итоге? Большой дорожный просвет LADA XRAY Cross весьма актуален для российских дорожных условий, особенно при поездках за город.

Отправляя сообщение, я выражаю свое согласие и разрешаю ПАО «АВТОВАЗ», а также, по их поручению, третьим лицам осуществлять обработку моих персональных данных (фамилия, имя, отчество, год, месяц, дата и место рождения; адрес, номер паспорта и сведения о дате выдачи паспорта и выдавшем его органе; образование, профессия, место работы и должность; домашний, рабочий и мобильный телефоны; адрес электронной почты и другие данные, требуемые для отправки сообщения), включая сбор, систематизацию, накопление, хранение, уточнение, использование, распространение (в том числе трансграничную передачу), обезличивание, уничтожение персональных данных), в целях связанных с возможностью предоставления информации о товарах и услугах, которые потенциально могут представлять интерес, а также в целях сбора и обработки статистической информации и проведения маркетинговых исследований. Согласие на обработку персональных данных в соответствии с указанными выше условиями я предоставляю на 10 (десять) лет. Я уведомлен и согласен с тем, что указанное согласие может быть мной отозвано посредством направления письменного заявления заказным почтовым отправлением с описью вложения, либо вручено лично под подпись.

Тест-драйв Lada Xray Cross. Внедорожник наполовину

Короткие свесы, внушительный клиренс — чем не внедорожник! По крайней мере, внешне Xray Cross создает полную уверенность, что создан не только для асфальта. Хотя полного привода здесь по-прежнему нет. Зато есть система Lada Ride Select, и нам удалось проверить ее на асфальте, бездорожье и в снегу.

Максим Федоров

Lada Xray Cross Цена: от 729 900 р. В продаже: с октября 2018 г.

Пластиковый обвес закреплен на клипсах (в кузовных панелях пробиты отверстия) и для надежности проклеен двусторонним скотчем.

Кто там топил за полный привод? Поставить его — не проблема, ведь в основе «Иксрея» та же платформа B0, что и у «Дастера». Но вы представляете, насколько при этом взлетит цена? А ведь Xray Cross и с передним приводом недешев. Хотя даже за такие деньги новинка АвтоВАЗа выгоднее одноклассников. Конкуренты либо дороже, либо оснащены хуже, а чаще и то, и другое. Не считая обвеса из некрашеного пластика, здесь уже в «базе» есть 17‑дюймовые легкосплавные диски, рейлинги, «двустволка» глушителя из нержавейки, светодиодные ходовые огни, сигнализация с центральным замком и задние дисковые тормоза — они, к слову, здесь от «Весты». Даже шины у новинки не бюджетные: сваренная по спецзаказу АвтоВАЗа всесезонка Continental размерности 215/50R17 шире и выше, чем у Vesta Cross. Она же лежит в багажнике в качестве полноразмерной запаски, причем на оригинальном литом диске.

Контрастные коричневые вставки в салоне можно заменить менее навязчивыми серыми.

Подушка заднего дивана отодвинута к багажнику на 2,5 см — эту доработку, позволившую добавить места для ног, получил и обычный Xray.

Высокопрофильные шины добавили к 195‑миллиметровому дорожному просвету хетчбэка 5 мм, а еще 15 мм удалось выиграть за счет новых пружин и амортизаторов. Причем на обычный «Иксрей» их так просто не поставить — придется менять передние рычаги и ШРУСы. Но делать это настоятельно не рекомендуем, поскольку как поедет такая машина, неизвестно. Ведь шасси Xray Cross настраивалось не только под новую подвеску, но и под новый электрический усилитель руля, поставленный взамен электрогидравлического, который позволил уменьшить передаточное отношение в рейке: от упора до упора руль теперь делает меньше трех оборотов.

— При создании «Кросса» в конструкцию Lada Xray было внедрено 170 новых узлов, а сам перечень изменений еще больше! — Олег Груненков, директор проекта Lada Xray Cross, поехавший с нами в Казахстан на первый тест-драйв новинки, явно гордился проделанной работой.

Действительно, перечень доработок получился большим, и реализовать удалось далеко не все задумки. Так, шумоизоляция хоть и была улучшена, но только на колесных арках и порогах: пескоструй теперь не слышно, но шум мотора и шин спокойно проникает в салон. Хотя на АвтоВАЗе нашу жалобу услышали. А что-то осталось нереализованным в силу конструктивных особенностей модели. Например, как ни старайся, а сделать машину просторнее, не увеличив колесную базу, не получится: и новые передние сиденья с глубокой выемкой под колени, а также отодвинутый ближе к багажнику и немного опущенный вниз задний диван лишь отчасти решили проблему тесноты на заднем ряду. Я с ростом 186 см помещаюсь сам за собой, хотя и без какого-либо запаса в ногах. Зато здесь теперь есть подогрев сидений и разъем USB-зарядки — далеко не в каждой модели более высокого класса встретишь такое.

Багажник — с двойным дном. Под ним полноразмерная запаска на литом диске.

На месте водителя также стало комфортнее: здесь наконец появился центральный подлокотник, а руль получил регулировку по вылету (впервые среди моделей на шасси B0!) и подогрев. Среди других новшеств — подогрев передних сидений с тремя степенями «прожарки», кнопки которого переехали c боковины сиденья на центральную консоль, и теперь понятно, в каком режиме он работает. Здесь же расположены кнопка включения подогрева лобового стекла и главная фишка новинки — регулятор системы Lada Ride Select, благодаря которой «Иксрей» ведет себя совсем по-другому как на дорогах с твердым покрытием, так и на бездорожье.

На крыше появились рейлинги (для их установки пришлось внедрять дополнительный штамп) и «плавник» антенны.

У системы четыре режима работы. Кнопкой Sport меняется скорость отклика на нажатие педали газа, а также немного «распускается» система стабилизации, позволяя поскользить в повороте. Скольжение испытать не удалось, а вот более отзывчивый акселератор здорово помогал как при езде в городе, так и при обгонах на трассе: с ним у мотора 1.8 словно открывалось второе дыхание (сюда бы еще 6‑ю передачу!). Здесь же есть регулятор с пиктограммами, обозначающими режимы «снег» и «песок», хотя первый можно использовать не только в снегу, но и в грязи, а второй — на гравии. Обе программы позволяют имитировать блокировку дифференциала путем подтормаживания ведущих колес и ограничивать вмешательство системы стабилизации. При необходимости стабилизацию можно полностью отключить, но, как и в первых двух случаях, при разгоне выше 58 км/ч система ESC «проснется». Впрочем, потерять управление на скользком покрытии можно и на меньшей скорости, поэтому пользоваться этими режимами нужно аккуратно.

«Давай, давай, родная!» — подбадривал я Lada Xray Cross, полировавшую колесами заснеженный подъем у гостиницы в предгорье Тянь-Шаня. Но вот колеса наконец нашли зацеп, и мы заползли на вершину, хотя я до последнего не верил, что смогу забраться. До этого уже пришлось отступать: при стандартных настройках машина могла забраться лишь до середины подъема, но с активированным режимом «снег» все пошло гораздо веселее. Машина буксовала, но шла! Конечно, Lada Ride Select — это не замена полному приводу, но то, что система расширяет возможности машины и помогает преодолевать сложные участки — факт. В испещренном рытвинами русле высохшей реки, по которому мы проехали до снегопада, проходимость машины ограничивала разве что цеплявшаяся за грунт выступающая «губа» переднего бампера. И тем не менее все равно найдутся скептики, которые скажут, что это очередной «развод» маркетологов. Но АвтоВАЗ никому не навязывает Lada Ride Select — Xray Cross можно взять и без нее.

Жаль только, что производитель не предоставляет возможности выбора двигателя, а 122‑сильный 1.8 отличается повышенным аппетитом не только к бензину (у нас средний расход составил 12,4 литра — это много даже с учетом продолжительных стоянок с заведенным мотором), но и, судя по отзывам владельцев, к маслу. Да и перечень трансмиссий на старте продаж будет ограничен: версия с обновленным «роботом» версии 2.0 появится позднее. Автомат? Вариатор? Нет, не слышали. Впрочем, наш народ этим не напугаешь: судя по статистике продаж других моделей Lada, версию «Кросс» выберет каждый второй покупатель «Иксрея».

Технические характеристики Lada Xray Cross 1.8 MT
Габариты	4171x1810x1645 мм
База	2592 мм
Снаряженная масса	1295 кг
Клиренс	215 мм
Объем багажника	361 л
Объем топливного бака	50 л
Двигатель	бензиновый, 4-цилиндровый, 1800 см³, 122 л. с. при 6050 мин^-1, 170 Нм при 3700 мин^-1
Трансмиссия	5-ступенчатая, привод передний
Размер шин	215/50R17
Динамика	180 км/ч; 10,9 с до 100 км/ч
Расход топлива (город/трасса/смешан.)	9,7/6,3/7,5 л на 100 км
Конкуренты	Hyundai Creta — от 904 900 р., Kia Rio X-Line — от 824 900 р., Renault Duster — от 689 900 р.

Стильный внешний вид, отличная геометрическая проходимость, хорошо настроенное шасси.
Прожорливый мотор, в МКП не хватает 6-й передачи, недостаточная шумоизоляция салона.

Вердикт

«Кросс» — это не просто попытка малой кровью сделать подобие внедорожника из обычного хетчбэка. Для АвтоВАЗа это еще и «работа над ошибками», в которой они постарались учесть отзывы и пожелания владельцев «Иксрея». Правда, большинство этих доработок так и останутся «эксклюзивом» версии Cross и на обычный Xray не попадут.

Редакция рекомендует:

Хочу получать самые интересные статьи

LADA XRAY Cross – Цены и комплектации, обзор, фото – Первый Лада Центр, Краснодар.

1.8 л 16-кл. (122 л.с.), 5МТ / Classic (GAB33-50-XRZ)

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира с функцией отключения
• Подголовники задних сидений 2 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Автоматическое запирание дверей при начале движения
• Автоматическое включение аварийной сигнализации при экстренном торможении
• Автоматическое отпирание дверей и включение аварийной сигнализации при столкновении
• Иммобилайзер
• Охранная сигнализация
• LED-дневные ходовые огни
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Дисковые тормоза задних колес
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)
• Система электронного контроля устойчивости (ESC) с функцией отключения
• Противобуксовочная система (TCS)
• Система помощи при трогании на подъеме (HSА)
• Защита двигателя и подкапотного пространства

• Электроусилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте и по вылету рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Аудиоподготовка

• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота в цвет кузова
• Наружные ручки дверей в цвет кузова
• Рейлинги
• Декоративная насадка выпускной трубы
• 17» легкосплавные диски Proton
• Запасное стальное колесо временного использования 15»

1.8 л 16-кл. (122 л.с.), 5МТ / Classic / Optima (GAB33-50-X01)

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира с функцией отключения
• Подголовники задних сидений 2 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Автоматическое запирание дверей при начале движения
• Автоматическое включение аварийной сигнализации при экстренном торможении
• Автоматическое отпирание дверей и включение аварийной сигнализации при столкновении
• Иммобилайзер
• Охранная сигнализация
• LED-дневные ходовые огни
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Дисковые тормоза задних колес
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)
• Система электронного контроля устойчивости (ESC) с функцией отключения
• Противобуксовочная система (TCS)
• Система помощи при трогании на подъеме (HSА)
• Защита двигателя и подкапотного пространства

1.8 л 16-кл. (122 л.с.), 5МТ / Comfort (GAB33-51-XRZ)

• LADA Ride Select (селектор выбора режима движения)
• Электронная блокировка дифференциала (EDL)

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира с функцией отключения
• Подголовники задних сидений 3 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Автоматическое запирание дверей при начале движения
• Автоматическое включение аварийной сигнализации при экстренном торможении
• Автоматическое отпирание дверей и включение аварийной сигнализации при столкновении
• Иммобилайзер
• Охранная сигнализация
• LED-дневные ходовые огни
• Противотуманные фары
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Дисковые тормоза задних колес
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)
• Система электронного контроля устойчивости (ESC) с функцией отключения
• Противобуксовочная система (TCS)
• Система помощи при трогании на подъеме (HSА)
• Защита двигателя и подкапотного пространства

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов
• Центральный подлокотник с боксом
• Складная спинка переднего пассажирского сиденья
• Заднее сиденье с раскладной спинкой в пропорции 60/40
• Панель приборов. Цвет черный
• Обивка сидений ткань. Цвет черный
• Противосолнечный козырек пассажира с зеркалом
• Футляр для очков
• Розетки 12V на центральной консоли, для задних пассажиров и в багажном отделении
• Выдвижной ящик под сиденьем переднего пассажира
• Двойной пол багажного отделения
• Подсветка мест входа-выхода в передних дверях

• Электроусилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте и по вылету рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Электростеклоподъемники задних дверей
• Подогрев передних сидений 3х уровневый
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Датчики парковки задние
• Кондиционер
• Охлаждаемый вещевой ящик
• Мультифункциональное рулевое колесо
• Аудиосистема (2DIN, FM/AM с функцией RDS, USB, AUX, Bluetooth, Hands free), 4 динамика

1.6 л 16-кл. (113 л.с.), АТ / Classic/ Optima (GAB44-50-XRZ)

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира с функцией отключения
• Подголовники задних сидений 2 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Автоматическое запирание дверей при начале движения
• Автоматическое включение аварийной сигнализации при экстренном торможении
• Автоматическое отпирание дверей и включение аварийной сигнализации при столкновении
• Иммобилайзер
• Охранная сигнализация
• LED-дневные ходовые огни
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Дисковые тормоза задних колес
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)
• Система электронного контроля устойчивости (ESC) с функцией отключения
• Противобуксовочная система (TCS)
• Система помощи при трогании на подъеме (HSА)
• Защита двигателя и подкапотного пространства

1.8 л 16-кл. (122 л.с.), 5МТ / Luxe (GAB33-52-XRZ)

• LADA Ride Select (селектор выбора режима движения)
• Электронная блокировка дифференциала (EDL)

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира с функцией отключения
• Подголовники задних сидений 3 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Автоматическое запирание дверей при начале движения
• Автоматическое включение аварийной сигнализации при экстренном торможении
• Автоматическое отпирание дверей и включение аварийной сигнализации при столкновении
• Иммобилайзер
• Охранная сигнализация
• LED-дневные ходовые огни
• Противотуманные фары с функцией освещения поворота
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Дисковые тормоза задних колес
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)
• Система электронного контроля устойчивости (ESC) с функцией отключения
• Противобуксовочная система (TCS)
• Система помощи при трогании на подъеме (HSА)
• Защита двигателя и подкапотного пространства

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов
• Центральный подлокотник с боксом
• Складная спинка переднего пассажирского сиденья
• Заднее сиденье с раскладной спинкой в пропорции 60/40
• Панель приборов. Цвет (по выбору) оранжевый/черный
• Обивка сидений комбинированная ткань/экокожа. Цвет (по выбору) оранжевый/серый
• Отделка руля и чехла селектора КПП кожей
• Противосолнечный козырек пассажира с зеркалом
• Футляр для очков
• Розетки 12V на центральной консоли, для задних пассажиров и в багажном отделении
• Розетка USB для задних пассажиров
• Выдвижной ящик под сиденьем переднего пассажира
• Двойной пол багажного отделения
• Подсветка мест входа-выхода в передних дверях

• Электроусилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте и по вылету рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Электростеклоподъемники задних дверей
• Подогрев рулевого колеса
• Подогрев передних сидений 3х уровневый
• Подогрев задних сидений
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Обогрев ветрового стекла
• Датчики парковки задние
• Датчики дождя и света
• Климат-контроль
• Охлаждаемый вещевой ящик
• Круиз-контроль и ограничитель скорости
• Мультифункциональное рулевое колесо
• Аудиосистема (2DIN, FM/AM с функцией RDS, USB, AUX, Bluetooth, Hands free), 4 динамика

1.6 л 16-кл. (113 л.с.), АТ / Comfort (GAB44-51-XRZ)

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира с функцией отключения
• Подголовники задних сидений 3 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Автоматическое запирание дверей при начале движения
• Автоматическое включение аварийной сигнализации при экстренном торможении
• Автоматическое отпирание дверей и включение аварийной сигнализации при столкновении
• Иммобилайзер
• Охранная сигнализация
• LED-дневные ходовые огни
• Противотуманные фары
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Дисковые тормоза задних колес
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)
• Система электронного контроля устойчивости (ESC) с функцией отключения
• Противобуксовочная система (TCS)
• Система помощи при трогании на подъеме (HSА)
• Защита двигателя и подкапотного пространства

1.8 л 16-кл. (122 л.с.), 5МТ / Luxe / Prestige (GAB33-52-XU4)

• LADA Ride Select (селектор выбора режима движения)
• Электронная блокировка дифференциала (EDL)

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира с функцией отключения
• Подголовники задних сидений 3 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Автоматическое запирание дверей при начале движения
• Автоматическое включение аварийной сигнализации при экстренном торможении
• Автоматическое отпирание дверей и включение аварийной сигнализации при столкновении
• Иммобилайзер
• Охранная сигнализация
• LED-дневные ходовые огни
• Противотуманные фары с функцией освещения поворота
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Дисковые тормоза задних колес
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)
• Система электронного контроля устойчивости (ESC) с функцией отключения
• Противобуксовочная система (TCS)
• Система помощи при трогании на подъеме (HSА)
• Защита двигателя и подкапотного пространства

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов
• Центральный подлокотник с боксом
• Складная спинка переднего пассажирского сиденья
• Заднее сиденье с раскладной спинкой в пропорции 60/40
• Панель приборов. Цвет (по выбору) оранжевый/черный
• Обивка сидений комбинированная ткань/экокожа. Цвет (по выбору) оранжевый/серый
• Отделка руля и чехла селектора КПП кожей
• Противосолнечный козырек пассажира с зеркалом
• Футляр для очков
• Розетки 12V на центральной консоли, для задних пассажиров и в багажном отделении
• Розетка USB для задних пассажиров
• Выдвижной ящик под сиденьем переднего пассажира
• Двойной пол багажного отделения
• LED-подсветка интерьера
• Подсветка мест входа-выхода в передних дверях

• Электроусилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте и по вылету рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Усиленная тонировка задних стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Электростеклоподъемники задних дверей
• Подогрев рулевого колеса
• Подогрев передних сидений 3х уровневый
• Подогрев задних сидений
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Обогрев ветрового стекла
• Датчики парковки задние
• Камера заднего вида
• Датчики дождя и света
• Климат-контроль
• Охлаждаемый вещевой ящик
• Круиз-контроль и ограничитель скорости
• Мультифункциональное рулевое колесо
• Мультимедийная система с навигацией (7» цветной дисплей с TouchScreen, FM/AM с функцией RDS, USB, AUX, Bluetooth, Hands free), 6 динамиков

1.6 л 16-кл. (113 л.с.), АТ / Luxe (GAB44-52-XRZ)

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира с функцией отключения
• Подголовники задних сидений 3 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Автоматическое запирание дверей при начале движения
• Автоматическое включение аварийной сигнализации при экстренном торможении
• Автоматическое отпирание дверей и включение аварийной сигнализации при столкновении
• Иммобилайзер
• Охранная сигнализация
• LED-дневные ходовые огни
• Противотуманные фары с функцией освещения поворота
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Дисковые тормоза задних колес
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)
• Система электронного контроля устойчивости (ESC) с функцией отключения
• Противобуксовочная система (TCS)
• Система помощи при трогании на подъеме (HSА)
• Защита двигателя и подкапотного пространства

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов
• Центральный подлокотник с боксом
• Складная спинка переднего пассажирского сиденья
• Заднее сиденье с раскладной спинкой в пропорции 60/40
• Панель приборов. Цвет (по выбору) оранжевый/черный
• Обивка сидений комбинированная ткань/экокожа. Цвет (по выбору) оранжевый/серый
• Отделка руля и чехла селектора КПП кожей
• Противосолнечный козырек пассажира с зеркалом
• Футляр для очков
• Розетки 12V на центральной консоли, для задних пассажиров и в багажном отделении
• Розетка USB для задних пассажиров
• Выдвижной ящик под сиденьем переднего пассажира
• Двойной пол багажного отделения
• Подсветка мест входа-выхода в передних дверях

• Электроусилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте и по вылету рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Электростеклоподъемники задних дверей
• Подогрев рулевого колеса
• Подогрев передних сидений 3х уровневый
• Подогрев задних сидений
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Обогрев ветрового стекла
• Датчики парковки задние
• Датчики дождя и света
• Климат-контроль
• Охлаждаемый вещевой ящик
• Круиз-контроль и ограничитель скорости
• Мультифункциональное рулевое колесо
• Аудиосистема (2DIN, FM/AM с функцией RDS, USB, AUX, Bluetooth, Hands free), 4 динамика

1.6 л 16-кл. (113 л.с.), АТ / Luxe / Prestige Connect (GAB44-52-X05)

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира с функцией отключения
• Подголовники задних сидений 3 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Автоматическое запирание дверей при начале движения
• Автоматическое включение аварийной сигнализации при экстренном торможении
• Автоматическое отпирание дверей и включение аварийной сигнализации при столкновении
• Иммобилайзер
• Охранная сигнализация
• LED-дневные ходовые огни
• Противотуманные фары с функцией освещения поворота
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Дисковые тормоза задних колес
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)
• Система электронного контроля устойчивости (ESC) с функцией отключения
• Противобуксовочная система (TCS)
• Система помощи при трогании на подъеме (HSА)
• Защита двигателя и подкапотного пространства

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов
• Центральный подлокотник с боксом
• Складная спинка переднего пассажирского сиденья
• Заднее сиденье с раскладной спинкой в пропорции 60/40
• Панель приборов. Цвет (по выбору) оранжевый/черный
• Обивка сидений комбинированная ткань/экокожа. Цвет (по выбору) оранжевый/серый
• Отделка руля и чехла селектора КПП кожей
• Противосолнечный козырек пассажира с зеркалом
• Футляр для очков
• Розетки 12V на центральной консоли, для задних пассажиров и в багажном отделении
• Розетка USB для задних пассажиров
• Выдвижной ящик под сиденьем переднего пассажира
• Двойной пол багажного отделения
• LED-подсветка интерьера
• Подсветка мест входа-выхода в передних дверях

• Электроусилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте и по вылету рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Усиленная тонировка задних стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Электростеклоподъемники задних дверей
• Подогрев рулевого колеса
• Подогрев передних сидений 3х уровневый
• Подогрев задних сидений
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Обогрев ветрового стекла
• Датчики парковки задние
• Камера заднего вида
• Датчики дождя и света
• Климат-контроль
• Охлаждаемый вещевой ящик
• Круиз-контроль и ограничитель скорости
• Мультифункциональное рулевое колесо
• Мультимедийная система с навигацией (7» цветной дисплей с TouchScreen, FM/AM с функцией RDS, USB, AUX, Bluetooth, Hands free, Android Auto, Apple Car Play), 6 динамиков

Отзывы о вариаторе «Тойота Королла» 🦈 avtoshark.com

Вариативные КПП появились на российском рынке чуть более десяти лет назад. Как все новое, автомобиль, укомплектованный такой коробкой, был принят насторожено. Опробовав трансмиссию в деле, водители стали делиться на форумах своими впечатлениями. «Тойота Королла» вариатор отзывы вызвала неоднозначные: часть пользователей довольна новшеством, другие водители называют коробку «злом».

Какой вариатор стоит на «Тойоте Королле»

Узел поставляет японская компания Aisin, входящая, наряду с Borg-Warner и ZF, в тройку крупнейших мировых производителей комплектующих элементов на авто. Лидерство было достигнуто благодаря высокому качеству исполнения, что в первую очередь отмечают отзывы о вариаторе «Тойота Королла». Надежный аппарат с минимумом проблем устанавливается на машины, предназначенные для пользователей Европы с 2009 года.

За прошедшие годы вариатор на «Тойоту Королла» не претерпел серьезных изменений, а водители научились правильному управлению, диагностике, выявлению редких поломок, ремонту узла.

Устройство и принцип работы вариатора Toyota Corolla

Вариативная КПП выглядит, как картер, в котором уложены валы, соединенные ремнем, муфты, подшипники, манжеты, а также гидроплита.

Главные части вариатора Toyota Corolla – ведущий и ведомый валы, между которыми натянут крепкий полимерный металлический ремень. Из этого следует, что коробка функционирует по принципу клиноременной системы. То есть, при изменении натяжения ремня меняется передаточное число.

Таких изменений бесконечное множество, поэтому коробка не имеет ступеней передачи в привычном понимании, из-за чего носит название бесступенчатой.

Устройство вариатора Toyota Corolla

Работа вариатора на практике выглядит так: водитель нажимает на педаль, специальная фрикционная муфта (гидротрансформатор) приводит в движение ведущий вал. Последний контактирует с двигателем, ремень меняет натяжение и, соответственно, передаточное число, плавно передает измененный крутящий момент на колеса машины. Дифференциал в механизме вариативной КП распределяет крутящий момент между ведущими колесами авто.

Важный элемент коробки – трансмиссионное масло, выполняющие традиционные задачи: оно отводит излишнее тепло от движущихся деталей, облегчает элементам узла трение, предотвращает износ. Там, где присутствует трансмиссионная жидкость, обязательно есть фильтр и магниты, удерживающие металлическую стружку.

Механизм готов «переваривать» высокий крутящий момент, поэтому эксплуатационный ресурс коробок очень высок, с чем не соглашаются отзывы о вариаторе «Тойота Королла». Производитель заявляет сроком службы 200-230 тыс. км пробега, но на практике, пишут владельцы «Королл», это 100 тыс. км.

Виды CVT

Конструктивно коробки выполнены по-разному. Всего существует три вида вариаторов:

Клиноременный. Самый распространенный и простой в обслуживании вариант CVT основан на работе клиновидного ремня, натянутого между конусообразными шкивами. Крутящий момент от двигателя к колесам передается за счет трения, возникающего в месте соединения ремня со шкивами.
Тороидальный. Ведущими и ведомыми в этой конструкции выступают конусовидные диски, которые соединяются между собой роликами. Последние изменяют передаточное число тем, что синхронно перемещаются по изгибам разнонаправленных дисков.
Цепной. В устройстве этого механизма клиновидный ремень заменен стальной цепью.

Клиноременный вариатор

Для работы всех трех модификаций большое значение имеет уровень, давление и температура рабочей жидкости – масла.

На «Короллах» старше 2015 года были установлены вариаторы под серийным номером K311 (30400-2020). Затем коробку модернизировали, присвоили номер К313 (30400-20110) и ею комплектуют современные модели.

Частые неисправности

Закрытая система – вариатор «Короллы» – отличается надежностью. Но агрессивная манера вождения, резкие торможения, плохое масло, длительные поездки на максимальных скоростях приводят к поломкам.

Хруст или свист из коробки при переходе на ручной режим, прерывистое движение, слабый разгон говорят об износе валов, заедании ремня. Также неполадки могут быть в модуле управления, селекторе или электропроводке. Часто проблема с КПП решается заменой масла.

Обслуживание вариатора «Тойоты Короллы»

Оставлять трансмиссию без присмотра нельзя. Профилактический осмотр проводят каждые 20-30 тыс. км на спидометре, даже если нет поводов для беспокойства.

Для диагностики нужно поставить машину на смотровую яму, снять защиту картера (если есть), осмотреть агрегат. Визуальный осмотр может выявить разгерметизацию сальников, течь масла, механическую деформацию.

Диагностика автомобиля

Если обнаружены масляные потеки, трещины в картере, узел демонтируют для детальной диагностики, ремонта с доливкой или заменой масла и фильтра.

Модели с вариатором

На «Тойотах» для внутреннего рынка вариаторы устанавливали с 2000 года – это была модель Toyota Opa с коробкой Aisin K110. Только в 2009 году на европейский рынок попали модели «Тойоты Версо» (Aisin K311) и Toyota Avensis (Aisin K111 для 2-литрового двигателя и Aisin K311 для 1,8-литрового мотора).

Полноприводная Toyota RAV4 получила вариатор серии Aisin K111/K111F (передний/полный привод) в 2010 году и сразу вышла в Европу.

Toyota Corolla комплектуется вариативной КПП марки K313 (модификации K313-04A). Toyota Corolla IM сходит с конвейера с коробкой K313 (модификации K313-06A).

Праворульный седан Toyota Corolla Axio («Аксио) штатно идет с вариатором K311E/F.

Toyota Corolla Axio

Модель и модификация КПП нанесены на таблички, которые можно найти на кузове авто.

Отзывы о ремонте вариатора «Тойоты Короллы»

В 2019-2020 годах «Королла» вышла в новом кузове, вызвав любопытство и интерес потенциальных покупателей. Хорошая или плохая машина, расскажут отзывы о «Тойоте Королле» 2020 года с вариатором:

Отзыв о Toyota Corolla 1.6 с вариатором

Отзыв о Toyota Corolla 1.6 CVT 2020 года

Отзыв о Toyota Corolla 1.6 122hp 2019 г.в.

Ходовые качества и экономичность водители оценили по достоинству. Раздражают мелочи: маркая салонная обивка, неудобные отсеки для предметов, необходимых в дороге.

О чем свидетельствуют отзывы о вариаторе Toyota Corolla:

Отзыв о Toyota Corolla CVT 2013 г.в.

Отзыв о Toyota Corolla 2014 г.в.

Отзыв о Toyota Corolla 2019 г.в.с вариатором

Отзыв о Toyota Corolla 2013 г.в.с вариатором

От пристрастного взгляда автовладельцев «Тойот» на вариаторе не укрылась ни одна мелочь. Из высказываний пользователей напрашивается вывод о следующих сильных сторонах пока новой для россиян коробки:

машина разгоняется быстро и плавно;
мощность силового агрегата используется на 100 %;
коробка надежна в сравнении с «механикой» и автоматом. Нечастые поломки слесари считают следствием некорректной эксплуатации: владельцы не соблюдают предписанные производителем правила;
удобно управлять транспортным средством, когда под ногой всего две педали;
экономия топлива.

Недостатки вариаторов «Короллы»:

дорогой ремонт;
сложно достать запчасти;
мало сервисов по обслуживанию;
повышенный шум.

Российские автомеханики могут починить все. Но японский производитель считает свою коробку настолько надежной, что не выпускает для нее запчастей. Поэтому коробка неремонтопригодна.

Юридические услуги для автовладельцев в Барнауле смотреть онлайн видео от АВТОЮРИСТ.РФ

Юридическая помощь по каршерингу в Барнауле

20 часов назад

Правовой аспект каршеринга Ни в одном российском законодательном акте нет слова «каршеринг», для нормативного регулирования используются разные нормативы. Суть каршеринга — почасовая аренда, подразумевающая, что арендатор несет ответственность за отрицательные последствия, возникающие во время использования чужого транспортного средства. Организация арендодатель практически полностью избавлена от рисков, если текст договора составлен правильно. Юридических проблем несколько: • несоблюдение условий договора; • отсутствие возможности оформить полноценный акт приемки-передачи при возврате машины; • отсутствие точного срока действия договора при необходимости точно зафиксировать момент возврата. Невозможно определить отклонения в состоянии транспортного средства, дефекты, которые при беглом осмотре не видны. Это очень важно, так как в обязанности арендатора не входит ремонт. Арендатор может ориентироваться лишь на закон, определяющий права потребителя и ГК. Подвести каршеринг под них бывает сложно. Преимущества, недостатки, подводные камни каршеринга Смысл почасовой аренды — предоставить клиентам возможность доехать до нужного места и оставить автомобиль. Водителю не нужно беспокоиться о бензине, обслуживании, страховании. Оплата начисляется, базируясь на время использования. Если сравнивать с традиционной арендой, у каршеринга имеются плюсы: • условия более выгодные; • не тратится время на оформление договора; • возможность выбрать любое время пользования, протестировать несколько автомобилей; • возможность оставить в определенном месте без необходимости оплачивать место парковки; • без водителя поездка комфортнее, стоимость ниже. Даже при частом использовании расходы ниже, чем на содержание собственного автомобиля. Минусы почасовой аренды: • если поблизости автомобиля нет, до него нужно идти пешком или добираться другим способом; • требуется время на наружный и внутренний осмотр, желательно с фотофиксацией; • случается, что свободных машин нет; • у автомобиля неопрятный вид; • территория поездок ограничена; • зимой приходится покупать оборудование для очистки; • невозможно завершить поездку, если разрядился телефон; • определенного времени требует заправка, если топливо закончилось; • завершение аренды в мобильном приложении Подводные камни каршеринга: • если перед поездкой не замечены ранее не зафиксированные повреждения, арендодатель может потребовать возмещения затрат на ремонт, невиновность сложно доказать; • при ДТП штраф выплачивает и ущерб возмещает арендатор; • арендодатель может оштрафовать за опасное вождение, отключение трекера, превышение скорости, даже курение. Арендатору нужен автоюрист по каршерингу, он может: • избавить от оплаты штрафа за нарушения и повреждения другого человека; • избавить от списания денег с банковской карты; • избавить от взысканий при ДТП; • разрешить проблему с парковкой в аэропорту, на ж/д вокзале, на закрытой площадке, в месте, не обозначенном в договоре; • уладить проблему, связанную с передачей авто другому человеку, неаккуратным вождением, пропажей вещей, курением, занятиями любовью в салоне. Грамотный автоюрист может оспорить практически любой иск каршеринговой компании. У него всегда найдется совет, позволяющий решить проблему в досудебном или судебном порядке. Это позволит избежать расходов за нарушения, которые совершили другие люди. Если иск уже подан, автоюрист изучит все документы, определит оптимальную линию защиты, примет участие в заседании, в том числе по доверенности. Это сэкономит не только время, но Ваши деньги и нервы. Как избежать штрафов и судебных разбирательств Чтобы не ломать голову над тем, куда обращаться с проблемой по каршерингу, нужно внимательно прочесть полный текст договора, убедиться, что в салоне нет скрытого видеонаблюдения. Тем, кто часто пользуется почасовой арендой автомобилей, можно посоветовать всегда иметь при себе номер телефона надежного автоюриста. Хоть эта услуга удобна в большом городе, необходимо учитывать несовершенство законодательства и подводные камни. Если тщательно осматривать авто, фотографировать повреждения, не нарушать условия договора, при ДТП сразу вызывать сотрудников ГИБДД, услуги автоюриста по кашерингу потребуются не слишком часто. Если автовладелец использовал автомобиль по договору каршеринга и после этого получил иск, то нужно незамедлительно обратиться на бесплатную консультацию к автоюристу, показать иск, который бесплатно будет изучен вместе с договором каршеринга, буден дано бесплатное юридическое заключение и как показывает практика в большинстве случаев Вам помогут решить спор с каршеринговой компанией. Обратиться можно в компанию Автоюрист.рф в любом городе России. #автоюристрф

Автозапчасти со всего мира в каждом городе Казахстана

У нас можно купить товары (более 70 млн наименований) в следующих точках обслуживания:

У нас можно купить товары (более 70 млн наименований) следующих производителей:
3F Quality, 3M, 3ton, 4 Seasons, 4max, 4U, 555, 76, 888, 8888, A-Gist, a.b.a. automotive, A2502, A470, AAM, Abesta, Abro, ABS, Absaar, AC207, Acar, ACCENT, ACDelco, Acemark, Achim, ACHR, Acme, Acura, AD, Addax-Q, Addinol, Admal, ADR, Adriauto, Advics, AE, AEngineering, AFA, AGA, Agama, AGC, AIKO, Air Spencer, Airline, Airplex, Airtech, Airtex, Airtex (Spain), AIRTEX (Дубликат), AIS Driving, Aisan, Aisin, Ajusa, Akebono, Akesai, Akitaka, Akrado, Akste, Akyoto, AL-KO, Alaska, Alca, Alca & Heyner (Germa, Alcasta, ALCO, ALCO (Germany), Alco Filters, Alfa Car, ALFeco, Alkar, Alle Model, Allied Nippon, AlliedFram, AlliedSignal, Allmakes 4×4, ALNSU, ALPHA FILTER, AMC, AMC Filter, AMC Filter (Japan), AMD, American, Amiwa, AMP, Amtel, Anchor, Andtech, AP, API, APlus, Applus, APR, Aquapel, Arctic Cat, Arirang, ARN, Arnott, ARS, ArvinMeritor, Asahi, Asam-SA, Ashika, Ashika (Italy), Asimco, Asin, Asmet, ASSO, ASVA, AT, ATE, Atek, Atiho, ATL, Atlant, Atlas, ATP, ATS, Audi, Audi VW, Audi,VW, Auger, Autlog, Auto Elite, Auto-GUR, Auto-Hak, AutoAttex, Autofren, Autolite, Automega, Automotive Lighting, AUTOMOTOR France, Autopartner, AUTOPLUS, Autoprofi, autoSFEC, Autosol, Autostar, AutoTechteile, Autowelt, AV Autotechnik, AVA, AVA (Netherlands), Avantech, AVM, AVS, Avtobrake, Avtos, AVVAuto, AWB, Aywi, Azard, BALAPAN, Baldwin Filters, Baltex, Bando, Bando (Japan), BANDO/Superstar, Banner, Bantaj, Bapmic, Bardahl, Bardahl Oil, Bardahl автохимия, BASBUG, Bautler, BAW, BCA, Bearmach, Begel, Behr, Behr (Germany), Bendix, Benson, Beral, Berger, BergKraft, Berkut, Berry, BERU, Beru (Germany), Beser, Besf1ts, BestGear, Better Brake Parts, BETTER BREAKE PARTS, BF Germany, BF Goodrich, BG Trade, BGF, BIG, BIG Filter, Bilstein, Bilstein (Germany), BIO, BJS, Blackbelt, Blacktech, Blue line, Blue Print, BLUE_PRINT, BM, BMW, BMW , BMW Б/У, BN, BO, BodyParts, Boge, BOGE амортизаторы, Bolk, Boratex, Borg & Beck, BorgWarner, Borsehung, Bort, Bosal, Bosch, Bosch (Germany), BOSCH Аккумуляторы, BPW, Bramax, BRAND, Breckner, Bremax, Brembo, Bremi, Bridgestone, Brisk, Britpart, Brodit, BRP, BRP Brake System, Bugus, BURGE, BURGE England, BW, BYD, CA Plastic, Ca-Re, CABLEs, Cada, Caffaro, Camelion, Camellia, CAN, Capat, Capauto, CAR-DEX, Cardone, Carex, Carglass Премиум, CARGO, CarGo (Denmark), CARLine, Carlson, Carmate, Casp, Castrol, CB-T38, CEI, Centric, Century, CERATO, Cevam, CF, CHALLENGE, Challenge (U.K.), Challenge (UK-China), Champion, Champion (Belgium), Champion (USA), Chassis Pro, Checkstar, CHEKSTAR, Cherry, Chery, Chevrolet, China, CHINA TY, CHO, Chrysler, Chuhatsu, Cifam, Ciguenales Sanz, CL-N24L, CL-N24R, CLEAN, Clean Filter, ClearLight, Clevite, CNC, Cnlyu, Cob-Web, Cobra, Cobra Tuning, Cofle, Cojali, Comfort, Concord, Concord (USA), CONI-SEAL, Continental, Contitech, CoolStream, Cordiant, Corteco, Covind, Craft Bearings, Croldino, Crown, Cryomax, CS Germany, CSHX, CTR, CTR, CTR (Korea), CTR (Korea), CTR/555, CT , Cummins, CX, CZD Bearings, Daewha, Daewoo, DAF, DAfmi, Daihatsu, DANA, Darwin Plus, Dashi, Dasis, Datsun, Dayco, Dayco (Italy), Dayco (USA | Italy), DBA, DEA Products Inc, Delco Remy, Dello, Delphi, Delta, Delta Autotechnik, Denckermann (Герм.), Denckermann, Denki, Denso, Denso (Japan), DENSO (Дубликат), Denzel, Depo, Depo (Taiwan), Deutz, Dexel, Dextrim, Diamond, Diesel Technic, DIFA, Dinex, Direct Parts, Dixie electric, DJB, DL Autogruppe, DLAA, DLZ, DNJ, DoctorWax, Dodge, Dokuro, Dollex, DOLZ, Dominant, Donaldson, DoneDeal, Dong Feng, Dongil, Doohap, Doowon, Dorman, DP Group, DPA, DPH, DPI Bearings, DPIA Colaert, Dragon, Dreik, DSI, DT Spare Parts, DT-DIESEL TECHNIC AG, DTP, DTW Premium, DUBL, DUBLICATE, DUCEILLER, Dunlop, DUPL, DY, DYF, Dynamax, Dynamax-Korea, E-Power, E.Co, E.CO (Italy), E.Sassone, EA Group, EAA-Joints, Eagle, EAGLE EYE, Eagle Eyes, EAI, EAS, EAS Ultimate, Eberspecher, EBS, Ecoline, Edex, EEP, EGR, EGT, EIKO, Eikosha, Ekofil, Eksin, Elastogran, ELF, Elfull, Elring, Elring (Germany), Elwis Royal, Embo, Emmerre, Emmetec, EMPI, ENA, Eneos, Engi, EPS, ERA, Ergon, Eristic, ERLING, Ersus, ERT, Espra, ESSO, ESTAS, ETG, EUROBUMP, EuroCar, EuroCar (MB), EuroFlex, Europart, EUROPURE, Europure, Europure (TOYOTA), Europure (TY), EUROPURE TY, Euroricambi, Eurospare, EVA Innova, EVO, Evo Formance, Ex-Trim, Exedy, F.B.L. (Japan), F.B.L.(Japan), FA1, Facet, Facet (Italy), Facom, FAE, FAG, FARET, Fast Tiger, FAW, FBJ, FBK, FBL, Febest, FEBEST ( Дубликат), Febest (Germany), FEBI, Febi (Germany), FEBI BILSTEIN, FED, Federal Mogul, Feituo, Fel-Pro, Felix, Fenno Steel, Fenox, Ferodo, Ferroz, Fiat, Fiat / Alfa / Lancia, FIC, Fico Pro, Fill Inn, Filter A.G., Filter Master, Filtron, Finord, Finwhale, FIRAD, FKC, FLAG, Flamma, Fleet Guard, Flennor, Flennor (Germany), Flennor(Герм.), Florimex, Flosser, FlyRiver, FMK, Fobos, Fomar, Force, Forcetech, Ford, Ford , Formika, Formpart, Forstex, FORTECH, Fortech, FortLuft, Fortune Line, Foton, Fouette, FPI, FRAM, FranceCar, Fras-Le, Freccia, Fremax, Frenkit, Frenotruck, Fri.Tech., FrictionMaster, Frig Air, Frixa, FTE, FU JU (China), Fujimoto, FUSO, Futaba, G.U.D, Gabriel, Gallant, Garrett, Gates, Gates (USA), Gazpromneft, GB, Gbrake, GBS, GE Parts, Geely, Gelorad, General Motors, General Ricambi, General Technologies, Gennor, Genon, Gerat, GERAT Original, GFS, Ghibaudi, Gieffe, Girling, Gistorne, GKN, GKN (Germany), Glaser, GLEIDSTART, GLO, Global Autoparts, GLOBELT, Globelt, Glyco, GM, GMB, GMB/NPW, GMC, Goetze, Goetze (Germany), Good Year, Good Year (USA), Goodwill, GoodWill (UK), Gordon, GP, GP Group, GP-German Parts, Gparts, GPD, GR, GRAF, Graf (Italy), Grand Prix, Grass, GREAT, Great Wall, Group 7, GSP, GSParts, GT, GT Oil, GTR, Guide Win, Gunk, Hafei, Haituo, Haldex, HAN, Hankook, Hans Pries, Hans Pries & Topran, Hanse, HASAKI, HASAKI ( Дубликат), HC-Cargo, HC-CarGo (Denmark), HC-Parts, HCC, HD-Parts, HDE, HDK, Hebel Kraft, Heiwa, Hella, Hengda, Hengst, Hengst (Germany), Henko, Henko (China), Henko parts, Henshel, Hepu, Hermann, Herth+Buss, Herts Berg, Herzog, Hexen, Heyner, Hi-Gear, HI-Q, HI-TEC, HifloFiltro, Hillport, Hino, HKT, Hobi, Hoettecke, Hola, Hola(Голландия), Honda, Honda , Honda Moto, HorseWinch, Howo, HQ, HSB, HSB Hong Sung Brake, HSCBRG, HU, Huco, Huenersdorff, Hummer, Hutchinson, HYANDAI/KIA, HYNDAI/KIA, Hyundai, Hyundai / KIA, HYUNDAI /KIA, Hyundai Glovis, HYUNDAI/KIA, Icer, IceTiger, Idemitsu, iFree, IKA, ILJIN, ILJIN (Ю.КОРЕЯ), Imiola, Impergom, Impress, IMS, INA, Infiniti, Intermotor, InterParts, IPD, ISAM, Isuzu, Iveco, Iwis, Izumi, J-ROCK, JAB, Jaguar, JAKOPARTS, JanMor, Japan Cars, JapanParts, Japanparts (Italy), JapKo, Jeep, Jeep , Jesse Lai, JFBK, JH, JH (Jin Heung), JHF, JIC, Jikiu, JMC, JML, JNBK, JNBK Corp, JNBK/AIKO, Johns, Jonnesway, Jorden, Jost, Jovis, JP Group, JP Group (Denmark), js, JS Asakashi, JTC, Jurid, Just Drive, Just Drive | JD (Jap, K&K, K&N, KA, Kamaz, Kamoka, Kangaroo, KAP, Kashiyama, Kawasaki, KAYABA, Kayaba (Japan), Kayaba | KYB (Japan), Kayba, KBC, KD, KG, KGC, KI, KIA, KIA/HYUNDAI, Kibi, Kilen, King, Kitto, Kixx, KKK, Klakson, Klarius, Klaxcar, Klokkerholm, KMK Glass, Knecht, KNECHT FILTER, Knorr-Bremse, KO, Koito, Koivunen, Kolbenschmidt, KOLBENSCHMIDT Filter, Kolbenschmidt | KS (, Koni, Konstein, Kookil, Kooshesh Radiator, Korfel, Kortex, KOS, KOY, Koyo, Koyo, Koyorad, KP, KraftTech, Kramme, Krauf, Kraz, Kroner, Kroner(Германия), Kross, KS, KS-MSI, KSP, Kujiwa, Kumho, KYB, KYB, Kyosan, L.Locker, Lada, Land Rover, Lautrette, Lavr, Lavr Next, LCA, Leader Plus, Leart, LegeArtis, Lema, Lemfoerder (LMI) (Ge, Lemforder, Lemforder (Germany), Lesjofors, LEX, Lexus, Lexus , LFW, LGR, LGR OEM, Libao, Lincoln, Linex, Liqui Moly, LMI, LN, Lockheed, Logem, Long, Longho, LPB (China), LPR, Luber Finer, LUCAS / TRW, Lucid, LUK, Lukoil, LUX, Luxe, Luzar, LXParts, LYNX, LYNXauto, M Filter, M-Filter, M.MARELLI, M2, Mabitek, Magneti Marelli, Mahle, Mahle / Knecht, Maine Coon, MAK, Malo, MAN, Mando, Mann, MANN FILTER, Mann+Hummel GMBH, Mann+HummelGMBH, MANN-FILTER, Mannol, Manover, Mansons, Mapco, Markon, Marshall, Maruichi, Maruichi 156, MASIMA (Дубликат), Master Power, Master Sport, MasterSport(Герм.), Masuma, Matador, Matrix, Maxicar, Maxpart, Mazda, Mazda , MB, MC, MCB, Meat & Doria, MEAT&DORIA, Mec-Diesel, Mecafilter, MecArm, Mekra Lang, Mercedes Benz, Mercedes-Benz, Mercedes-Benz , MeshMSK, Messmer, Metalcaucho, Metelli, Mevotech, Meyle, Meyle (Germany), MFilter, Miba, Michelin, Micro, Miles, Mintex, Mio, MitSubaruishi, Mitsubishi, Mitsubishi , Mitsuboshi, MITWELL, Miyaco, MMC, MMCDUBL, Mobil, Mobiletron, Mobis, Monark, Monroe, Monroe (Belgium), Monroe (USA), Moog, Mopar, Moroso, Mothers, Motodor, MotoRad, Motorcraft, Motorherz, Motorpro, Motul, MR Universal, MRK, MS, MSG, MTF, MTF Light, MTM, MTP, MTP Kebono, Multitruck, Murato, Musashi, MV Parts, MX, MZ, N-Rocky, NAC, Nachi, Nakamoto, Nakayama, NAP, Narva, National, ND, NDC, NDK, NDM, NE, Neapco, Neko mechanics, Neolux, Neolux (brand by Osr, NETOP, NEW, New-Era, Newsun, NG, NGK, NGK (Japan), NHK, Niagara, NIBK, Nichirin, Niles, Ningbo, Nipparts, NIS, NISS, NISSA, Nissan, Nissan , Nissanдубликат, Nissens, Nisshinbo, Nissin, NK, NK (Germany), NKN, NMB, Noble, NOK, Nokian, Nord Yada, Norden, Nordglass, Nordic, Norplast, Novatech, Novline, NPA, NPR, NPR Europe (ex SM) (, NPW, NRF, NS, NSK, NSO, NT, NTN, NTN / SNR, NTP, Nural, NZ, O.E.Brand, OBK, OCAP, OE Germany, OEM, OHNO, Ombra, OMC Brakes, Omsa Line, Onnuri, Ootoko, Opel, Optibelt, Optibelt (Germany), Optimal, Optimal (Germany), Oran, Orex, ORIGINAL, Original Birth, Original Spare Parts, Original | General M, Original | Mitsubish, Original | Nissan, Original | Toyota, Original-C, ORIPARTS, Orjin Automotive, Osaka, OSK, OSM, Osram, Osram (Germany), Ossca, Overmax, OZ, P.M.C., Paco, Pagid, Palisad, PANDAparts, Paraut, ParkCity, Parkvision, PARTS MASTER, Parts-Mall, Partsprofe, Patron, Payen, Payen (England), PE, Pekar, Pennzoil, PENTIUS, PENTIUS-USA, Pentosin, Perfect, Permatex, Persea, Petro-Canada, Peugeot, Peugeot / Citroen, PEX, Phantom, Philips, Phira, Pierburg, Pilenga, Pilkington, Pingo, Pirelli, PitWork, PMA TOOLS, PO-MAX, Polarg, Polaris, Polcar, Polmostrow, Pontiac, Porsche, Power Springs, Prasco, Precision, Premium Parts, Pressgom, Prestige, Pro.Sport, Professional Parts, PROFIT, Protex, Pulo, Purflux, Purolator, QH, QML, Qsten, Quartz, Quattro Freni, Quick Brake, Quinton Hazell, R2A, R8, Ram , Rameder, Rancho, Raon Auto, RAP, Rapro, Raumerk, Ravenol, Raybestos, RB, RBI, RBI (Thailand), RBI (Thailand), RC, RCL Radiators, Record France, RedMark, Reikanen, REINZ, Remsa, Renault, Renault Trucks, Replay, Repuesto, Rezaw-Plast, Rial, Rib-Top, Riginal, RIK, Riken, RIMA, Rival, RIW, Road House (Spain), Road House | RH (Spa, RoadHouse, RoadHouse | RH (Spai, Robusto, Rocky, Roers Parts, Rolltec, Rosava, Rostar, Rosteco, Roulunds, Rover, Royal Auto Parts, RTS, RUEI, Run Hui, Russtal, Ruville, Rytson, S&K, Saab, Saab , Sachs, Sachs (Germany), SACHS сцепление, Sacura-Cars, SAF-Holland, Sailing, SAINT-GOBAIN SEKURIT, Sakura, Sakura (Indonesia), SAKURA/JS ASAKASHI, Saleri SIL, SAM, Samko, Sampa, Samsung, Samsung Brake, Sanfineco, SANGSIN, Sangsin Brake, Sankei, Sanwa Gasket, SAP, Sapfire, Sapfire Professional, Sardes, Sasic, SAT, Sata, Satori, Sava, SB, SBK, SBS, Scania, ScanTech, Schigerd, Schmaco, Schmitz, Schnieder, Schomaecker, Schwitzer, SCT, SCT Germany, SE-M, Sealed Power, Seat, SECO, Seijiku, Seiken, Seiken (Japan), SEINSA (под заказ), Seinsa Autofren, Seintex, Seiwa, Sensen, Serva (Glaser), Sfec(E.U.), SG, SGM, SH Auto Parts, Shacman, Shankit, Shell, Sheriff, Shibato, ShifAS, Shimahide, Shin Han, SHIN HWA, shinhwa, Shinkai, Shinko, SHO-ME, SibТэк, Sidem, SIEMENS VDO, Signeda, SIM, Simer (Italy), Simyi, Sinolar, Sintec, Sivento, SK, SKF, Skoda, Skybear, SkyLine, Skyway, SL, Slitkoff, SM, Smart, Smartbrake, SNR, Sofima, SOFT99, Solido, Sonar, Sonax, Sotra 3D, Souvenir, Sparco, Spart, Sparta, Spartech, Spicer, Spicer Drive, Spidan, SS, SS20, SsangYong, Stabilus, Standard, Stanley, Stant, Starke, Starmann, Steinhof, Stellox, Stels, Step Up, Stone, SU, SUB, Subaru, Subaru , Sumitomo, SUN, Sun (Japan), Sun Auto, Super Help, Suplex, Sure Filter, Suzuki, Suzuki , Suzuki moto, SV, SVS, SWAG, SWAG OIL, SWAG моторное масло, SWF, SZ, T7, Tadashisa, TAI, Taiho, TAIWAN, Takoma, TAM, Tama, TangDe, Tayen, TCIC, Tech line, Tech-as, Technik, Tecneco Filters, Teikin, TEKNOROT, TEKNOROTREF#, Templin, Tenacity, Termal, Teroson, Tesla, Tesla Technics, TESLA(Чехия), Texaco, Texet, Textar, Tezuka, TGC, THG, THO, Thule, Tigar, Timken, TIMKEN (Дубликат), Timmen, TJB, TK, TKE, Tokico, Tokico (Japan), Tomex, Tong yang, TONII, TOP, Top Drive, TOP FILS, TopFils, Toptul, Tora, Torch (China), Tork, Torque, Totachi, Total, Towai, TOWAI (Thailand), TOY, Toya, TOYD, Toyo, toyoda, TOYOGuard, TOYOPOWER, Toyota, Toyota, Toyota , TOYOTA (China), TOYOTA (inside Japan, Toyota (оригинал), Toyota / Lexus, Toyota Forklift, TOYOTA(Original), Toyotaдубликат, TP, TPD, Transmaster, Transpo, Transtar, TRC, Trialli, Tricape, Trico, Trifa (Germany), Triscan, Truck Tec, Trucktec, Trucktec(Герм.), TruckTechnic, TrustAuto, Trusting, TRW, TRW Lucas, TSK, TSN, TTT-auto, Tucker Rocky, Tunga, TURK, Tutela, TW, TY, TYC, TYG, TYOTA, Tzer Li, UAC, UAZ, UFI, UkorAuto, UNI-BRAKES, Unicorn, Union, Unipoint, United Motors, URO Parts, URW, USM, UTM, Vaden, VAG, VAG/AUDI, Vaico, VAICO-VEMO, Valeo, VALEO PHC, Van Wezel, Varta, Varta (Germany), VDO, Vema, Vemo, Verfasser, Verke, Vernet, Vettler, VFM-Bosal, VIC, Vichura, Victor, Victor Reinz, Victor Reinz (German, View max, Vika, Viking Auto Parts, Viktor Reinz, VIP tuning, Vipp, Vite, VK Technology, VMPAuto, Volkswagen, Volton, Volvo, Volvo Trucks, VOLVO(FORD), VOLVO/FORD, VPM, Vstar, VT52, VTR, Vtulka.ru, VW-AUDI, Wabco, Wagner, Wahler, Wahler (Germany), WAI, Walbro, Walker, WAZAK, WD-40, Weber, Ween, Wells, Westar, Westfalia, Weweler, wf, Willson, Winbo, WIX, Wix Filters, WJB, Woking, Wonjin, WOSM, WP, Wuhua, Wunder, Wurth, WXQP, Wynn’s, X2, X5 Resource, Xado, Xenum, Xin Tian, XJL, XLBrake, XYG, Y.C.C., YAC, Yamaha, Yato, YEC, Yeni As Metal, Yenmak, YES-Q, Yih Sheng, Yokki, Yokohama, yoto, Yuilfilter, Yuliant, Yulim, Zaffo, Zekkert, ZEN, ZeTeX, Zetra, Zeus, Zexel, ZF, ZF Parts, Zhongxing, ZIC, Zikmar, Zimmermann, ZM, ZNP, ZX shock, ZZVF, , Авар, АВС-Дизайн, АвтоБРОНЯ, Автоглушитель, АвтоОдеяло, Автопласт, Автоприбор, АвтоЩИТ, Агатэк, Аксессуары, Астера, БЗА, Богдан, БРТ, Веха-НН, ВТН, ГАЗ, ДААЗ, Дело Техники, ДМЗ, ЗАЗ, ЗИЛ, ЗМЗ, Ижорский глушитель, КЗАЭ, КИК, китай, Ковригин, ЛиАЗ, Ливны, МАЗ, Маяк, Мицубиси, Начало, Невский фильтр, Нет износа, Ниссан (Inside Japan, НТЦ МСП, ОАТ, ОйлРайт, Освар, ПАЗ, ПенActiv, Петропласт, Печатная продукция, Полиуретан, Прамо, Разное, рамка под номер, Рекардо, РК ТОР, Роснефть, Русская Артель, Русский стандарт, СTR, СибрТех, Смартмат, СТ, СтартВольт, Т 102, Т 133, ТагАз, Тайвань, Тойота, Тойота (inside Japan, Тойота (outside Japa, Точка Опоры, Трейлер, Триада, ТСП, ТСС, Турбо Инжиниринг, УМЗ, ФИЛЬТРАдубликат, Формула Света, Форсаж, Фортуна, Шериф, ЭластоМаг, Элкар, ЯЗДА, ЯМЗ, Яртиз,

Флуоресцентный резонансный перенос энергии — обзор

5.2 Анализ флуоресцентного резонансного переноса энергии

Флуоресцентный резонансный перенос энергии (FRET) — это процесс электронной передачи энергии между двумя флуорофорами (т. Е. Флуорофором-донором и флуорофором-акцептором), приводящий к изменению излучаемого света, который часто используется в чувствительных флуоресцентных детекторах. Предпосылкой для выполнения FRET является то, что спектр излучения донора должен перекрываться со спектром поглощения акцептора.Таким образом, выбранный донорный флуорофор ограничивает выбор акцепторного флуорофора. Еще одним условием FRET является то, что расстояние между донором и акцептором должно быть меньше 10 нм [85]. Таким образом, реакция системы FRET очень чувствительна к образованию и дезорганизации сэндвич-структуры между донором и акцептором. Здесь мы классифицируем систему FRET на два подкласса по разным акцепторам. Первый подкласс — это система FRET с флуорофорами в качестве акцепторов, такими как органические красители, квантовые точки и т. Д., Которые отображают спектр поглощения, согласованный с излучением донора, и передают поглощенную энергию излучению с другой длиной волны.Во втором подклассе акцептором является гаситель флуоресценции, который может поглощать и передавать энергию, поглощенную донорами, в тепло или другую энергию, но без испускания фотонов. Такой акцептор снижает интенсивность излучения, даже приводя к полному тушению флуоресценции. В этих случаях золотые наноматериалы, углеродные нанотрубки и листы графена всегда играют роль тушителей.

Благодаря своим широким и настраиваемым спектрам поглощения и высоким квантовым выходам квантовые точки и органические красители часто используются в качестве акцепторов в системах обнаружения FRET первого подкласса.Например, для обнаружения мальтозы была разработана эффективная система FRET на основе КТ и меченного красителем аналога сахара [86]. В этом исследовании в качестве доноров использовались нанокристаллы CdSe – ZnS ядро-оболочка, конъюгированные с мальтозосвязывающим белком (MBP) через координацию сродства к металлу. Два типа акцепторов были использованы для образования двух различных сенсорных систем FRET, соответственно, обозначенных как β-циклодекстрин-QSY9 и β-циклодекстрин-Cy3.5. После связывания домена β-циклодекстрина с MBP хвостатый QSY9 способен подавлять эмиссию КТ, рис.11.12A. Добавление мальтозы высвободит β-циклодекстрин-QSY9 за счет конкурентного связывания, что приведет к восстановлению флуоресценции. Аналогично, в случае β-циклодекстрина-Cy3.5, Cy3 служит мостом для передачи энергии от квантовых точек к Cy3.5, что приводит к красной эмиссии, рис. 11.12B. Эта изящная конструкция использует двухступенчатый механизм FRET для реализации FRET на большие расстояния. Кроме того, аналогичная система FRET применяется для обнаружения тринитротолуола с высокой специфичностью в водной среде [87].

Рисунок 11.12. Иммуноанализ первого подкласса флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET).

(A) датчики 560QD-MBP и (B) 530QD-MBP-Cy3-β-CD-Cy3.5 FRET. (C) Доноры люминола и акцептор квантовых точек на основе резонансного переноса энергии хемилюминесценции [86,88].

FRET — мощный инструмент для определения крошечного изменения расстояния между донорными и акцепторными флуорофорами или сворачивания конформации белка в событиях связывания. Однако, как и другие флуоресцентные технологии, традиционный FRET также страдает от фотообесцвечивания и автофлуоресценции.Поэтому разработана новая стратегия резонансного переноса энергии между хемилюминесцентным флуорофором и квантовыми точками, называемая резонансным переносом энергии хемилюминесценции (CRET). По сравнению с FRET, появление CRET легко запускается из-за окисления подложки люминесценции, вместо того, чтобы нуждаться в лазере возбуждения. Например, реакция люминол / H ₂ O ₂ CL, катализируемая HRP, может быть выбрана для образования чувствительной CRET-системы с квантовыми точками [88]. Как показано на рис.11.12C, QD, модифицированные BSA, могут быстро взаимодействовать с HRP, связанной с антителом BSA (анти-BSA), где происходит CRET. В этой стратегии HRP в качестве катализатора напрямую комбинируется с квантовыми точками, которые могут непрерывно катализировать испускание донора CL (т.е. люминола), в конечном итоге достигая эффективного CRET. Однако CRET требует дополнительного количества H ₂ O ₂, что усложняет реакционную систему, увеличивает рабочие процессы и чувствительно к условиям окружающей среды. Кроме того, выброс квантовых точек можно было подавить высокой концентрацией H ₂ O ₂.

Во втором подклассе системы FRET чаще всего используются наноматериалы Au, такие как наночастицы Au и наностержни Au. Предполагается, что наноматериалы Au обладают высокой эффективностью тушения флуоресценции и относительно большим эффективным расстоянием [89]. Во-первых, разница в размерах между крупными донорами наноматериалов Au и молекулярными акцепторами повышает эффективность ЭТ от донорно-акцепторных пар с увеличением расстояния. Во-вторых, их сечения поглощения и рассеяния света удивительно велики, обычно на несколько порядков больше, чем у обычных красителей [90], что значительно усиливает их поглощение до передаваемой энергии.Кроме того, нет необходимости в ориентации донора для продолжения ET, когда сферические наночастицы Au используются в качестве акцепторов. Как следствие, на основе наноматериалов Au разработаны многие системы обнаружения FRET для проведения чувствительных и точных обнаружений [89,91]. Например, чувствительный и совместимый флуоресцентно-активируемый зонд на основе AuNP был предложен для сверхчувствительного обнаружения PSA в сыворотке крови пациентов (рис. 11.13A). В этой конструкции AuNP обладают высокой эффективностью загрузки органических красителей, которые могут полностью высвобождаться тиолсодержащим цистеамином.Таким образом, система детектирования FRET реализовала сверхвысокую чувствительность 0,032 пг / мл для ПСА, что в 2 раза меньше, чем у традиционного детектирования флуоресценции [92]. Однако анализ, проводимый в микротитровальных планшетах, требует разделения сыворотки / плазмы при обнаружении цельной крови и повторных процессов промывки, чтобы избежать флуоресцентного фона и неспецифической абсорбции, которые являются трудозатратными и требуют много времени.

Рисунок 11.13. Иммуноанализы с резонансным переносом энергии флуоресценции (FRET) с использованием наночастиц золота в качестве гасителя.

(A) Представление активируемых наночастиц красителя и золота (AuNP) FRET иммуноанализа на простатоспецифический антиген. (B) Одностадийный иммуноферментный анализ UCNPs-AuNPs FRET на IgG козы [92,93].

Затем разработана одностадийная система FRET на твердой подложке in situ с повышающим преобразованием и AuNP для прямого обнаружения цельной крови [93]. Как показано на рис. 11.13B, UCNP предварительно внедряют на предметное стекло, а AuNP, модифицированные с помощью IgG, конъюгированы с UCNP перед обнаружением. При смешивании с образцом аналита козий IgG, присутствующий в образцах, будет конкурентно связываться с UCNP и вынудить AuNP отключиться, что приведет к восстановлению флуоресценции UCNP по мере увеличения концентрации анализируемого вещества.Аналогичная система UCNPs-AuNPs FRET также применяется для обнаружения сверхчувствительных бактерий с использованием аптамеров вместо антител в качестве лигандов распознавания на поверхности наночастиц [91].

В отличие от нульмерных AuNP, графеноподобные наноразмерные двумерные наноматериалы (например, графен, оксид графена [GO], MoS ₂, SnS ₂, WS ₂) обладают большим поперечным сечением, два -размерное распределение нарушений и случайная ориентация активных центров, которые использовались в системах FRET с невероятно увеличивающейся скоростью, рис.11.14. В предыдущем отчете был разработан иммуноферментный анализ FRET на основе наноразмерного графена и КТ CdTe для точного обнаружения гликопротеина AFP для диагностики гепатоцеллюлярной карциномы [94]. В этой системе присутствие целевого AFP может вызвать создание конъюгатов QD / AFP / нанографен и снизить интенсивность флуоресценции квантовых точек, в результате чего достигается эффективность тушения 66% ± 4% и предел обнаружения 0,15 нг / мл. Что еще более важно, авторы обнаружили, что система на основе нанографена и квантовых точек превысила предел расстояний традиционных систем FRET.Они получили эффективное расстояние FRET приблизительно 22,3 нм по сравнению с максимумом 10 нм в традиционных системах FRET; высокая гибкость и случайное расположение двумерных графеновых нанолистов способствуют их перекрытию с квантовыми точками для образования различных эффективных конфигураций квантовых точек-графен. Нанолист GO был использован вместе с пептидом SNAP-25, модифицированным зеленым флуоресцентным белком, для создания сверхчувствительного биосенсора FRET [95]. В этом биосенсоре восстановление интенсивности флуоресценции показало линейную зависимость с логарифмической концентрацией целевых нейротоксинов ботулина (BoNT) в широком диапазоне обнаружения от 1 фг / мл до 1 пг / мл.Более того, новый биосенсор FRET не только может определять концентрацию целевого аналита, но также может оценивать протеазную активность BoNT-LcA. Примечательно, что именно протеазная активность целевого BoNT-LcA привносит в детекцию эффект амплификации и способствует сверхвысокой чувствительности. Впоследствии графеновые квантовые точки (GQD) с функционализацией амином были использованы в качестве доноров в датчике FRET с графеновым нанолистом в качестве акцепторов для обнаружения сердечного приступа [96]. Сердечный тропонин I (cTnI) является золотым стандартом для диагностики инфаркта миокарда (ИМ), что обуславливает его высокую специфичность для определения ИМ.Однако референсный предел концентрации cTnI в клиниках довольно низок и составляет 0,04 нг / мл, что создает проблемы для традиционных методов обнаружения. Здесь система FRET GQDs-графен справилась с этой задачей, реализовав очень низкий предел обнаружения 0,192 пг / мл и сверхширокий диапазон обнаружения, шесть порядков величины для целевой концентрации аналита от 1 до 10 ⁶ пг / мл.

Рисунок 11.14. Иммуноанализы с резонансным переносом энергии флуоресценции (FRET) с использованием 2D-графена в качестве гасителя.

(A) Иммуносенсор FRET на основе оксида графена для обнаружения патогенов и белков. Безызлучательный перенос энергии (NRET) от полупроводниковых квантовых точек к соседним двумерным листам (B) MoS ₂ или (C) SnS ₂ однослойной и малослойной толщины [98–100].

Обычно используемые флуорофоры FRET способствуют коллапсу неупорядоченного белка.

Значение

Белки принимают неупорядоченные ансамбли до сворачивания, а иногда и как часть своей функции.Моделирование и исследования FRET часто описывают неупорядоченные конформации как более компактные, чем состояния случайных клубков, наблюдаемые при высоком денатуранте, тогда как малоугловое рассеяние рентгеновских лучей (SAXS) указывает, что эти конформации остаются расширенными. Устранение этого несоответствия улучшает наше понимание свойств белков, например, является ли вода достаточно плохим растворителем, чтобы вызвать неспецифический коллапс. Мы достигаем согласования, показывая, что добавление флуорофоров FRET уменьшает размеры неупорядоченного белка.Детальный анализ FRET и SAXS, наряду с учетом сокращения, индуцированного флуорофором, демонстрирует, что неупорядоченные и развернутые белки часто остаются сольватированными и расширенными без денатуранта, свойства, которые минимизируют неправильную укладку и агрегацию.

Abstract

Размеры, которые развернутые белки, включая внутренне неупорядоченные белки (IDP), принимают в отсутствие денатуранта, остаются спорными. Мы разработали процедуру анализа профилей малоуглового рассеяния рентгеновских лучей (SAXS) и использовали ее, чтобы продемонстрировать, что даже относительно гидрофобные IDP остаются почти такими же расширенными в воде, как и при высоких концентрациях денатуранта.Напротив, как показано здесь, большинство измерений резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET) показали, что относительно гидрофобные IDP значительно сокращаются в отсутствие денатуранта. Мы используем два независимых подхода для дальнейшего изучения этого противоречия. Во-первых, с помощью SAXS мы показываем, что флуорофоры, используемые в FRET, могут вносить вклад в наблюдаемое несоответствие. В частности, мы обнаружили, что добавление Alexa-488 к нормально расширенному IDP вызывает сокращение еще на 15%, что вполне соответствует сокращению, о котором сообщалось в исследованиях на основе FRET.Во-вторых, используя нашу процедуру моделирования и анализа для точного извлечения радиуса инерции (R _g) и расстояния от конца до конца (R _ee) из профилей SAXS, мы проверили недавнее предположение, что результаты FRET и SAXS могут можно согласовать, если R _g и R _ee являются «несвязанными» (т. е. больше не просто пропорциональными), в отличие от случая с гомополимерами случайного блуждания. Однако мы обнаружили, что даже для развернутых белков эти две меры измерений развернутого состояния остаются пропорциональными.Вместе эти результаты предполагают, что улучшенные процедуры анализа и коррекция значительных взаимодействий, управляемых флуорофором, достаточны для согласования предыдущих исследований SAXS и FRET, обеспечивая тем самым единую картину природы развернутых полипептидных цепей в отсутствие денатурирующего агента.

Белковые нарушения являются важным компонентом разнообразных клеточных процессов (1-4). В отличие от хорошо свернутых белков, которые населяют четко определенное функциональное состояние, развернутые и внутренне неупорядоченные белки (IDP) образуют широкий набор быстро взаимопревращающихся конформаций (3⇓⇓⇓⇓ – 8) с ошибками, которые плохо изучены и трудно измерить. .Особый интерес представляет степень, в которой ВПЛ заключают контракты в физиологических условиях (т. Е. В отсутствие денатурирующих агентов). Такое сокращение будет иметь широкое значение для нашего понимания сворачивания белков, взаимодействий и стабильности, а также действия денатурирующих веществ. Более того, понимание степени сжатия неупорядоченных ансамблей имеет огромное значение для разработки реалистичных симуляций складчатости и интерпретации измерений малоуглового рентгеновского рассеяния (SAXS) и FRET (9, 10).

Наше понимание физико-химических принципов, лежащих в основе того, будет ли полипептидная цепь складываться, принимать неупорядоченный, но, тем не менее, относительно компактный ансамбль или вести себя как расширенное, полностью сольватированное, самоизбегающее случайное блуждание (SARW), недостаточно для объяснения существующих данных. Большая часть этого понимания получена из исследований белков, разворачиваемых высокими концентрациями денатурирующих веществ, таких как мочевина и гидрохлорид гуанидина (Gdn). В этих условиях все согласны с тем, что белки ведут себя как SARW с показателем Флори (ν), равным 0.60 в соотношении R _г ∝ N ^ν (N = длина цепи). Напротив, нет единого мнения относительно поведения ВПЛ при более низком уровне денатуранта или его отсутствии. В частности, в то время как многочисленные FRET (11⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓ – 25) и вычислительные исследования (11, 14, 18, 23, 26⇓⇓ – 29) утверждали, что расширенный неупорядоченный ансамбль обнаруживает при высоком значении денатуранта сжимается значительно [обычно 25–50% при переходе к низкому денатуранту или без него (ν <0,5)] (11, 14, 18, 23, 26⇓ – 28, 30⇓⇓⇓⇓ – 35), аналогичное число исследований SAXS сообщают о незначительном сокращении или его отсутствии при тех же условиях (10, 36–41).

Разнообразные недавние исследования пытались примирить это несоответствие (Fig. 1 A ), которое имеет глубокие последствия для физики сворачивания белков. Применение более реалистичных симуляций и аналитических моделей привело к полученным FRET расстояниям, имеющим меньшую денатурантную зависимость (Рис. 1 A , Bottom ) (40, 42⇓ – 44). Параллельно улучшены данные и анализ SAXS, включая использование безразмерного графика Кратки, чтобы подчеркнуть изменения ν, а не R _г (что важно, поскольку добавление флуорофоров на концах цепи увеличит R _г из-за их массы), также свидетельствовали о незначительном сокращении ниже 2 M Gdn (рис.1 A , снизу ) (45, 46). Тем не менее, значительные расхождения сохраняются и в отсутствие денатуранта, даже когда одни и те же подходы используются для анализа одного и того же белка в идентичных условиях (рис. 1, SI, приложение , рис. S1 и S2, и Movie S1). Недавние исследования показали, что это несоответствие может быть устранено с помощью целостного анализа (42, 43), подчеркивая разделение между обычно фиксированной, пропорциональной зависимостью между R _g (определено из измерений SAXS) и R _ee (определено из Измерения FRET) без необходимости вызывать возмущение из-за присутствия флуорофоров (42).

Рис. 1.

Улучшенные процедуры анализа не устраняют расхождения между измерениями IDP, полученными с помощью SAXS и FRET. ( A ) Данные R17 SAXS и FRET (из ссылки 43). ( A , Top ) Сравнение результатов, полученных при подборе данных FRET в предположении гауссовой цепи и данных SAXS с использованием приближения Гинье. ( A , Bottom ) Данные SAXS и FRET подходят с использованием нашего метода анализа MFF и аналогичного подхода (45). Черная линия лучше всего подходит гиперболической линии тренда; серые линии — 95% доверительные интервалы.( B ) Профили SAXS для R17 ( слева, , данные из ссылки 43) и N98 ( справа, , данные из ссылки 42), согласованные с MFF, значительно отличаются от ожидаемого поведения с использованием значений ν, взятых из аналогичный анализ данных FRET. Сплошные линии обозначают область, используемую в процедуре подгонки; пунктирные линии представляют экстраполяцию к более высоким значениям q. Хотя подходило ~ 500 точек на кривую рассеяния (серый цвет), большинство показанных данных были объединены только для целей презентации (черные точки).Повороты или перегибы данных при более высоких значениях qR _g, скорее всего, связаны с ошибками при вычитании буфера, что является более сложным при высоком q, низкой концентрации образца и / или сниженном контрасте рассеяния (например, при высоком денатуранте, см. Материалы и методы ). ( C ) Тенденции гидрофобности (Kyte – Doolittle) в зависимости от ν в отсутствие денатуранта, полученного из SAXS, путем применения MFF к опубликованным данным, собранным из последовательностей складываемых белков (42, 45, 67⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓ № – 82).Также показаны результаты исследований FRET, рассчитанные как в исх. 20 для опубликованных данных (20, 42). Красная линия тренда для данных FRET из исх. 20. Черная линия тренда лучше всего соответствует показанным результатам SAXS. ( C , Top ) Гистограмма гидрофобности репрезентативных белков в PDB (набор данных из ссылки 45). ( D ) Кумулятивные распределения ν для репрезентативных белков из PDB, выведенные из линий тренда, показанных в C .

Чтобы всесторонне сравнить результаты исследований SAXS и FRET, мы собрали опубликованные наборы данных для множества ВПЛ (рис.1 C и D и SI Приложение , Таблица S3). При анализе с использованием нашего моделирования и молекулярного форм-фактора (MFF) исследования SAXS неизменно находят ν> 0,53 (среднее значение = 0,55), тогда как ν, полученное из исследований FRET, обычно падает ниже 0,50 (среднее значение = 0,46). Это расхождение 0,09 является существенным по отношению ко всему диапазону ν, который варьируется только от 0,6 (для SARW) до 0,5 (где внутрицепочечные взаимодействия одинаково благоприятны для взаимодействий растворитель-цепь) до 0,33 (для уплотнения в сферу; несколько выше для несферических компактных состояний).В целом результаты SAXS предполагают, что конформационные ансамбли большинства развернутых белков и IDP с белковоподобным составом последовательностей сильно расширены (ν> 0,5) и вода является хорошим растворителем, тогда как FRET предполагает иное (рис. 1 D ). ).

Приведенные выше и другие результаты привели нас и других к поиску факторов, которые могут способствовать постоянному несоответствию между представлениями измерений IDP на основе SAXS и FRET (9, 29, 39, 42, 43, 47⇓⇓ – 50 ). Одна альтернатива, обозначенная здесь «гипотеза разделения гетерополимера», утверждает, что гетерополимерная природа белков приводит к изменению во взаимосвязи между R _g и R _ee, взаимосвязь, которая является фиксированной (т.е.е., независимо от длины цепи) в соотношении 6,3 для гомополимера SARW. Недавнее моделирование показывает, что это соотношение не может быть зафиксировано для развернутых белков, которые более сложны, чем гомополимеры (29, 39, 42, 43). Эта «развязка» предлагает возможное объяснение несоответствия между SAXS (который чувствителен к R _g) и FRET (который чувствителен к R _ee). Напротив, вторая гипотеза, обозначенная здесь «гипотеза взаимодействия флуорофора», предполагает, что в отсутствие денатуранта флуорофоры FRET взаимодействуют друг с другом и / или с полипептидной цепью, вызывая конформационный ансамбль конструкций, модифицированных флуорофором, к сокращаются больше, чем в отсутствие этих флуорофоров (9, 45, 47, 50, 51).

Здесь мы обращаемся как к гипотезе разделения, так и к гипотезе флуорофорного взаимодействия. Мы использовали SAXS, чтобы охарактеризовать радиус вращения IDP до и после добавления обычно используемого флуорофора. Мы обнаружили, что такая модификация флуорофора изменяет конформационный ансамбль в отсутствие денатуранта, уменьшая его размеры, измеренные методом SAXS, на 10–20%. В сочетании с улучшенными процедурами анализа с использованием реалистичных смоделированных ансамблей как для SAXS, так и для FRET, этого индуцированного флуорофором коллапса достаточно для согласования результатов исследований SAXS и FRET.Параллельно с этим мы представляем измерения SAXS на полиэтиленгликоле (PEG), подтверждающие предыдущие сообщения о том, что добавление флуорофоров также вызывает сжатие этого полимера SARW (9), открытие, которое недавно было подвергнуто сомнению (42). Кроме того, мы показываем, что SAXS может извлекать R _g, ν и R _ee с точностью выше 97% при анализе с использованием нового MFF, разработанного для гетерополимеров. Эти симуляции достаточно точны для воспроизведения данных рассеяния без необходимости выбора только подансамбля конформаций, как это обычно используется в других процедурах подбора данных.Наконец, мы демонстрируем степень, в которой можно использовать небольшие отклонения от идеальности в данных SAXS, чтобы сделать вывод о смещениях внутри гетерополимерного конформационного ансамбля.

Результаты

Маркировка флуорофором вызывает коллапс.

Чтобы напрямую проверить гипотезу взаимодействия флуорофора, мы измерили профили SAXS немодифицированного IDP и того же самого IDP, сайт-специфически модифицированного одной или двумя копиями обычно используемого флуорофора FRET Alexa-488. Мы выбрали этот флуорофор, потому что он относительно небольшой и гидрофильный, что снижает вероятность образования взаимодействий, которые могут изменить развернутый ансамбль, по сравнению с большинством других флуорофоров FRET (43).В качестве тестового белка мы использовали PNt, IDP с хорошим поведением, содержащий 334 аминоконцевых остатка пертактина (52). Для получения PNt, модифицированного моно- и двойным флуорофором, мы использовали тиол-реактивный Alexa-488 для модификации остатков цистеина в положении 117 (PNtC-Alexa488) или положениях 29 и 117 (PNtCC-Alexa488). В качестве контроля мы использовали немодифицированный родительский белок (PNt) и алкилирование для получения конструкций без флуорофоров (PNtC-Alkd и PNtCC-Alkd).

Добавление Alexa-488 снижает размеры PNt, измеренные методом SAXS, как в отсутствие Gdm, так и при промежуточных концентрациях (рис.2 A и SI Приложение , Таблица S1). В частности, при переходе от 4 к 0 M Gdn, R _g и ν уменьшаются почти вдвое больше для модифицированного флуорофором PNtCC-Alexa488, чем для PNtCC-Alkd или PNt (рис.2 B и SI Приложение ). , Таблица S1). Эти данные указывают на то, что присутствие Alexa-488 приводит к сокращению конформационного ансамбля PNt. Следует отметить, что в то время как 2 M Gdn является хорошим растворителем (ν> 0,50) для немеченого белка, мечение флуорофором приводит к измеримым внутримолекулярным взаимодействиям даже при этой относительно высокой концентрации денатуранта (рис.2 B , Правый ). В соответствии с общим происхождением эффекта, величина этого зависящего от денатуранта расширения качественно аналогична наблюдаемой FRET для множества других белков (Fig. 1 B ) (42, 43). Мы также наблюдали зависимое от флуорофора снижение среднего R _g и ν для конструкции с одной меткой PNtC-Alexa488 (рис. 2), что указывает на то, что, помимо предполагаемых взаимодействий флуорофор-флуорофор, взаимодействия флуорофор-белок также вносят вклад в наблюдаемое сокращение.

Рис. 2.

Добавление Alexa-488 изменяет разброс PNt. ( A ) Безразмерные графики Кратки для PNt дикого типа (серый), PNtCC-алкилированного (черный), PNtC-Alexa488 (одиночная метка, синий) и PNtCC-Alexa488 (двойная метка, красный) в 0,15 M KCl, 2 M Gdn и 4 M Gdn. Планки погрешностей представляют собой распространенную ошибку из SD, рассчитанного с учетом статистики подсчета (Пуассона), где σ = √counts. Данные были подогнаны и отображены в соответствии с процедурой, описанной на рис. 1 (см. Также Материалы и методы ).Результаты для алкилированного PNt неотличимы от PNt дикого типа, но есть значительные различия для PNt, меченного флуорофором Alexa-488. ( B ) R _g и ν как функция концентрации Gdn. Данные серых кривых из исх. 45.

Следует отметить, что это сокращение происходит, несмотря на установившиеся значения анизотропии флуоресценции для PNtCC-Alexa488, равные 0,11 и 0,08 в 0 и 2 M денатуранте, соответственно ( SI Приложение , Таблица S2), ниже порогового значения, которое обычно рассматривается в качестве доказательства. свободного вращения прикрепленных к белкам флуорофоров (42, 53).Из этих результатов мы заключаем, что добавление даже одного из более мелких, более гидрофильных флуорофоров, обычно используемых для измерений FRET, может значительно уменьшить размеры неупорядоченной полипептидной цепи (42, 43, 53), наблюдение, которое помогает согласовать SAXS – FRET несоответствие.

Размеры ПЭГ, полученные методом SAXS, не зависят от концентрации полимера.

В более раннем исследовании мы сообщили, что добавление Alexa-488/594 к PEG приводило к денатурант-зависимому изменению FRET (9), аналогичному тому, которое наблюдается в развернутых белках.Однако сжатия не наблюдалось, когда эквивалентный немеченый полимер исследовали с помощью малоуглового рассеяния нейтронов. Было высказано предположение, что высокие (3 мМ) концентрации ПЭГ, использованные в этом исследовании рассеяния, маскируют то, что в противном случае было бы зависимым от денатуранта изменением в R _g (42). Чтобы проверить это, мы измерили профили SAXS в диапазоне концентраций ПЭГ и денатуранта и не обнаружили никаких доказательств значительного изменения размеров этого высокогидрофильного полимера (рис.3). Аналогичным образом, во всех условиях мы наблюдали показатель Флори, равный 0,60, что дополнительно подтверждает, что ПЭГ ведет себя как SARW независимо от концентрации денатуранта. Эффекты флуорофора, а не сокращение цепи, таким образом, остаются простейшей интерпретацией денатурант-зависимых изменений FRET, ранее наблюдавшихся для меченных флуорофором вариантов этого полимера (9).

Рис. 3. Профили

SAXS ПЭГ не зависят от денатуранта. ( A ) Безразмерные графики Кратки для ПЭГ 24 кДа при 0.5 мМ и 0,05 мМ в 0,15 M KCl, 2 M Gdn и 4 M Gdn. Нормализованный профиль рассеяния PEG 24 кДа не изменяется от 0 до 4 M Gdn в широком диапазоне концентраций PEG. Для ясности профили рассеяния смещены по вертикали. Данные были подогнаны и отображены с использованием процедуры, описанной на фиг. 1. ( B ) R _g и ν как функции концентрации Gdn для 0,5 мМ и 0,05 мМ PEG. Открытые и закрытые точки смещены по горизонтали для ясности.

Проверка гипотезы о разделении гетерополимеров.

Взятые вместе, вышеупомянутые наблюдения показывают, что флуорофоры, добавленные к IDP, приводят к значительному сокращению, что способствует различным выводам, сделанным из предыдущих исследований SAXS и FRET. Эти наблюдения, однако, не исключают возможность того, что, как утверждалось ранее (42), разделение гетерополимера (то есть соотношение между R _ee и R _g, отклоняющееся от фиксированной пропорциональности, наблюдаемой для гомополимеров) также может вносить свой вклад. к расхождению SAXS – FRET.

Чтобы исследовать, приводит ли конформационный ансамбль реалистичного гетерополимера к значительной непропорциональности между R _ee и R _g, мы использовали Upside, наши модели Cβ-уровня (54, 55), чтобы смоделировать рассеяние для развернутых ансамблей. 50 белков из 250–650 остатков, случайно выбранных из банка данных по белкам (PDB). В своей простейшей версии Upside представляет собой каркас полипептида с шестью атомами на остаток (N, Cα, C, H, O и Cβ) и использует зависимые от соседей карты Рамачандрана, полученные из библиотеки катушек (56).Такие модели способны воспроизводить R _g и NH остаточные диполярные связи (RDC), наблюдаемые в развернутых белках; эти два параметра чувствительны к глобальным и локальным свойствам магистрали соответственно (57, 58). Для создания ансамблей гетерополимеров мы отнесли каждый Cβ как гидрофобный, так и полярный (H / P). Благоприятные профили взаимодействия (форма, показанная в ссылке 45, SI Приложение , рис. S3 A ) вводятся только между атомами Cβ гидрофобных остатков, а самопереключение распространяется на все атомы.Для каждой из 50 последовательностей мы использовали 30 различных сил взаимодействия Cβ. После создания этих 1500 ансамблей H / P конформаций скелета мы добавили явные боковые цепи (59), а затем рассчитали профили рассеяния гидратированных версий белков (60).

Для этих 1500 ансамблей мы сравнили истинные значения R _g, ν и R _ee, рассчитанные непосредственно из атомных координат, со значениями, полученными путем аппроксимации моделированного рассеяния (с добавлением реалистичных случайных ошибок) с использованием нашего оригинального MFF, разработанного для гомополимеров (45).Как и в случае гомополимеров, мы находим, что значения R _ee и R _g, наблюдаемые в этих моделях, пропорциональны (т. Е. Остаются связанными) с коэффициентом корреляции R ² = 0,99 (рис. 4 А ). Затем мы подбираем смоделированные профили рассеяния, чтобы определить R _g ^fit, ν ^fit и R _ee ^fit, причем последнее получено с использованием соотношения (R _ee / R _g) ² = G (ν), где G (ν) была откалибрована с использованием нашего исходного моделирования гомополимеров ( SI Приложение , рис.S1 D ). Мы обнаружили среднее абсолютное отклонение всего 1,3 Å, 0,011 и 4,2 Å соответственно, что представляет собой среднюю абсолютную ошибку 3%, 2% и 4% для R _g, ν и R _ee ( SI Приложение , рис. S3). Наибольшие отклонения наблюдаются для более компактных конструкций; для более протяженных конформаций (ν> 0,54) ошибка составляет ∼2%. Корреляция R _g ^fit и R _ee ^fit осталась высокой, R ²> 0.99.

Рис. 4.

Моделирование обнаруживает сильную связь между R _g и R _ee, а профили SAXS являются надежным показателем R _g, ν и R _ee, а также дают информацию о степени неоднородности. ( A ) Связывание между R _g и R _ee, полученное из смоделированных ансамблей с использованием модели H / P (черный) или нашего потенциала, используемого для сворачивания белков (красный). ( B — D ) Сравнение R _g, ν и R _ee, рассчитанных на основе координат смоделированных ансамблей, со значениями, полученными при подгонке с нашим MFF _het (R _g, ν) к SAXS профили ансамблей со случайно добавленными экспериментальными ошибками.( E ) Отклонения в ν _концов наблюдаются для гетерополимеров с менее хорошо смешанными H / P-образцами (полученными путем аппроксимации наклона зависимости внутрицепочечного расстояния R _{| i — j |} от разделение последовательностей, | i — j |, где | i — j |> N / 2). ( F ) Влияние Δν _end при различных значениях ν. ( G ) Подгонка экспериментальных данных к MFF (R _g, ν, Δν _конец) демонстрирует, что мечение флуорофора и образование петли через дисульфидные связи в PNt вызывает значительные и измеримые отклонения.

Чтобы еще больше уменьшить небольшую ошибку, связанную с применением нашего MFF, полученного из гомополимеров, для рассеивания гетерополимеров, мы создали новый молекулярный форм-фактор, MFF _het, используя моделирование H / P, описанное выше, и ту же общую процедуру. как описано в исх. 45. Применение этого слегка модифицированного MFF _het снижает ошибки в подогнанных R _g, ν и R _ee до 0,5 Å, 0,005 и 2,7 Å, соответственно, что составляет 1%, 1% и 2% среднего значения. абсолютная погрешность (рис.4 B — D ). Эти результаты демонстрируют, что наша процедура анализа на основе MFF возвращает точные значения для R _g и R _ee, которые остаются пропорциональными (т. Е. Связанными) даже для гетерополимеров.

Далее мы рассмотрели вопрос о том, чувствительны ли наши выводы к деталям нашей модели или энергетической функции. Чтобы проверить это, мы провели дополнительное моделирование с использованием более подробной версии алгоритма Upside, который способен сворачивать de novo белки с <100 остатками (54, 55).В этой версии каждая из 20 боковых цепей представлена многопозиционным эксцентриковым валиком, который позволяет детально упаковать сердечник. Энергетическая функция включает водородные связи, взаимодействия боковая цепь-боковая цепь и боковая цепь-основная цепь, аминокислотно-зависимые потенциалы двугранного угла и член десольватации. Используя эту модель, мы сгенерировали 30 ансамблей для каждого из шести белков (PNt и пять других белков, случайно выбранных из 50, описанных выше), используя короткие симуляции, которые выбирают только развернутое состояние.Мы получили ансамбли, выполнив моделирование обмена репликами в диапазоне температур от 280 до 320 К, как описано ранее (54, 55). Значения ν, полученные из этих ансамблей, находились в диапазоне от 0,4 до 0,6 в зависимости от температуры моделирования. Примечательно, что значения R _ee, R _g и ν, полученные непосредственно из этих более реалистичных ансамблей, находятся в хорошем согласии со значениями, определенными после подгонки с нашим MFF _het, с почти такой же точностью, что и для более простого H / P-ансамбли (рис.4 A — C , красные точки). Кроме того, непосредственно вычисленные значения для R _g и R _ee для ансамблей остаются пропорциональными с коэффициентом корреляции R ² = 0,99. Следовательно, наш вывод, что R _g и R _ee остаются связанными даже для гетерополимеров, устойчив к деталям нашего моделирования.

Измерение отклонений от идеальности в гетерополимерах.

MFF _het точно отражает общие размеры неупорядоченных гетерополимеров для белковоподобных последовательностей H / P и может использоваться в большинстве случаев.Тем не менее, небольшие, но измеримые отклонения наблюдаются для белков в нашем тестовом наборе с менее хорошо смешанными паттернами H / P ( SI Приложение , рис. S4). Эти различия можно увидеть на графике распределения внутримолекулярных расстояний, где наклон на расстояниях разделения | i — j | > N / 2 может отличаться от среднего наклона, который определяет глобальное значение ν (рис. 4 D ). Определим изменение наклона как Δν _конец (рис. 4 D ). Отрицательные значения Δν _end коррелируют с преобладанием гидрофобных остатков на концах полипептидной последовательности (рис.4 D и SI Приложение , Рис. S4 C ) и с отклонениями в G (ν) ( SI Приложение , Рис. S4 A ) ( R ² ∼ 0.84). Профиль МУРР наиболее чувствителен к Δν _end при низком qR _g (Рис. 4 E ).

Для количественной оценки неидеальности гетерополимеров на основе данных SAXS мы создали более общий трехпараметрический форм-фактор, MFF _general (R _g, ν, Δν _end) (рис.4 E и F и Movie S2). Чтобы продемонстрировать его способность давать полезную информацию, мы подобрали данные из PNt, PNtCC-Alexa488 и циркулярного (с дисульфидными связями) PNtCC при 2 M Gdn (рис. 4 F ). Δν _конец уменьшается с ∼0 для PNt примерно до -0,1 для PNtCC-Alexa488 и примерно до -0,2 для кольцевых PNtCC, что согласуется с увеличением взаимодействий на аминоконце цепи. Менее резкие возмущения, такие как менее хорошо смешанные паттерны H / P и более короткие аминокислотные последовательности с более низким полезным диапазоном qR _g, могут потребовать более высокого отношения сигнал / шум для измерения Δν _end.Тем не менее, эти данные демонстрируют потенциал SAXS для выявления для неупорядоченных полимеров зависимых от последовательности отклонений от поведения гомополимера (рис.4 E и F ), при этом все еще точно измеряя R _g и ν (рис. А — С ).

В пределе бесконечной длины цепи масштабный показатель Флори ν имеет значения 0,33, 0,50 и 0,60, соответствующие глобулам, случайным блужданиям и SARW, соответственно. Тем не менее, мы и другие придерживаемся прагматического подхода и позволяем ν принимать промежуточные значения; е.g., как получено из наклона графиков масштабирования R _g в зависимости от длины цепи или R _ij в зависимости от | i — j | ( SI Приложение , рис. S6). В поддержку этого подхода можно наблюдать при увеличении силы внутрицепочечного взаимодействия уменьшение как I (q) при высоком q, так и наклона графиков масштабирования для белков из 100-1000 остатков (Fig. 4). Соответственно, мы считаем, что использование значений ν, выходящих за рамки трех канонических значений, обеспечивает законный и практичный подход для сравнения качества растворителей для систем разного размера и классификации, является ли вода хорошим или плохим растворителем для полимеров конечной длины.

Обсуждение

В то время как измерения SAXS указывают на то, что вода является хорошим растворителем (ν> 0,5) для развернутых полипептидов, исследования на основе FRET обычно сообщают об обратном (ν <0,5). Однако мы обнаруживаем, что сочетание улучшенных процедур анализа и более тщательного рассмотрения взаимодействий флуорофор-флуорофор и / или флуорофор-цепь достаточно для объяснения этого несоответствия. Эти находки приводят к единой картине, в которой развернутое состояние белков представляет собой SARW при высоком денатуранте и сжимается лишь незначительно (намного меньше, чем ранее сообщалось в литературе FRET) в отсутствие денатуранта.В частности, мы обнаружили, что мечение с помощью Alexa-488, широко используемого флуорофора FRET, может изменить конформационный ансамбль IDP, уменьшая R _g и ν даже при низкой анизотропии флуоресценции относительно принятых пределов для свободного вращения флуорофора ( 42, 53). В сочетании с предыдущими исследованиями (9) аналогичные выводы можно сделать для PEG, известного SARW. Эти результаты, наряду с нашим предыдущим результатом о том, что неупорядоченные цепи претерпевают умеренное расширение денатуранта (45), и улучшенными методами извлечения значений R _g из данных FRET (40, 42–44), теперь обеспечивают достаточную основу для устранения несоответствий. между SAXS и FRET по размерам неупорядоченных белков.Фундаментальный и важный вывод полученной единой картины состоит в том, что даже в отсутствие денатурирующего агента вода остается хорошим растворителем для большинства развернутых белков.

Наши данные об эффектах, индуцированных флуорофором, согласуются с предыдущими выводами о том, что молекулярные размеры, выведенные из FRET, могут зависеть от используемой пары флуорофоров, при этом более гидрофобные флуорофоры приводят к большему сокращению (43). МД-моделирование с парой флуорофоров Alexa-488/594, например, привело к 10% сокращению IDP даже в 1 М мочевины (61).Аналогичным образом, недавнее исследование показало, что сигналы одномолекулярных FRET (smFRET) как от ДНК, так и от PEG зависят от условий растворителя, при которых размеры цепей, как ожидается, будут инвариантными (51). Однако, явно не согласившись с нашими данными, Fuertes et al. (42) провели измерения SAXS на пяти IDP с Alexa-488/594 и без них и пришли к выводу, что в среднем изменения, наблюдаемые при добавлении флуорофоров, были минимальными. Однако при рассмотрении каждого белка в отдельности различия кажутся значительными по сравнению с узким диапазоном возможных значений.В частности, для пяти белков, охарактеризованных в этом исследовании, ν _{без метки} — ν _{с меткой} = 0,08, 0,03, 0,03, -0,02 и -0,04 (или 0,09, 0,06, 0,03, -0,02 и -0,08 при анализе с использованием наши процедуры; SI Приложение , рис. S5). Хотя Fuertes et al. (49) утверждают, что только один белок (NLS) демонстрирует индуцированное флуорофором сокращение, на самом деле четыре из пяти протестированных белков имели статистически значимые индуцированные флуорофором изменения в ν, причем более половины из них демонстрировали сокращение, индуцированное флуорофором (42). по величине, аналогичной сокращению, которое мы наблюдали для меченного флуорофором PNt в воде (45) ( SI Приложение , рис.S5). Вместе эти данные подтверждают последовательную картину возмущений, вызванных флуорофором, которые вносят свой вклад в различия в величине и денатурирующей зависимости R _g, полученные с помощью SAXS и FRET.

Другой фактор, который, как предполагалось, способствовал расхождению между результатами SAXS и FRET, — это отклонения от пропорциональной зависимости между R _g и R _ee, которые могут возникнуть при анализе гетерополимеров по сравнению с гомополимерами (42). В основе этой точки зрения лежит наблюдение, что если переоценить ансамбль (т.е., вычисляет R _g с использованием только подмножества конформаций), многие возможные значения R _ee согласуются с любым заданным R _g (и наоборот). Вместо того, чтобы выбирать подансамбль конформаций для соответствия паре параметров, мы выбрали альтернативный подход (45). С самого начала мы генерируем физически правдоподобные ансамбли, создаем MFF, используя все эти ансамбли, и проверяем, соответствует ли он данным в целом. Мы обнаружили, что наша MFF точно соответствует всему профилю рассеяния (а не только R _g), что обеспечивает надежную поддержку нашей процедуры.Поскольку мы можем вычислить значения R _g и R _ee непосредственно из базовых ансамблей, у нас есть процедура для получения этих двух параметров путем подгонки данных SAXS с нашим MFF. Мы обнаружили, что для реалистичных денатурированных ансамблей складываемых последовательностей смоделированные пары R _g и R _ee, а также их аналоги, определенные из профилей рассеяния, пропорциональны ( R ²> 0,99). Это оставляет красители как источник остающегося несоответствия между SAXS и FRET.

Используемый нами MFF несовершенен в том смысле, что несколько разные ансамбли могут быть подобраны с использованием одних и тех же параметров R _g и ν. Но погрешность этих двух параметров очень мала по сравнению с их истинными значениями (Рис. 4 A — C ). Учет эффектов гетерополимера не меняет этого вывода. Из этих результатов мы пришли к выводу, что SAXS хорошо подходит для извлечения как R _g, так и R _ee для неупорядоченных гетерополимеров, избегая при этом потенциальных артефактов из-за взаимодействий флуорофора с полипептидными цепями.Этот вывод не отрицает возможности FRET для измерения динамики, связывания и конформационных изменений; Однако в нем подчеркивается, что следует проявлять осторожность при использовании FRET для определения количественных расстояний в исходной немеченой биомолекуле.

Почти дюжина наборов данных IDP SAXS, представленных здесь и ранее (45), как было показано, хорошо подходят для нашего общего MFF ( SI Приложение , таблицы S1 и S3). Это открытие предполагает, что взаимодействия, приводящие к сокращению цепи, распространяются по белковым последовательностям.Водорастворимые, хорошо уложенные белковые последовательности обычно представляют собой хорошо перемешанные гетерополимеры с относительно небольшими участками последовательных гидрофобных остатков (62). Эти хорошо перемешанные последовательности имеют тенденцию вести себя как гомополимеры при измерении глобальными методами с низким разрешением, такими как SAXS. Действительно, мы продемонстрировали, что при достаточном качестве данных плохо смешанные последовательности можно идентифицировать по их отклонению от нашего MFF (Рис. 4 D — F ). Большие отклонения могут возникать у некоторых IDP, особенно с частичным сворачиванием, необычным формированием паттерна последовательности (например.g., блок-сополимеры) и / или в условиях тесноты, которые могут выполнять определенные функции (63, 64).

Представленная здесь унифицированная картина, касающаяся исследований SAXS и FRET развернутого состояния в отсутствие денатуранта, усиливает мнение о том, что вода является хорошим растворителем для большинства развернутых полипептидов, свойство, которое должно уменьшать неправильную укладку и агрегацию, одновременно облегчая синтез и транспорт. То, что большинство белков, тем не менее, легко сворачивается в воде, предполагает, что взаимодействия, управляющие сворачиванием, являются более стабилизирующими, т.е.е. преодолеть способность воды сольватировать развернутое состояние — чем те, которые способствуют неспецифическому коллапсу. Действительно, наблюдение, что, несмотря на минимальные доказательства значительного сокращения развернутого состояния даже при полном отсутствии денатуранта, некоторые белки остаются стабильно свернутыми до 6 M Gdn (41, 65), предполагает, что нативные взаимодействия гораздо более благоприятны, чем любые другие. неспецифические взаимодействия, связанные с коллапсом. Однако, учитывая высокоспецифический характер взаимодействий, образующихся в нативных белках, их способность преодолевать сольватацию развернутой цепи, возможно, не удивительна.

Материалы и методы

PNtCC и PNtC были экспрессированы в Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS и очищены от телец включения, как описано ранее (45, 52, 66), со следующими модификациями. После солюбилизации телец включения конструкции PNt повторно укладывали в 50 мМ Трис, pH 7,2, с 50 мМ β-меркаптоэтанола (βМЕ). Перед заключительной стадией эксклюзионной хроматографии к исходному белковому раствору добавляли 20 мМ βМЕ.

Дополнительную информацию об алкилировании белков и маркировке Alexa-488, а также об измерениях стационарной анизотропии, анализе данных SAXS и моделировании можно найти в приложении SI .

Примечание добавлено в доказательство.

В ходе обзора было опубликовано исследование, в котором флуорофоры участвовали в усилении аффинности связывания между двумя IDP (83).

Благодарности

Мы благодарим Шриниваса Чакраварти и М. Чемпиона за их помощь в области SAXS и масс-спектрометрии, соответственно; и О. Бильзель, Х. С. Чан, С. Такахаши, Р. Бест, Р. Паппу, Д. Тирумалай, Ю. Бай, А. Холхаус, Э. Мартин и Б. Шулер за полезные обсуждения. Эта работа была поддержана грантом NIH GM055694 (Т.R.S.) и GM130122 (для T.R.S. и P.L.C.), Фонд W. M. Keck Foundation (P.L.C.) и Национальный научный фонд гранты GRF DGE-1144082 (для J.A.R.) и MCB 1516959 (для C.R. Matthews, который финансировал периодические встречи между нашими лабораториями). Использование Усовершенствованного источника фотонов, пользовательского объекта Управления науки, находящегося в ведении Управления науки Министерства энергетики (DOE) Аргоннской национальной лабораторией, поддерживалось Министерством энергетики в рамках контракта DEAC02-06Ch21357. Этот проект поддержали NIH 2P41RR008630-18 и 9 P41 GM103622-18.

Сноски

Вклад авторов: J.A.R., M.A.B., K.W.P., P.L.C. и T.R.S. спланированное исследование; J.A.R., M.A.B., A.M.Z., P.L.C. и T.R.S. проведенное исследование; J.A.R., M.A.B., P.L.C. и T.R.S. внесены новые реагенты / аналитические инструменты; J.A.R., M.A.B., P.L.C. и T.R.S. проанализированные данные; и J.A.R., M.A.B., K.W.P., P.L.C. и T.R.S. написал газету.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Эта статья представляет собой прямую публикацию PNAS.
Эта статья содержит вспомогательную информацию на сайте www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1813038116/-/DCSupplemental.

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.

Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно.Ниже приведены наиболее частые причины:

В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, используйте кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
Дата на вашем компьютере в прошлом.Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу.Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.

Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файлах cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта.Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

Обзор оптической визуализации молекул и зондирования с помощью рентгеновского возбуждения in vivo. ткани и обнаруживают и локализуют излучение.Биологическая полезность и цели рентгеновского зондирования для лучшего понимания физиологии и патофизиологии тканей являются движущими мотивами, лежащими в основе технических достижений в этой области. Основными преимуществами рентгеновского излучения в качестве источника возбуждения зонда являются (i) высокая проницаемость и (ii) широкая доступность и признание источников рентгеновского излучения в биомедицинской визуализации. По сравнению с другими методами молекулярного зондирования в ткани сильные стороны молекулярного зондирования на основе рентгеновских лучей могут быть менее очевидными, потому что эта методология только начала появляться в течение последнего десятилетия.

¹ ^— ³ Тем не менее, способность чувствовать сквозь ткань с использованием традиционных источников рентгеновского излучения при одновременном использовании оптического молекулярного контраста дает потенциальные преимущества в отношении проницаемости по глубине и пространственного разрешения. Оптическое зондирование обеспечивает превосходную молекулярную чувствительность по сравнению с методами контрастирования на основе рентгеновских лучей, поскольку рентгеновский контраст обычно основан на фотоэлектрическом эффекте с пиковым затуханием в диапазоне энергий кэВ, ⁴ и обычно необходимо использовать рентгеноконтрастные агенты. присутствуют в тканях в больших количествах, близких к миллимолярным, что делает их полезными только для визуализации объема крови и утечки.Область молекулярного зондирования на основе рентгеновских лучей извлекает выгоду из чрезвычайно большого диапазона детекторов и сенсоров для оптического излучения, которые имеют чувствительность к уровню одиночных фотонов, что делает детекторную сторону отбора проб потенциально очень эффективной.

Возможно, наиболее привлекательной с научной точки зрения частью этой методологии является концепция использования одного источника излучения (например, рентгеновских лучей) в качестве возбуждающего зонда в сочетании с другим типом излучения в качестве сигнала. Эта концептуальная основа для разработки гибридного метода визуализации проиллюстрирована на рис.1 для нескольких возможных типов эмиссионного излучения. Проиллюстрированы рентгеновские активации с испусканием через пути, которые можно обнаружить через ткань, включая (а) индуцированную рентгеновскими лучами флуоресценцию, (б) индуцированную рентгеновскими лучами оптическую люминесценцию (в центре внимания этого обзора), (в) рентгеновское излучение электромагнитная индукция, индуцированная лучами, и (d) акустика, индуцированная рентгеновскими лучами. Хотя не все эти подходы подробно рассматриваются здесь, идеальные характеристики такого гибридного метода включают:

i. уникальный молекулярный зонд, способный с высокой аффинностью связываться с биологическими мишенями;
ii.высокая контрастность или специфичность за счет высокого отношения сигнал / фон;
iii. тип сигнала излучения, который может быть обнаружен с высоким отношением сигнал / шум; и
iv. возбуждающее излучение с высокой проницаемостью для визуализации через ткань (1 / μ≈d, где μ — экспоненциальный коэффициент ослабления, а d — толщина ткани).

Типы сигналов излучения показаны на рис. 1, а значения затухания показаны на рис. 1 (e) и 1 (f).

Рис. 1

Схема различных схем обнаружения для зондов, включая (a) XRF, где рентгеновские лучи являются одновременно возбуждением и испусканием, (b) рентгеновская оптическая люминесценция, где выходной сигнал излучения является оптическим от любой сцинтилляции или черенковские процессы, (c) рентгеновская электромагнитная индукция, когда в ткани индуцируется либо ядерный момент, либо электромагнитное изменение, так что на выходе получается радиочастотный сигнал, и (d) рентгеновский акустический, когда выходной сигнал индуцируется локализованным нагрев, вызывающий переходный процесс ультразвука.Как показано ниже, на (e) спектр затухания в воде показан для электромагнитного излучения, а на (f) показан спектр затухания акустических частот в ткани.

В случае оптического излучения самая большая привлекательность состоит в том, что оптические молекулярные зонды составляют, возможно, наиболее развитую и разнообразную группу датчиков для получения изображений биологических объектов. Существуют тысячи оптических датчиков, и некоторые из них коммерчески доступны для использования в доклинической визуализации. Следовательно, доклинические оптические системы визуализации являются наиболее широко используемыми для визуализации всего тела животных, ⁵ и визуализация функции тканей и патологии с помощью многих типов оптических пятен широко используется как in vivo , так и ex vivo .Вторая важная особенность обнаружения оптического излучения — очень высокая чувствительность вплоть до уровня одиночных фотонов. Однако из-за рассеяния и поглощения тканями происходит экспоненциальное затухание оптических сигналов с глубиной в ткани, хотя возможно получение изображений через несколько сантиметров ткани. Комбинация возбуждения сканирующим рентгеновским излучением с обнаружением оптического излучения может обойти ограничения разрешения диффузной оптической визуализации, обладая преимуществом оптической чувствительности и широкого выбора агентов оптической визуализации.В качестве альтернативы, комбинации оптического зондирования с другими инструментами структурной визуализации, такими как ультразвук, МРТ или компьютерная томография (КТ), также являются коммерчески доступной парадигмой.

Выбор источников рентгеновского излучения, типов и режимов детекторов также весьма разнообразен. Энергетический диапазон необходимых рентгеновских лучей зависит от типа зонда и механизмов его физического взаимодействия, как показано на рис. 2. Механизмы взаимодействия варьируются от рентгеновских лучей с низкой энергией кэВ, где взаимодействие с зондом осуществляется через фотоэлектрический эффект. , вплоть до низких энергий МэВ, когда генерация черенковского излучения является доминирующей модой для возбуждения зонда.В целом, необходимо рассмотреть следующие варианты: (i) источник рентгеновского излучения, (ii) молекулярный зонд, (iii) детектор излучения и (iv) методика восстановления изображения. Эти темы рассматриваются следующим образом, с акцентом на преимущества и недостатки существующих подходов и на то, как вышеупомянутые варианты взаимосвязаны. По мере развития технологий необходимо думать о мотивации, движущих факторах и возможностях. Этот обзор начинается с исторического обзора от истоков методов рентгеновской флуоресценции (XRF) до методов рентгеновской оптической люминесценции с акцентом на молекулярную чувствительность и полезность, а затем заканчивается акцентом на том, что необходимо для развития этой области. возможности.

Рис. 2

Иллюстрация четырех основных категорий зондов, возможных с возбуждением рентгеновскими лучами, грубо разделенных на категории с точки зрения их возможностей для (верхний столбец) прямого возбуждения рентгеновским излучением или вторичного черенковского излучения и (нижний столбец) с помощью их эмиссионные способности переходят от XRF к рентгеновской люминесценции. Каждая категория имеет как молекулярную (верхний ряд), так и наночастицы (нижний ряд) формы, которые активны в рентгеновских лучах.

2. От флуоресценции рентгеновских лучей до оптической люминесценции рентгеновских лучей

Основные принципы использования рентгеновских лучей для образцов тканей восходят к успешным истокам XRF-зондирования, где концентрация следов металлов, таких как Fe, Zn, Cu, Hg и Se количественно определяются в ткани путем обнаружения вторичных характеристических рентгеновских лучей, испускаемых при облучении образца возбуждением падающими рентгеновскими лучами или гамма-лучами.⁶ ^— ⁸ В этом случае слово «флуоресценция» используется для обозначения испускания этих специфических рентгеновских лучей с узкими энергетическими полосами, характерными для переходов внутренней электронной оболочки металлов. Фактическое взаимодействие между рентгеновским лучом и фоновой средой приводит к преобладанию рассеянных Комптоном фотонов, которые вносят основной вклад в фон. XRF-визуализация была разработана также как CT, ⁹ ^— ¹² и в последнее время широко разработана как инструмент микроскопии для получения изображений микроэлементов на срезах тканей.¹³ Одна из самых поразительных особенностей XRF заключается в том, что несмотря на высокую специфичность к металлам, чувствительность низка по сравнению с большинством инструментов in vivo молекулярной визуализации. Пределы обнаружения составляют около 0,1 мг / г, что приближает его к высокому миллимолярному диапазону чувствительности, в то время как для сравнения методы флуоресценции и ядерной медицины имеют концентрационную чувствительность от наномолярного до пикомолярного. ⁸ Как и в случае с оптическими методами, чувствительность в тонких тканях может быть значительно выше, чем при использовании in vivo .¹⁴ ^, ¹⁵ Проблемами, ограничивающими обнаружение в XRF, являются (i) высокий фон от комптоновского рассеяния, (ii) высокий шум детектора и (iii) низкая эффективность захвата сигналов детектором. Зондирование тканей и визуализация почти требуют использования моноэнергетических гамма-лучей или источников синхротронного рентгеновского излучения для подавления неспецифического фона и достижения более высокого отношения сигнал / шум. ¹⁶ ^, ¹⁷ Сила синхротронного подхода заключается в том, что фон низкий и большинство более сильных эмиссионных линий четко отделены друг от друга.

Из этих источников в XRF в течение нескольких десятилетий захватывающим направлением развития было использование других режимов возбуждения или других излучаемых сигналов, которые могли бы обеспечивать молекулярно-специфические сигналы. Кроме того, эти разработки могут обеспечить более широкий диапазон доступных сигналов ¹⁸ при переходе от строго рентгеноконтрастных агентов к другим режимам возбуждения радиолюминесценции. Это проиллюстрировано на рис. 2. Для любого агента-зонда, молекулы или наночастицы, молекулярная специфичность может быть получена одним из двух способов, либо непосредственно путем зондирования самого атома / молекулы / наночастицы, которая локализуется где-то, либо путем использования специфичности молекулярной мишени, где видимый сигнал XRF исходит от метки на молекуле-носителе.Хотя некоторые атомы металлов могут быть отличными метками, более высокие уровни сигнала могут быть достигнуты за счет использования наночастиц с более высоким поперечным сечением на частицу. Но в более общем плане этот переход влечет за собой необходимость исследовать, какие типы молекул или молекулярных комплексов будут обеспечивать достаточный или лучший сигнал от возбуждения рентгеновскими лучами, а также какие типы излучения могут обеспечить максимальную излучательную способность ткани для обнаружения с высоким отношением сигнал / шум. .

Тогда естественный переход заключается в использовании более чувствительного режима обнаружения, который может достигать уровня одиночных фотонов, такого как либо изотопное гамма-излучение в ядерной медицине, либо методы оптической люминесценции, такие как флуоресценция или фосфоресценция, для увеличения уровня сигнала и / или или подавить фон и уровни шума.¹⁸ Чтобы сохранить проникновение в ткани, ранние попытки исследовали рентгеновское люминесцентное изображение от люминофоров, излучающих от красного до инфракрасного, поскольку это окно длин волн имеет высокое пропускание через ткань, хотя и со значительным диффузным рассеянием. Другими окнами излучения могут быть электромагнитные области от ГГц до МГц, которые имеют исключительно низкое затухание, хотя это еще предстоит полностью изучить. В качестве альтернативы можно использовать акустическую эмиссию, которая широко применяется в фотоакустике.Эта область называется рентгеноакустической визуализацией или радиоакустикой. ¹⁹ ^— ²³ Эти режимы измерения взаимодействия рентгеновских лучей показаны на рис. 2, причем схема падающего излучения и обнаружения находится вверху, а физический режим контраста — внизу. Интересно, хотя и сложно, сравнивать чувствительность обнаружения для каждого из этих четырех возможных режимов обнаружения, потому что диапазон взаимодействий и диапазон детекторов очень разнообразны. Чувствительность к взаимодействию для рентгеновской акустики обычно низкая, поскольку общее количество энергии, выделяемой дозой излучения в ткани, невелико.Однако ультразвуковые преобразователи прекрасно разработаны и обладают высокой чувствительностью, поэтому некоторые предварительные исследования показали, что такой режим обнаружения возможен. Тем не менее, чувствительность детектирования флуоресцентного излучения может быть на порядки выше, чем акустического детектирования в условиях биологической визуализации, из-за способности детекторов улавливать одиночные кванты излучения в оптике. Но геометрия и конструкция любой системы обнаружения могут на порядки изменить эту чувствительность.

Режим возбуждения оптически активного контрастного вещества зависит от механизма взаимодействия с излучением, как показано на рис. 2, и энергетического спектра источника излучения. В то время как синхротронные или изотопные источники могут генерировать моноэнергетические пучки рентгеновских лучей или гамма-лучей, наиболее эффективные практические источники рентгеновского излучения основаны на тормозном эффекте электронного луча, падающего на цель, создавая источник широкого спектра, как показано на Рис. 3 (а) и 3 (б).Лишь небольшая часть энергии испускается в виде рентгеновских лучей, а спектр сильно взвешен по фотонам с самой низкой энергией. Таким образом, возбуждение пучка от традиционных источников рентгеновского излучения с широким энергетическим спектром мало специфично. Основными режимами возбуждения, как показано на рис. 3 (c), являются:

1. Прямое или косвенное электронное возбуждение сцинтиллятора через верхние синглетные состояния пи-электронов, что в конечном итоге приводит к радиационному распаду. Сложность процессов зависит от природы как среды, так и сцинтиллятора, которая определяет их взаимодействие.Конечные продукты гидролиза воды (то есть H *, HO *, OH-, h4O +, h3 и h3O2) доминируют во взаимодействиях, поскольку вода находится в наибольшей концентрации, и они могут передавать энергию сцинтиллятору. Хорошо известным примером этого является хинин, который, по-видимому, проявляет как сцинтилляцию, так и флуоресценцию; однако взаимодействие со средой, как правило, является доминирующим фактором в этой индукции.
2. Мягкие столкновения электронов в среде, приводящие к черенковскому излучению как часть процессов мягких столкновений, которые возбуждают молекулы за счет прямого поглощения синглетного состояния.Это пропорционально показателю преломления среды для черенковского излучения, а затем перекрытию черенковского спектра с поглощением молекул. Почти все молекулы с полосой поглощения в видимом диапазоне с высоким выходом излучения будут работать для этого метода, хотя красные поглощающие молекулы более значимы из-за синего поглощения черенкова кровью в тканях.

Рис. 3

Энергетические спектры рентгеновского излучения от тормозного излучения через линейный ускоритель (a) для разных энергий и спектр для 6 МВ при разных диаметрах пучка (b), показывающий более высокие энергии при меньших пучках.Схема процессов от рентгеновского излучения до оптического излучения показана на (c) либо с прямым сцинтилляцией молекулы, опосредованной различными радиолитическими событиями в среде, либо с непрямым переносом последовательностью фотоэлектрических или комптоновских испускаемых электронов, генерирующих черенковский свет. , который затем дает оптические фотоны, поглощаемые молекулой. Каскад, индуцированный излучением, проиллюстрирован на (d) серией событий взаимодействия между вторичными электронами и фотонами, ведущих к широким механизмам диссипации энергии в среде.

Общая эффективность обоих этих режимов обычно низкая, хотя молекулы с высоким квантовым выходом излучения, такие как флуоресцеин, могут сделать этот процесс более благоприятным. Возникающий каскад излучения, рис. 3 (d), приводит к широкому спектру механизмов взаимодействия, которые могут еще больше снизить эффективность любого отдельного пути. Тем не менее, энергия одиночного рентгеновского фотона (1 МВ) в 106 раз выше, чем у оптического фотона (1 эВ), что указывает на то, что даже небольшой процесс эффективности может привести к десяткам или сотням оптических фотонов на рентгеновский фотон.

3. Рентгеновская оптическая томография

Рентгеновская люминесцентная томография была впервые постулирована в 2010 году, показав, что радиолюминесцентные частицы можно визуализировать изнутри тканевых фантомов путем сканирования рентгеновских лучей для их возбуждения и захвата излучения. сигнала. ⁴ ^, ²⁴ Это было расширено, чтобы включить моделирование диффузного переноса света с учетом потери сигнала как функции расстояния между местом излучения и обнаружением света на поверхности.Использование частичного угла для визуализации почти необходимо для этого типа работы, и несколько групп продемонстрировали, как это может быть достигнуто на фантомах ²⁵ ^— ²⁹ и in vivo . ³⁰ ^, ³¹ Основным ограничением в этом аспекте работы была чувствительность к главным образом используемым наносцинтилляторам. Исследованные механизмы взаимодействия в основном связаны с прямым возбуждением частицы пучком рентгеновских лучей, где зависимость от фотоэлектрического эффекта требует использования материалов с высоким атомным номером, Z, и в основном кристаллических структур для получения достаточного выхода радиолюминесценции из процесс (см. рис.2). Эффективность существенно зависит от энергии рентгеновского излучения E, используемого из-за сильной зависимости поперечного сечения взаимодействия фотоэлектрического эффекта с энергией, составляющей σ≈Z4 / E3.

По сравнению с прямым взаимодействием рентгеновских лучей, процесс черенковской радиолюминесценции обеспечивает вторичный механизм возбуждения. Преимущество использования черенкова заключается в том, что он создается во всем объеме, пропорциональном дозе, и обеспечивает широкополосный сине-белый источник света в ткани.Хотя слабым местом является то, что он производится только из вторичных электронов с энергией выше порогового значения 220 кэВ в ткани и с выходом около 1% от общей доставленной дозы. Таким образом, хотя у этого возбуждения есть привлекательные оптические особенности, оно требует источников рентгеновского излучения высокой энергии и все же дает ограниченный выход света. Тем не менее, получение изображений черенковской люминесценции было продемонстрировано с использованием изотопов in vivo , а также с помощью линейных ускорителей, используемых в лучевой терапии. Последний обеспечивает способ изображения ткани с более высокой точностью благодаря способности сканировать луч через ткань и использовать инструменты обработки изображений для восстановления изображений с высоким разрешением.Основным преимуществом этого подхода является то, что флуоресцентное и фосфоресцентное возбуждение может быть достигнуто непосредственно путем поглощения черенковского света молекулярным зондом. Эти молекулярные зонды меньше по размеру, и многие из них могут быть биосовместимыми, как обсуждается ниже.

4. Источники рентгеновского излучения, пучки и проектирование систем

4.1.

Источники рентгеновского излучения и управление пучком

Одним из ключевых значений молекулярного зондирования на основе рентгеновского излучения является концепция, согласно которой положение источника возбуждения известно априори, и может использоваться в процессе реконструкции изображения. так что даже если излучение размывается из-за оптического рассеяния через ткань, может быть восстановлено изображение с высокой точностью.Первоначально это было продемонстрировано в рентгеновской оптической люминесцентной томографии Pratx et al., ³ с использованием рентгеновской визуализации и реконструкции изображений с кэВ. Моделирование диффузии может использоваться для уменьшения ошибок, связанных с интенсивностью излучения люминесценции, уменьшающейся при распространении ткани. Используемая геометрия прямо повторяет геометрию, доступную для рентгеновской компьютерной томографии, потому что на этом основана технология источника. В диапазоне энергий кэВ возможны лучи с строчной разверткой или томография с частичным углом, ¹² ^, ²⁹ ^, ³² и в пучках фотонов МВ от линейных ускорителей, многолепестковых коллиматоров (MLC) и зажимов. доступны для динамической формы балок.³³ Полноэкранное изображение также может работать, хотя и без значительного осевого разрешения из-за оптического рассеяния в ткани, но обеспечивает очевидное высокое разрешение при боковом изображении поверхности ткани. ³⁴

4.2.

Temporal Acquisition

Первые исследования индуцированной рентгеновскими лучами оптической люминесценции, основанной на сцинтилляции, не были получены во временной выборке, потому что источники рентгеновского излучения были непрерывными, и поэтому временная выборка не имела внутренней ценности.Однако в построении изображений люминесцентного излучения с черенковским возбуждением есть как неотъемлемая ценность в удалении фонового черенковского света возбуждения, так и преимущество синхронного обнаружения с импульсным источником рентгеновского излучения. Линейные ускорители, производимые для клинического использования, чаще всего имеют сгустки импульсных электронов, которые ускоряются короткими импульсами длительностью 3–5 мс с низкой частотой повторения около 100–400 Гц. Этот отбор образцов значительно медленнее, чем для флуоресценции с временным разрешением, но подходит для методов фосфоресценции с временным разрешением, и поэтому первые демонстрации in vivo были сосредоточены на отображении люминесценции от кислородных датчиков, которые имеют триплетные состояния, которые гасятся в этой временной шкале.Однако существуют более быстрые импульсные источники рентгеновского излучения, такие как небольшие источники рентгеновского излучения для портативных рентгеновских лучей ²⁰ или даже большие источники, используемые для промышленной импульсной радиографии. ³⁵ Самые быстрые коммерчески доступные источники импульсного рентгеновского излучения находятся в диапазоне десятков наносекунд для длительности импульса, а полнота спада обычно не охарактеризована или не указана. Таким образом, быстрое временное стробирование для таких вещей, как флуоресценция органических молекул, со временем жизни обычно в наносекундном диапазоне, потребует деконволюции для функции отклика прибора рентгеновского детектора, ³⁶ ^, ³⁷, как это обычно делается. в работе по счёту одиночных фотонов с временной корреляцией.³⁸

Временное стробирование было продемонстрировано с использованием люминесцентного излучения для подавления черенковского светового сигнала и обеспечения почти бесфонового зондирования ткани. Визуализация одного лимфатического узла была продемонстрирована Zhang et al., ³³ с использованием агента, чувствительного к кислороду, и восстановление продолжительности жизни между 22 и 44 мс предоставило возможность определять местное парциальное давление кислорода (pO2). Возможно обнаружение других люминесцентных частиц, и микросферы европия являются коммерчески доступными агентами для связывания с нацеливающими частями, время жизни которых составляет 100 микросекунд.³⁹ В качестве альтернативы силиконовые наночастицы также имеют длительный срок службы и могут использоваться в качестве генератора световых сигналов с целевой доставкой. ⁴⁰

4.3.

Боковое и осевое пространственное разрешение

Возможно, одной из наиболее неразвитых областей в молекулярном зондировании на основе рентгеновских лучей является управление источником рентгеновского излучения для улучшения пространственного разрешения. Достижения в конформной и адаптивной лучевой терапии привели к усовершенствованию инструментов на линейном ускорителе для управления распределением дозы луча.MLC, присутствующие на выходе линейного ускорителя, достигли очень высокой степени точности, где может быть достигнута миллиметровая точность падения дозы. Та же самая точность затем может быть применена там, где поперечная и осевая протяженность лучей используются для регулировки отбора проб ткани. Как упоминалось выше, поперечное разрешение в значительной степени контролируется MLC и зажимами линейного ускорителя, но осевое разрешение определяется выбором типа излучения пучка (электроны, фотоны и протоны) или глубины сканирования пучка, как показано на рис.4 (а). Таким образом, линейные контроллеры MLC обеспечивают простой технологический способ формирования лучей для линейного сканирования, точечного сканирования, многоточечного или многострочного сканирования [см. Рис. 4 (a)] или, в более общем смысле, набора ортогональных базисных функций в исходные шаблоны для таких подходов, как сжатое зондирование. ⁴¹ ^, ⁴³ ^, ⁴⁴

Рис. 4

Боковые пространственные ограничения пучка в ткани определяются линейным ускорителем (a), формирующим пучок MLC (вставка фотографии ниже) с иллюстрация того, как MLC могут использоваться для точечного растрового сканирования или многоточечного сканирования.⁴¹ (b) На глубину зондирования влияет выбор излучения и энергии пучка, как показано на кривых зависимости глубины от дозы для электронных пучков. Сканирование можно аксиально модулировать по глубине за счет изменения болюса накопления между тканью и лучом, как показано на (c). Боковое разрешение ограничено возможностью срезать или фокусировать рентгеновский луч, как показано в моделировании методом Монте-Карло лучей на 6 и 18 МВ (d), где луч направлен вниз, а оси XY показывают размеры в миллиметрах. в ткань, а цветовая полоса представляет собой черенковскую шкалу интенсивности.⁴² Окончательное поперечное пространственное разрешение можно деконволюционировать с помощью ширины луча, показать чувствительность к субмиллиметровым объектам, как показано на (e), где тонкие люминесцентные капилляры переменного диаметра, d, использовались для демонстрации чувствительности для разрешения полной ширины на полувысоте (FWHM) до диаметра 0,2 мм. ³³ FWHM — это свертка ширины луча с d.

Если необходимо ограничить глубину проникновения, можно использовать электронное облучение, которое имеет ограниченную глубину проникновения, и даже применить переменный болюс или область накопления к лучу перед тканью, как показано на рис.4 (b), тем самым позволяя изменять глубину выборки вне линейного ускорителя, точно так же, как MLC регулирует поперечный компонент луча. Глубина дискретизации электронов может варьироваться, поскольку у них самая крутая кривая спада по сравнению с фотонами. В качестве альтернативы, в системах с кэВ были показаны различные попытки использовать зеркала для фокусировки рентгеновских лучей или волоконно-оптические конусы ⁴⁵ ^— ⁴⁷, и по мере развития этой технологии может оказаться возможным ограничить поперечное разрешение с помощью этого подхода к фокусировке.

4.4.

Мультиплексирование сигналов

Возбуждение рентгеновскими лучами неявно приводит к широкополосному сигналу, который может возбуждать более одного молекулярного зонда. Могут возникать как сцинтилляционные, так и черенковские сигналы, и можно обнаруживать множественные эмиссионные сигналы на основе временного стробирования или разделения интенсивности по длине волны. Было показано возбуждение множественных молекулярных красителей Черенковым с оптимальными спектральными окнами в красном, ⁴⁸ ^, ⁴⁹ ближнем инфракрасном и коротковолновом инфракрасном (SWIR) (также называемом ближним инфракрасным диапазоном). window II, NIR-II) ⁵⁰ ^— ⁵² диапазонов длин волн.В частности, излучающие SWIR агенты часто представляют собой наночастицы и поэтому оптимально подходят для прямого возбуждения рентгеновскими лучами. ⁵⁰ ^, ⁵³ ^, ⁵⁴ В этой области ведется большой объем исследований, и доступны многоцветные излучатели. ⁵⁵ ^, ⁵⁶ Детекторы для длин волн SWIR часто отличаются от детекторов для длин волн красного или NIR, ⁵⁷, поэтому можно использовать отдельные детекторы для распараллеливания или спектрального разложения с помощью спектрометра.⁵⁸ ^, ⁵⁹ Обнаружение с временной синхронизацией также может быть связано с разделением сигналов на основе длины волны, чтобы дополнительно максимизировать возможность одновременного обнаружения сигналов, а сигналы на основе сцинтилляций могут иметь порядок величины. быстрее, чем органическая флуоресценция, которая, в свою очередь, на порядки быстрее, чем фосфоресцентные сигналы. Тщательная выборка временной последовательности рентгеновских импульсов со стробированием детектора может оптимизировать это.

5. Реконструкция изображения

5.1.

Местоположение рентгеновского луча, используемое в качестве предварительной пространственной информации при формировании изображений

Рентгеновские фотоны испытывают гораздо меньшее рассеяние, чем оптическое излучение в тканях, и, следовательно, индуцированная рентгеновскими лучами радиолюминесценция в основном возникает внутри или очень близко к объему, который находится прямо на пути сканирующего луча. Однако пределы разрешения можно определить по комптоновскому рассеянию рентгеновских лучей, которое может происходить как внутри, так и за пределами ткани. Для источников с кэВ рассеяние обычно не является значительным, поскольку оно в значительной степени дает мягкое рентгеновское излучение, которое имеет очень малую глубину проникновения в ткань.Это верно как вне ткани, так и внутри нее. В подходе, рассчитанном на МэВ, Linac MLC (рис.4) обеспечивает простой технологический способ формировать лучи для различных сканирований, как упомянуто выше, а также индуцировать рассеяние рентгеновских лучей вблизи границ листа, в некоторой степени, в зависимости от конкретных условий. структура конца листа. ⁶⁰ ^, ⁶¹ Аналогичная ситуация существует в тканях, где при черенковском люминесцентном излучении большинство черенковских фотонов (в УФ-синем спектральном диапазоне) имеют очень короткий путь диффузии (<1 мм) в ткани. за счет гемоглобина и водопоглощения.Эти свойства составляют ключевой аспект схемы молекулярной визуализации, индуцированной рентгеновскими лучами, где распределение оптического сигнала вдоль направления сканирования может быть восстановлено путем измерения общего сигнала люминесценции и с учетом того, что весь сигнал исходит из положения сканирующего луча. в ткани, используется в качестве априорной информации в алгоритме реконструкции.

5.2.

Моделирование диффузии черенковских и оптических фотонов

Радиационный перенос диффузии фотонов через мутную среду может быть решен либо численно с помощью моделирования Монте-Карло, либо аппроксимирован аналитически с помощью диффузионного приближения.Решения Монте-Карло обычно поддерживают высокую точность и широкую применимость, ⁶² ^, ⁶³, и их использование было значительно ускорено за счет вычислений на графических процессорах. ⁶⁴ ^— ⁶⁹ Существуют его расширения для моделирования переноса частиц высоких энергий, которые также можно использовать, например, GEANT4, хотя и со значительно большими вычислительными затратами. ⁷⁰ ^— ⁷³ Диффузионное приближение обеспечивает приближение первого порядка переноса на расстояниях, превышающих несколько миллиметров, и широко применяется в диффузной оптической томографии.Однако ограничения этого приближения важны, а это означает, что оно должно применяться только там, где зарегистрированные фотоны достаточно рассеиваются, чтобы потерять свое первоначальное направление. Это условие может незначительно соблюдаться на черенковских изображениях в зависимости от красного и ближнего инфракрасного диапазонов длин волн. ⁷⁴ ^, ⁷⁵ Например, УФ-синий спектральный диапазон излучения, который всегда преобладает при измерении, в значительной степени поглощается в большинстве биологических тканей и поэтому редко рассеивается при транспортировке.⁷⁶ ^, ⁷⁷

Черенковский свет обычно моделируется комплексным образом, который включает в себя отчетливое поведение широкополосного спектра длин волн фотонов с пиком в ультрафиолете и затуханием интенсивности с обратной квадратичной зависимостью от длины волны. ⁷⁸ Моделирование индуцированного рентгеновским излучением Черенкова, поскольку возбужденный свет содержит два связанных процесса возбуждения и излучения, и явно потребует моделирования взаимодействия рентгеновских лучей с помощью инструментов Монте-Карло, таких как GEANT4.На практике черенковский / рентгеновский луч можно рассматривать как недиффузный источник света внутри ткани, что упрощает процесс. Коды Монте-Карло, которые моделируют перенос света в биологических средах, вызванный излучением, были интегрированы в интерфейс GAMOS для GEANT4. ⁷³

5.3.

Типичные реконструкции изображений: преимущества и ограничения

В настоящее время реконструкции изображений можно грубо разделить на три категории: на основе модели ⁷⁹ ^, ⁸⁰ прямая деконволюция, ⁴³ ^, ⁸¹ ^, ⁸² и обратная проекция.³² ^, ⁸³ Подходы, основанные на моделях, имеют самое широкое применение для геометрии измерения и механизмов возбуждения. Однако реконструкция на основе модели может быть неэффективной и даже неэффективной, когда цель находится близко или далеко от границы на стороне обнаружения. В первом случае необходима строгая прямая модель, использующая либо Монте-Карло, либо приближения с более высокой точностью для точного моделирования переноса излучения; в то время как в последнем случае любое крошечное возмущение и несогласованность оптических свойств может привести к ошибочным реконструкциям как по интенсивности, так и по местоположению.Реконструкция может быть улучшена путем объединения полезной априорной информации о геометрии измерения, характеристических выбросах и т. Д. В процессе регуляризации, который оказался эффективным способом, хотя и с предположением о точности априорных значений. ⁸⁴ ^— ⁹⁰

Благодаря использованию преимуществ точной геометрии измерения и использования методов кодированного освещения, прямая прямая деконволюция была использована для реконструкции, например, сканированное изображение люминесценции с черенковским возбуждением (CELSI).CELSI использует коллимирующую систему [Рис. 4 (а)] линейного ускорителя, чтобы направить световой пучок, распространяющийся по изображаемому объекту способом, эквивалентным формированию пучка возбуждения, используемому в световой микроскопии, как показано в первой строке рис. 5. Ограничивая Если пучок возбуждения направлен на один узкий лист, происхождение оптических фотонов может быть определено независимо от того, где эти фотоны были обнаружены или сколько раз они рассеялись в ткани. Прямая деконволюция также применялась для геометрии вертикального освещения, как показано во втором ряду рис.5. За счет одновременной регистрации черенковских изображений и изображений CELSI, возбужденных пространственно-модулированным рентгеновским лучом, восстановление изображения было улучшено за счет стратегии пространственной демодуляции на каждом временном шаге, основанной на методах сжатого зондирования. Однако прямая деконволюция обычно страдает двумя проблемами: (i) точные сверточные ядра обычно трудно определить с приемлемыми вычислительными затратами, и (ii) числовая деконволюция может увеличить шум измерения, когда амплитуда приближается к нулю в частотной области.

Рис. 5

Геометрии измерения черенковской радиолюминесценции, основанные на доставке Linac MLC и соответствующих немодельных реконструкциях изображений. Изображение с боковым сканированием (вверху) направляет рентгеновские лучи в форме листа для измерения локального люминесцентного излучения, которое затем деконволюционирует с помощью ядер, полученных из диффузионного приближения. Вертикально сканированное изображение (в центре) пространственно и временно модулирует черенковское освещение в соответствии с определенными диаграммами направленности, а затем возможна демодуляция с помощью одновременно полученных форм черенковского пучка возбуждения.Как и метод визуализации, используемый в КТ (внизу), изображения CELSI были получены путем вращения гентри Linac для получения синограммы, которая затем использовалась с FBP данных для реконструкции изображения. Во всех экспериментах всегда использовалось плоское зеркало, чтобы избежать прямого воздействия луча излучения на камеру.

Был использован алгоритм реконструкции обратного проецирования или фильтрованного обратного проецирования (FBP), первоначально разработанный для КТ, известный как рентгенолюминесцентный КТ (XLCT). ³ ^, ⁹¹ Как и геометрия измерения в CT, необработанные изображения в XLCT были получены путем вращения гентри Linac (см. Последнюю строку на рис.5) для визуализации синограммы, которая использовалась при реконструкции изображения на основе обратной проекции. Каждый элемент синограммы представляет собой интеграцию пикселей захваченного изображения, по сути, реализуя однопиксельную визуализацию, которая облегчает использование однофотонного точечного детектора для высокочувствительных измерений в сочетании с методом TCSPC и использованием спектрометра для гиперспектральные исследования. В XLCT анатомическая априорная информация может быть предоставлена либо рентгеновскими снимками, либо данными черенковской поверхности.⁴⁴ ^, ⁹² ^— ⁹⁴ Поскольку измерения проводятся с нескольких ракурсов, визуализация XLCT in vivo аналогична КТ-визуализации в том смысле, что изображение всегда лучше при большем излучении, что может привести к к чрезмерной дозе облучения, поэтому необходимо тщательно продумать последовательность сканирования. Чтобы решить эту проблему, много усилий было сосредоточено на XLCT с разреженным просмотром, используя преимущества улучшенной геометрии и алгоритмов измерения. ⁹² ^, ⁹⁵ ^, ⁹⁶

6. Радиолюминесцентные репортеры: сцинтилляторы и флуорофоры

Диапазон выбора рентгеновского излучения, как уже было описано, также влияет на радиолюминесцентный репортерный агент, который оптимально используется, поскольку источники в диапазоне кэВ возбуждают исключительно сцинтилляторы, тогда как источники в МэВ Диапазон может возбудить все флуорофоры, люминофоры и сцинтилляторы.

Разработка сцинтилляционных наночастиц, которые могут преобразовывать рентгеновское излучение в УФ – видимое – ИК-излучение, является очень активной областью исследований.Хотя это невероятно многообещающе, все известные сцинтилляционные репортеры проходят доклинические исследования молекулярной визуализации или используют ex vivo . ⁹⁷ Благодаря небольшому рассеянию и поглощению рентгеновских лучей в мягких тканях, этот тип люминесценции, возбуждаемой рентгеновскими лучами, позволяет получать глубокие оптические изображения in vivo со сверхвысоким пространственным разрешением и незначительной автофлуоресценцией тканей. ⁴ ^, ⁹⁸ Наночастицы на основе фторида, легированные лантаноидами, имеют высокий атомный номер и правильные электронные энергетические состояния для преобразования рентгеновских лучей с понижением частоты в люминесценцию УФ – видимой – ближней ИК-области.⁹⁸ ^— ¹⁰¹ Наночастицы NaGdF4: Eu3 + / Tb3 + являются представительным типом с эффективным люминесцентным излучением при рентгеновском облучении, поскольку энергетические переходы излучения внутри Gd3 + могут резонансно связываться с возбужденным состоянием ионов Eu3 + / Tb3 + в комбинация Gd3 + -Eu3 + / Tb3 + хозяин – допант. ¹⁰² ^— ¹⁰⁴ Наночастицы на основе оксидов, легированных лантаноидами, также демонстрируют яркую люминесценцию, возбуждаемую рентгеновскими лучами. ¹⁰⁵ ^— ¹⁰⁸ Например, наночастицы на основе Gd2O2S: Tb были разработаны для pH-зависимых датчиков, для мониторинга бактериальной инфекции или в виде нанокапсул, содержащих химиотерапию.¹⁰⁹ ^— ¹¹¹ Некоторые сцинтилляционные наноматериалы в этой категории проявляют постоянную люминесценцию, возбуждаемую рентгеновскими лучами, которая все еще может излучать длительную фосфоресценцию после завершения рентгеновского облучения. ¹⁰⁶ ^, ¹¹² ^, ¹¹³ Другие композитные наноматериалы, такие как квантовые точки (КТ), ¹¹⁴ нанокристаллы кремния, ¹¹⁵ металлоорганические структуры, ¹¹⁶ и нанокластеры золота, ^{117 Сообщалось также, что} излучает люминесценцию при облучении рентгеновскими лучами.Таблица, содержащая список большинства используемых молекул и наночастиц in vitro, или in vivo, , представлена в таблице 1 с кратким описанием каждого ключевого открытия.

Таблица 1

Исследования in vitro или in vivo с использованием или разработкой оптических молекулярных зондов для возбуждения рентгеновскими лучами.

	Зонды	Источник	Прил.	Основные результаты	Справ.
1	Oxyphor, G4, 2P	МэВ	In vivo	Томографическая визуализация pO2 в глубоких тканях с использованием черенковского возбуждения с лучевой терапией.	118, 119
				Парциальное давление кислорода (pO2) в лимфатическом узле крысы регистрировали с помощью сканирования люминесценции с возбуждением Черенкова.	120
				Визуализация оксигенации in vivo , определяющая разрешение, глубину и пределы чувствительности для сканирования с черенковским возбуждением.	80
				In vivo картирование распределения pO2 опухоли с субмиллиметровым пространственным разрешением и отслеживанием ответа на лучевую терапию.	34
2	Еи-хелатные микросферы	МэВ	In vitro	Сканирующая люминесцентная визуализация с высоким разрешением во время стандартной динамической лучевой терапии.	43
2	Еи-хелатные микросферы	МэВ	In vivo	Томографическая люминесценция, возбуждаемая черенковским светом, с помощью метода сканирования с множеством точечных отверстий для получения изображений высокого разрешения in vivo .	43
3	IRDyes 680RD, 700DX и 800CW	МэВ	In vivo	Черенковская флуоресценция NIR IRDyes была успешно обнаружена с помощью спектрального разрешения.	58
4	PdSe QD	МэВ	In vivo	SWIR, возбуждаемый Черенковым, флуоресцентное изображение от 1000 до 1700 нм с использованием длинных квантовых точек PdSe со сдвигом Стокса.	52
5	LaF3: Ce3 +, Tb3 + и LaF3: Tb3 +	кэВ	In vitro	Люминесценция, в которой преобладает излучение ионов Tb3 + и усилено органическим покрытием поверхности.	99
6	Airgel and Sylgard 184	keV	In vivo	Люминесценция композитных аэрогелей кремнезема и Sylgard 184 и La2O2S: обнаружение Eu фосфора подкожно.	105
7	Sr2MgSi2O7: Eu2 +, Dy3 +	кэВ	In vitro	Устойчивая люминесценция, характеристики которой тесно связаны с условиями синтеза.	121
8	HfO2: наночастицы Eu	кэВ	In vivo	Наночастицы Bioinert для получения изображений биологической люминесценции с возбуждением рентгеновскими лучами и УФ-видимым излучением.	122
9	NaGdF4: Tb @ NaYF4	кэВ	In vivo	Метки иммуноанализа для высокочувствительного детектирования альфа-фетопротеиновых биомаркеров без аутофлуоресценции.	104
10	ZnGa2O4: Cr3 +	кэВ	In vivo	Задержанное излучение до 6 часов, при 700 нм для in vivo визуализация всего тела и опухоли.	106, 112
11	NaLnF4: Tb @ NaYF4 с BHQ1-ДНК	кэВ	In vitro	Образцы нанокристаллов на основе сцинтилляторов в аптазо-сенсорном сенсоре FR до селективного сенсора-сенсора FR до селективного сенсора-сенсора FR.	101
12	Lu2SiO5: Ce с AlNap и AlRhod	кэВ	In vitro	Люминесценция настроена с синего на зеленый и красный с помощью FRET и может быть успешно отображена в лабораторных условиях корковые нейроны.	107
13	β-NaGdF4: X% Eu3 +	кэВ	In vivo	Наночастицы, модифицированные для достижения высокой интенсивности люминесценции и сверхнизкой цитотоксичности CT для рентгеновских лучей in vivo.	91
14	NaLuF4: Gd, Eu @ Gd, Lu @ Gd, Lu, Tb	кэВ	In vitro	Возбужден рентгеновским излучением для ФДТ глубоких тканей и оптических изображений, низкая темновая токсичность и эффективная фотоцитотоксичность.	100
15	Gd2O2S: Сцинтовый датчик pH на основе Eu	кэВ	In vitro	Для мониторинга бактериальной инфекции и лечения имплантированных имплантатов был изготовлен рентгеновский люминесцентный датчик на основе люминесценции. устройств.	110, 111
16	Кластер Au25-BSA	кэВ	In vitro	Продемонстрирована рентгеновская оптическая люминесценция биомолекулярно-направленных металлических кластеров.	117
17	Hf-MOF и Zr-MOF	кэВ	In vitro	Были разработаны два металлоорганических каркаса (MOF) для эффективного преобразования рентгеновского излучения в люминесценцию видимого света.	116
18	PEG-SrAl2O4: Eu2 +	кэВ	In vivo	In vivo оптическая биовизуализация в глубоких тканях с использованием постоянной мягкой рентгеновской люминесценции.	113
19	NaGdF4: Eu3 +	кэВ	In vivo	Люминесценция и фотолюминесценция, возбужденная рентгеновским излучением, характеристика кристаллической структуры и внешних факторов.	103
20	Sr8 (Si4O12) Cl8: Eu2 +	кэВ	In vitro	Температурно-зависимая радиолюминесценция, проверенная с помощью УФ-излучения и возбуждения рентгеновскими лучами.	123
21	PEG-NaGd (WO4) 2: Eu	кэВ	In vivo	Используется в качестве высокоэффективного радиолюминесцентного нанозонда для рентгеновской оптической визуализации и контрастного вещества для МРТ и КТ .	124
22	Si-NC, внедренные в оксид	кэВ	In vitro	Формирование и рентгенолюминесцентное исследование нанокристаллов кремния, внедренных в оксид (Si-NC).	115
23	DOX @ Gd2O2S: Tb @ PSS / PAH	кэВ	In vivo	Нанокапсулы, синтезированные для измерения рН-триггерного высвобождения доксорубина.	109
24	BaGdxY1 − ZnO5: Yb3 +	кэВ	In vivo	Высокоэффективный возбуждаемый рентгеновскими лучами люминесцентный люминесцентный свет SWIR для визуализации глубоких тканей.	53
25	КТ CdTe	кэВ	In vivo	Контраст в фантомных тестах и тестах на мышах, количественно определяемый с помощью клинической рентгеновской системы при 20 и 120 кэВ.	114
26	Cs2NaY0.99F6: 0,01Pr3 +	кэВ	In vitro	Сильное ультрафиолетовое излучение C (от 200 до 280 нм) и послесвечение в течение> 2 часов после облучения.	125
27	CeO2: Eu3 +	кэВ	In vitro	Излучение красного света, возбуждаемое УФ-светом и рентгеновскими лучами.	108
28	Ba0.55Y0.3F2: Eu3 +	кэВ	In vivo	Водорастворимые кубические нанофосфоры, поверхность которых модифицирована для in vivo по данным F18 и визуализации β-лучей с помощью рентгеновских лучей .	98

МэВ Рентгеновское излучение Черенкова можно использовать в качестве управляемого источника непрямого света, который может сканировать объекты изображения для возбуждения оптических молекулярных зондов без необходимости сцинтилляции. ⁴¹ ^, ⁸⁰ ^, ⁸¹ ^, ¹²⁰ Хотя общий выход черенковского излучения низок по сравнению со сцинтилляцией, привлекательной оптической особенностью черенкова является его широкополосный спектр от УФ до видимого и Длины волн ближнего ИК-диапазона, ⁵¹, что теоретически дает возможность возбуждать почти все оптические молекулярные зонды с поглощением в этой спектральной области.Однако проблема заключается в том, что широкополосный сигнал создает проблему спектрального перекрытия при обнаружении оптического сигнала. Чтобы исключить смешение черенковского излучения и вторичного оптического сигнала излучения, фосфоресцентные зонды с большим временем жизни использовались для получения изображений люминесценции с возбуждением Черенкова с синхронизацией по времени. ¹²⁶ В качестве альтернативы детектирование со спектральным разрешением, основанное на детектировании спектрометром, может улавливать черенковскую флуоресценцию. ⁵⁸ В дополнение к этому, флуорофорные квантовые точки PdSe с SWIR (от 1000 до 1700 нм) также могут использоваться с черенковской флуоресцентной визуализацией, чтобы попытаться минимизировать перекрытие излучения на основе более длительного стоксова сдвига излучателя SWIR.⁵² Возможно, наиболее важной особенностью черенковской абсорбции является тот факт, что можно использовать органические красители и, следовательно, они имеют достаточно хороший потенциал для использования человеком. В частности, излучение, вероятно, возможно от всех одобренных FDA флуорофоров, таких как флуоресцеин, метиленовый синий и индоцианиновый зеленый, хотя квантовый выход излучения зонда играет большую роль в эффективности обнаружения.

7. Приложения и будущие направления

7.1.

Молекулярное зондирование кислорода и pH

Оксигенация опухоли значительно влияет на результат лучевой терапии, а гипоксические ткани, такие как опухоли (определяемые как имеющие парциальное давление кислорода, pO2, менее 10 мм рт. Ст.), Как известно, более устойчивы к радиационное повреждение, чем полностью насыщенная кислородом ткань. ¹²⁷ ^— ¹²⁹ Следовательно, мониторинг оксигенации опухоли считается очень желательным для эффективной лучевой терапии. Визуализация на основе Черенкова обеспечивает внутренний источник света для возбуждения чувствительных к кислороду датчиков фосфоресценции во время лучевой терапии (рис.6). ³⁴ Томографические изображения кислорода были восстановлены на экспериментальных мышах для определения pO2. ¹¹⁸ ^, ¹¹⁹ Пространственное разрешение было улучшено за счет пространственного кодирования позиционирования луча с помощью линейных ускорителей MLC и последующей деконволюции ширины луча из сигнала. ¹²⁰ ^, ¹³⁰ Используя рентгеновский пучок MV в форме листа, возбуждение ограничивалось узкими объемами, и было продемонстрировано томографическое изображение оксигенации с субмиллиметровым разрешением и наномолярной чувствительностью на глубине нескольких миллиметров (Рис. .6). ⁸⁰ В альтернативном подходе использовались вызванные рентгеновским излучением МВ спектральные изменения черенковского излучения, обусловленные различиями в ослаблении насыщением крови кислородом, значениями SO2. SO2 в тканях крови изменяет поглощение испускаемого черенкова за счет того, что лишенная кислорода кровь поглощает больше в диапазоне длин волн от 600 до 750 нм. Можно регистрировать изменение спектра или, проще говоря, отслеживать изменение интенсивности широкополосного излучения во время доставки излучения. ¹³¹ ^, ¹³²

Рис.6

Люминесцентное изображение кислорода опухоли при возбуждении черенковским светом. (а) Структура и свойство гашения кислорода зонда PtG4. ³⁴ (b) In vivo pO2-визуализация опухоли и нормальной ткани мыши после внутривенной инъекции PtG4. ³⁴ (c) Изображение проекционной люминесценции максимальной интенсивности, наложенное на рентгеновскую компьютерную томографию и томографическую люминесценцию PtG4. ⁸⁰

Еще одним типичным микроокружением опухоли является ацидоз, вызванный высокой скоростью метаболизма в плохо перфузируемых областях опухоли, в результате чего внеклеточный pH в опухолях ниже, чем в нормальной ткани, и может коррелировать с прогнозом и ответом на лечение.¹³³ ^, ¹³⁴ Датчик pH, возбуждаемый рентгеновскими лучами, состоял из рентгеновской сцинтилляционной пленки (Gd2O2S: Tb и Gd2O2S: Eu), покрытой бумагой, окрашенной в метиловый красный, используемой для определения pH с высоким разрешением. в ткани. Значение pH было получено путем анализа оптического спектра через бумагу после сканирования узким рентгеновским лучом. ¹³⁵ Затем неинвазивное определение pH было использовано для мониторинга бактериальной инфекции и обработки имплантированных медицинских устройств через ткани после нанесения покрытия на имплантированные поверхности.¹¹⁰ ^, ¹¹¹ При использовании нанокапсулы с регулируемым pH спектральные изменения были чувствительны к высвобождению доксорубицина, который можно использовать для отслеживания высвобождения лекарственного средства в кислой микросреде опухоли. ¹⁰⁹ Некоторые pH-зависимые долгоживущие эмиссионные люминесцентные зонды кажутся многообещающими для определения времени жизни на основе Черенкова. ¹³⁶ ^— ¹³⁸

7.2.

Исследование иммунологии: биологическая визуализация и разработка комбинированной терапии

За последние несколько десятилетий инновации в области иммунотерапии произвели революцию в подходе к лечению запущенного рака с помощью иммуноклеточной терапии, стимулируя иммунную систему к разрушению злокачественных клеток.¹³⁹ ^— ¹⁴¹ В исследованиях использовалась флуоресцентная визуализация NK-клеток в ксенотрансплантатах рака простаты человека ¹⁴² и миграция Т-клеток в опухоли. ¹⁴³ ^, ¹⁴⁴ Этот метод флуоресцентной маркировки иммунных клеток можно также использовать с рентгеновскими лучами для выполнения in vivo мониторинга терапевтических эффектов для терапии на основе иммунных клеток в реальном времени. Это актуально, потому что теперь показано, что комбинация лучевой терапии и иммунотерапии усиливает индуцированный системный противоопухолевый ответ и обеспечивает более высокий эффект контроля опухоли.¹⁴⁵ Визуализация может контролировать иммунные сигналы во время фракционированной лучевой терапии для специфического восприятия пациентом синергизма между этими видами лечения и их времени.

7.3.

Тераностика: молекулярное зондирование с помощью фотодинамической терапии, индуцированной рентгеновскими лучами

Использование света в качестве механизма активации имеет долгую историю в терапии, возможно, наиболее распространенным из них является УФ-лечение псориаза ¹⁴⁶ ^— ¹⁴⁹ и фотодинамическая терапия (ФДТ).¹⁵⁰ ^— ¹⁵² PDT — это метод неинвазивного лечения рака, в котором используются фотосенсибилизаторы для генерации цитотоксических активных форм кислорода при активации светом с соответствующей длиной волны. ¹⁵³ ^, ¹⁵⁴ ФДТ имеет свою основную силу в неглубоком проникновении света в ткани, и это широко используется в дерматологии для лечения поверхностных поражений кожи. ¹⁵⁵ ^— ¹⁵⁸ Однако лечение глубоких поражений ограничивается ослаблением света кровью.¹⁵⁹ ^— ¹⁶¹ Использование рентгеновских лучей в качестве источника излучения для ФДТ — способ решить эту проблему. Это широко изучалось в последние годы, и многие подходы используют наноцинтилляторы для преобразования рентгеновских лучей в УФ / видимый свет, который активирует фотосенсибилизатор глубоко в тканях, ¹⁶² ^, ¹⁶³, и возможны примеры с прямой черенковской активацией. .

Этот подход к фотодинамической терапии, активируемой рентгеновскими лучами (XPDT), позволяет интегрировать диагностику и терапию опухолей для тераностических приложений опухолей.Тераностическая мезопористая наночастица кремнезема, инкапсулирующая фотосенсибилизатор, 2,3-нафталоцианин и наносцинтиллятор на основе LiGa5O8: Cr, была разработана для эффективного опосредования XPDT глубоких тканей и направления облучения с помощью люминесцентной визуализации с возбуждением рентгеновскими лучами. ¹⁶⁴ Эта наночастица все еще производит O21 из-за длительного и интенсивного послесвечения люминесценции LiGa5O8: Cr после облучения рентгеновскими лучами. После конъюгации с цетуксимабом (т.е. антителом к рецептору EGF) наночастицы были способны избирательно накапливаться в ортотопических опухолях легких, экспрессирующих EGFR, как для EGFR-опосредованного молекулярного зондирования с помощью рентгеновских лучей, так и для XPDT.Другой пример сконструировал возбуждаемую рентгеновскими лучами тераностическую сцинтилляторную наночастицу ядро-оболочку-оболочку на основе NaLuF4, легированного лантаноидами, который мог излучать видимый свет, и был использован с фотосенсибилизатором из розовой бенгалии для ФДТ и визуализации. ¹⁰⁰ В альтернативных подходах к высвобождению лекарственного средства использовались полимерные наночастицы сополимера лактида и гликолида, содержащие фотосенсибилизатор (вертепорфин), который может запускаться рентгеновскими лучами с энергией 6 МэВ для образования O21. Кроме того, нацеливание наночастиц фолиевой кислотой делает возможным специфическое нацеливание на опухоли, которые сверхэкспрессируют рецепторы фолиевой кислоты.Было показано, что включение активированных излучением наночастиц TiO2 оказывает терапевтический эффект, постулируемый как опосредованный черенковским светом, вызывающим фотокаталитический эффект, приводящий к образованию радикальных частиц. ¹⁶⁵

Химиотерапевтические препараты, депонированные с помощью рентгеновских лучей, были исследованы в нескольких частях доставки. Доставка через поглощение витамина B12 через рецептор транскобаламина была показана для доставки агентов и фотореактивации через каркас алкилкобаламина, который является светочувствительным. ¹⁶⁶ Было показано, что активация рентгеновскими лучами высвобождает доксорубицин, связанный в мицеллах, путем разрушения о-нитробензильного линкера, тем самым разрушая открытые мицеллы и приводя к доставке доксорубицина в ядро.¹⁶⁷

Хотя в этом последнем разделе основное внимание уделяется терапевтическим эффектам рентгеновских лучей, опосредованным оптическими сигналами, существует связь с диагностическим сканированием, которая может быть очень важной как с научной, так и с практической точки зрения. По мере продвижения этих терапевтических исследований кажется неизбежным, что диагностический потенциал их использования также станет более очевидным.

8. Выводы

Оптическое определение молекул по возбуждению рентгеновскими лучами описывает ряд технологий и исследований, в которых падающий пучок рентгеновских лучей используется для зондирования глубоких тканей.Общая идея заключается в том, что посредством возбуждения рентгеновскими лучами и активного сканирования или активной доставки молекулярных зондов можно получить принципиально новую биологическую информацию из ткани, глубже, чем раньше, и с более высоким пространственным разрешением. Эта область включает пересечение (i) молекулярных зондов, которые имеют высокий потенциал радиолюминесценции или взаимодействия с радиолюминесценцией, (ii) рентгеновских технологий, которые обеспечивают определенную энергию, боковой или осевой контроль и сканирование, и (iii) биомедицинские потребности там, где есть уже не является хорошим потенциалом для диагностической информации.Сильные стороны заключаются в широком применении и принятии рентгеновских лучей в качестве диагностического инструмента, а также в разнообразии систем, энергий и средств контроля, которые хорошо изучены и разработаны. Проблемы остаются в понимании и совершенствовании молекулярных зондов, которые получают энергию возбуждения от источников рентгеновского излучения и максимизируют выход оптических сигналов таким образом, чтобы сохранить значимую молекулярную информацию по местоположению, интенсивности или времени жизни. Хотя эта область не определена как единое целое, исследования неизбежно будут продолжать определять, что возможно, и что будут приняты нишевые применения, такие как определение кислорода, определение pH, поглощение наноматериалов рецепторами или приложения X-PDT. .

Раскрытие информации

Брайан Пог и Петр Бруза сообщают о финансовых операциях с DoseOptics LLC, производителем камер и систем для черенковской визуализации.

Благодарности

Эта работа спонсируется Национальными институтами здравоохранения (грант на исследования R01EB024498) и через общие службы Центра рака Норриса Коттона (грант P30CA023108).

Доступность кода, данных и материалов

Эта работа представляла собой обзор опубликованных материалов и поэтому не была дополнена каким-либо кодом, данными или материалами.

Ссылки

Ф. Леблон, К. М. Тихауэр и Б. В. Пог, «Метрики разложения по сингулярным значениям показывают ограничения конструкции детектора в диффузной флуоресцентной томографии», Биомед. Опт. Экспресс, 1 (5), 1514 г. –1531 (2010). https://doi.org/10.1364/BOE.1.001514 BOEICL 2156-7085 Google Scholar

K. K. Dwivedi et al., «Микроэлементный анализ пыли, извлеченной из легких и лимфатических узлов домашних животных, с использованием рентгенофлуоресцентного метода», Int.J. Environ. Анальный. Chem., 7 (3), 205 –221 (1980). https://doi.org/10.1080/03067318008071868 IJEAA3 Google Scholar

R. Zhang et al., «Рентгенофлуоресцентная визуализация металлов и металлоидов в биологических системах», Являюсь. J. Nucl. Med. Мол. Визуализация, 8 (3), 169 –188 (2018). Google ученый

13.

D. Mustafi et al., «Рентгеновская флуоресцентная микроскопия демонстрирует преимущественное накопление контрастного вещества на основе ванадия для магнитно-резонансной томографии в опухолях толстой кишки мышей», Мол Imaging, 14 (5), (2015).https://doi.org/10.2310/7290.2015.00001 Google Scholar

14.

B. de Samber et al., «Трехмерное изображение элементов с помощью микро-XRF синхротронного излучения: разработки и приложения в химии окружающей среды», Анальный. Биоанал. Chem., 390 (1), 267 –271 (2008). https://doi.org/10.1007/s00216-007-1694-0 ABCNBP 1618-2642 Google Scholar

21.

S. Hickling et al., «Экспериментальная оценка рентгеноакустической компьютерной томографии для применения в дозиметрии лучевой терапии», Med.Физ., 44 (2), 608 –617 (2017). https://doi.org/10.1002/mp.12039 MPHYA6 0094-2405 Google Scholar

23.

Y. Zheng et al., «Рентген-индуцированная акустическая компьютерная томография для определения стереотаксического частичного облучения молочной железы в положении лежа: имитационное исследование», Med. Физ., 47 4386 –4395 (2020). https://doi.org/10.1002/mp.14245 MPHYA6 0094-2405 Google Scholar

32.

Б. Мэн, Г. Праткс и Л. Син, «Сверхбыстрая и масштабируемая реконструкция компьютерной томографии с коническим лучом с использованием MapReduce в среде облачных вычислений», Med.Физ., 38 (12), 6603 –6609 (2011). https://doi.org/10.1118/1.3660200 MPHYA6 0094-2405 Google Scholar

36.

K. Santra et al., «Какой метод лучше всего подходит для данных с временным разрешением? Сравнение методов минимизации остатка и максимального правдоподобия применительно к экспериментальным данным однофотонного счета с временной корреляцией », J. Phys. Chem. В, 120 (9), 2484 –2490 (2016). https://doi.org/10.1021/acs.jpcb.6b00154 JPCBFK 1520-6106 Google Scholar

39.

X. Cao et al., «Временная люминесцентная визуализация для отслеживания in vivo без фона единичных циркулирующих опухолевых клеток», Опт. Lett., 45 (13), 3761 –3764 (2020). https://doi.org/10.1364/OL.3 OPLEDP 0146-9592 Google Scholar

41.

M. J. Jia et al., «Многолучевой сканирующий анализ с использованием клинического LINAC для визуализации молекулярной люминесценции тканей с черенковским возбуждением с высоким разрешением», Биомед. Опт. Экспресс, 9 (9), 4217 –4234 (2018).https://doi.org/10.1364/BOE.9.004217 BOEICL 2156-7085 Google Scholar

42.

Э. П. М. Ла-Рошель и Б. В. Пог, «Теоретические латеральные и осевые пределы чувствительности и выбор молекулярных репортеров для черенковской люминесценции в ткани во время сканирования рентгеновского луча», J. Biomed. Опт., 26 (11), 116004 (2020). https://doi.org/10.1117/1.JBO.25.11.116004 JBOPFO 1083-3668 Google Scholar

43.

M. J. Jia et al., «Люминесцентное сканирование с возбуждением Черенкова с использованием сканируемого дифференцирования луча и итеративной деконволюции в динамическом плане доставки излучения в геометрии фантома груди человека», Med.Физ., 46 (7), 3067 –3077 (2019). https://doi.org/10.1002/mp.13545 MPHYA6 0094-2405 Google Scholar

44.

M. J. Jia et al., «Томографическое изображение, полученное методом черенковской люминесценции, с множественными лучами-обскурами, восстановленными с помощью реконструкции обратной проекции», Опт. Lett., 44 (7), 1552 г. –1555 (2019). https://doi.org/10.1364/OL.44.001552 OPLEDP 0146-9592 Google Scholar

48.

Ю. Бернхард, Б. Коллин и Р.А. Декро, «Излучение Черенкова с красным смещением для изображения in vivo : связь передачи энергии черенковского излучения с множественными резонансными передачами энергии Форстера», Sci. Реп., 7 45063 (2017). https://doi.org/10.1038/srep45063 SRCEC3 2045-2322 Google Scholar

59.

A. Dsouza et al., «Мультифлуорофорное зондирование при черенковском возбуждении в фантомах, имитирующих ткань, и in vivo, от внешней лучевой терапии», Radiat. Res., 189 (2), 197 –204 (2018).https://doi.org/10.1667/RR14943.1 RAREAE 0033-7587 Google Scholar

62.

С.Д. Рандения и др., «Взаимное сравнение кодов переноса излучения Монте-Карло MCNPX, GEANT4 и FLUKA для моделирования протонной лучевой терапии глаза», Nucl. Технол., 168 (3), 810 –814 (2009). https://doi.org/10.13182/NT09-A9310 Google Scholar

64.

К. Фанг и Д. А. Боас, «Моделирование миграции фотонов в трехмерной мутной среде методом Монте-Карло, ускоренное графическими процессорами», Опт.Экспресс, 17 (22), 20178 –20190 (2009). https://doi.org/10.1364/OE.17.020178 OPEXFF 1094-4087 Google Scholar

67.

T. Young-Schultz et al., «FullMonteCUDA: быстрый, гибкий и точный симулятор Монте-Карло с ускорением на GPU для распространения света в мутной среде», Биомед. Опт. Экспресс, 10 (9), 4711 –4726 (2019). https://doi.org/10.1364/BOE.10.004711 BOEICL 2156-7085 Google Scholar

68.

т.С. Люнг и С. Пауэлл, «Быстрое моделирование методом Монте-Карло света, модулированного ультразвуком, с использованием графического процессора», J. Biomed. Опт., 15 (5), 055007 (2010). https://doi.org/10.1117/1.3495729 JBOPFO 1083-3668 Google Scholar

70.

К. Тиам, К. Бобин и Ж. Бушар, «Моделирование черенковских фотонов, испускаемых в окнах фотоумножителя, индуцированных диффузией Комптона, с использованием кода Монте-Карло GEANT4», Прил. Radiat. Изот., 68 (7–8), 1515 –1518 (2010).https://doi.org/10.1016/j.apradiso.2009.11.066 ARISEF 0969-8043 Google Scholar

72.

A. K. Glaser et al., «Плагин GAMOS для моделирования методом Монте-Карло на основе GEANT4 радиационно-индуцированного переноса света в биологических средах», Биомед. Опт. Экспресс, 4 (5), 741 –59 (2013). https://doi.org/10.1364/BOE.4.000741 BOEICL 2156-7085 Google Scholar

78.

Дж. В. Джелли, Черенковское излучение и его приложения, 304 Pergamon Press, Нью-Йорк (1958).Google ученый

79.

M. Cai et al., «Флуоресцентная молекулярная томография NIR-II / NIR-I гетерогенных мышей, основанная на методе лассо слияния по гауссовскому взвешиванию по соседству», IEEE Trans. Med. Imaging, 39 (6), 2213 –2222 (2020). https://doi.org/10.1109/TMI.2020.2964853 ITMID4 0278-0062 Google Scholar

80.

B. W. Pogue et al., «Карты давления кислорода in vivo с субмиллиметровым разрешением и наномолярной чувствительностью, обеспечиваемые сканированной люминесцентной визуализацией с возбуждением Черенкова», Природа Биомед.Eng., 2 254 –264 (2018). https://doi.org/10.1038/s41551-018-0220-3 Google Scholar

82.

Э. Э. Брост и Ю. Ватанабэ, «Математическая формулировка деконволюции для поверхностного измерения распределения дозы с помощью световой дозиметрии Черенкова», Med. Физ., 45 3880 –3892 (2018). https://doi.org/10.1002/mp.13021 MPHYA6 0094-2405 Google Scholar

85.

G. Zhang et al., «Прямой метод со структурными приоритетами для визуализации фармакокинетических параметров в динамической флуоресцентной молекулярной томографии», IEEE Trans.Биомед. Eng., 61 (3), 986 –990 (2014). https://doi.org/10.1109/TBME.2013.22

IEBEAX 0018-9294 Google Scholar

87.

A. Ale et al., «Производительность изображения гибридной системы рентгеновской компьютерной томографии и флуоресцентной молекулярной томографии с использованием априорных точек», Med. Физ., 37 (5), 1976 г. –1986 (2010). https://doi.org/10.1118/1.3368603 MPHYA6 0094-2405 Google Scholar

88.

C. Li et al., «Трехмерная мультиспектральная флуоресцентная оптическая томографическая система визуализации мелких животных на основе конического зеркала», Опт.Экспресс, 17 (9), 7571 –7585 (2009). https://doi.org/10.1364/OE.17.007571 OPEXFF 1094-4087 Google Scholar

95.

T. Liu et al., «Регуляризованная реконструкция на основе сустава L1 и полной вариации для рентгеновской люминесцентной компьютерной томографии с разреженным углом обзора», Биомед. Опт. Экспресс, 10 (1), 1 –17 (2019). https://doi.org/10.1364/BOE.10.000001 BOEICL 2156-7085 Google Scholar

100.

C.-C. Сюй, С.-L. Линь и К.А. Чанг, «Нанокомпозит ядро-оболочка-оболочка, легированный лантаноидами, для получения люминесцентных изображений методом двойной фотодинамической терапии с помощью одного источника рентгеновского возбуждения», ACS Appl. Матер. Интерфейсы, 10 (9), 7859 –7870 (2018). https://doi.org/10.1021/acsami.8b00015 AAMICK 1944-8244 Google Scholar

102.

W. Zhang et al., «Диспергируемые в воде наночастицы β-NaGdF4X% Eu3 + размером менее 10 нм с повышенной биосовместимостью для рентгеновской люминесцентной компьютерной томографии in vivo, », ACS Appl.Матер. Интерфейсы, 9 (46), 39985 –39993 (2017). https://doi.org/10.1021/acsami.7b11295 AAMICK 1944-8244 Google Scholar

106.

Z. Xue et al., «Активированный рентгеновскими лучами стойкий люминесцентный зонд ближнего инфракрасного диапазона для глубоких тканей и возобновляемой биовизуализации in vivo », ACS Appl. Матер. Интерфейсы, 9 (27), 22132 –22142 (2017). https://doi.org/10.1021/acsami.7b03802 AAMICK 1944-8244 Google Scholar

108.

S. Shi et al., «Синтез горением раствора, фотолюминесценция и рентгеновская люминесценция легированного Eu наноцерия CeO2: Eu», J. Mater. Chem., 22 (44), 23461 –23467 (2012). https://doi.org/10.1039/c2jm34950g JMACEP 0959-9428 Google Scholar

109.

H. Chen et al., «Мониторинг вызываемого pH высвобождения лекарств из радиолюминесцентных нанокапсул с помощью оптической люминесценции, возбуждаемой рентгеновскими лучами», САУ Нано, 7 (2), 1178 –1187 (2013).https://doi.org/10.1021/nn304369m ANCAC3 1936-0851 Google Scholar

112.

Z. Z. Chen et al., «Низкая доза возбуждаемых рентгеновскими лучами долговечных люминесцентных вогнутых нанокубов в высоко пассивном нацеливании на глубоко укоренившиеся опухоли печени», Adv. Матер., 31 (49), 17 (2019). https://doi.org/10.1002/adma.2017 ADVMEW 0935-9648 Google Scholar

113.

L. Song et al., «Повторяемая активация стойких люминесцентных наночастиц в глубоких тканях с помощью мягкого рентгеновского излучения для высокочувствительной долгосрочной биовизуализации in vivo », Наноразмерная, 9 (8), 2718 –2722 (2017).https://doi.org/10.1039/C6NR09553D NANOHL 2040-3364 Google Scholar

115.

C. M. Hessel et al., «Происхождение люминесценции из кремниевых нанокристаллов: исследование тонкой структуры поглощения рентгеновских лучей у края края (NEXAFS) и оптической люминесценции с возбуждением рентгеновскими лучами (XEOL) в оксидных и автономных системах», J. Phys. Chem. С, 112 (37), 14247 –14254 (2008). https://doi.org/10.1021/jp802095j JPCCCK 1932-7447 Google Scholar

116.

С.Ван и др., «Синергетическая сборка кластеров тяжелых металлов и люминесцентных органических мостиковых лигандов в металлорганических каркасах для высокоэффективной сцинтилляции рентгеновских лучей», Варенье. Chem. Soc., 136 (17), 6171 –6174 (2014). https://doi.org/10.1021/ja500671h JACSAT 0002-7863 Google Scholar

123.

C. Liu et al., «Высокий световыход Sr8 (Si4O12) Cl8: Eu2 + при возбуждении рентгеновскими лучами и его температурно-зависимые характеристики люминесценции», Chem.Матер., 26 (12), 3709 –3715 (2014). https://doi.org/10.1021/cm501055k CMATEX 0897-4756 Google Scholar

124.

T. Guo et al., «Высокоэффективная рентгеновская люминесценция в вольфраматных нанозондах, активированных Eu3 +, для создания оптических изображений посредством сенсибилизации с переносом энергии», Наноуровневая, 10 (4), 1607 –1612 (2018). https://doi.org/10.1039/C7NR06405E NANOHL 2040-3364 Google Scholar

130.

M. Jia et al., «Многолучевой сканирующий анализ с использованием клинического LINAC для визуализации молекулярной люминесценции тканей с черенковским возбуждением с высоким разрешением», Биомед.Опт. Экспресс, 9 (9), 4217 –4234 (2018). https://doi.org/10.1364/BOE.9.004217 BOEICL 2156-7085 Google Scholar

132.

X. Zhang et al., «Неинвазивное измерение оксигенации крови тканей с помощью изображений Черенкова во время доставки терапевтического излучения», Опт. Lett., 42 (16), 3101 –3104 (2017). https://doi.org/10.1364/OL.42.003101 OPLEDP 0146-9592 Google Scholar

133.

Д. Нери и К. Т. Супуран, «Вмешательство в регуляцию pH в опухолях как терапевтическая стратегия», Nat.Преподобный «Открытие наркотиков», 10 (10), 767 –777 (2011). https://doi.org/10.1038/nrd3554 NRDDAG 1474-1776 Google Scholar

138.

К. Дж. Арм, У. Лесли и Дж. Г. Уильямс, «Синтез и pH-чувствительная люминесценция комплексов бис-терпиридил иридия (III), содержащих боковые пиридильные группы», Неорг. Чим. Акта, 359 (4), 1222 –1232 (2006). https://doi.org/10.1016/j.ica.2005.09.021 ICHAA3 0020-1693 Google Scholar

143.

A. E. Foster et al., « In vivo флуоресцентная оптическая визуализация миграции цитотоксических Т-лимфоцитов с использованием красителя ближнего инфракрасного диапазона IRDye800CW», Прил. Опт., 47 (31), 5944 –5952 (2008). https://doi.org/10.1364/AO.47.005944 APOPAI 0003-6935 Google Scholar

148.

F. Almutawa et al., «Эффективность локальной фототерапии и фотодинамической терапии псориаза: систематический обзор и метаанализ», Фотодерматол. Фотоиммунол.Фотомед., 31 (1), 5 –14 (2015). https://doi.org/10.1111/phpp.12092 PPPHEW 0905-4383 Google Scholar

155.

M. S. Nestor et al., «Использование фотодинамической терапии в дерматологии: результаты консенсусной конференции», J. Drugs Dermatol., 5 (2), 140 –154 (2006). Google ученый

157.

N. Solban et al., «Прицельная оптическая визуализация и фотодинамическая терапия», в Ernst Schering Res. Найденная мастерская, 229 –58 (2005).Google ученый

160.

W. Chen и J. Zhang, «Использование наночастиц для одновременной лучевой и фотодинамической терапии для лечения рака», J. Nanosci. Нанотехнологии, 6 (4), 1159 –1166 (2006). https://doi.org/10.1166/jnn.2006.327 JNNOAR 1533-4880 Google Scholar

165.

Н. Котагири и др., «Преодоление зависимости фототерапии от глубины с помощью излучения Черенкова и нанофотосенсибилизаторов с низким уровнем излучения», Nat.Нанотехнологии, 10 (4), 370 –379 (2015). https://doi.org/10.1038/nnano.2015.17 NNAABX 1748-3387 Google Scholar

167.

C. Yao et al., «Рентген-индуцированный черенковский оптический запуск клеточного доксорубицина, высвобождаемого в ядро для активации химиолучевой терапии», ACS Appl. Матер. Интерфейсы, 12 (40), 44383 –44392 (2020). https://doi.org/10.1021/acsami.0c05189 AAMICK 1944-8244 Google Scholar

Биография

Брайан Пог — профессор инженерных наук Маклина в Дартмуте и адъюнкт-профессор Медицинской школы Гейзеля в Дартмуте.Он занимается оптикой в медицине и аспектами работы с трансляционной визуализацией в хирургии и радиационной онкологии.

Rongxiao Zhang — доцент медицины в отделении радиационной онкологии в Дартмуте, специализирующийся на исследованиях новых инструментов и методов лучевой терапии, планирования лечения и проверки.

Сюй Цао — доцент инженерной школы Тайера, Дартмутский колледж. Он получил докторскую степень в области биомедицинской инженерии в Университете Цинхуа, Китай.Его исследования посвящены оптике в медицине, в частности, получению изображений с помощью черенковской люминесценции.

Джереми Менгю Цзя — научный сотрудник Стэнфордского университета, работавший в Дартмутском колледже. Его работа направлена на оптимизацию восстановления изображений и реконструкцию новейших методов визуализации.

Артур Петюссо — докторант инженерной школы Тайера в Дартмуте. Его исследовательские интересы сосредоточены на молекулярной визуализации во временной области с использованием технологий быстродействующих камер.В частности, его работа сосредоточена на возбуждаемых рентгеновскими лучами органических флуорофорах и механизмах их возбуждения. Кроме того, он работает над in vivo внутриклеточным датчиком кислорода с использованием замедленной флуоресценции, а также с измерением глубины во время полета с помощью сверхбыстрой камеры SPAD.

Петр Бруза  — доцент кафедры инженерии в Дартмуте, специализирующийся на радиационной визуализации и измерениях, а также фотофизике и методах обнаружения с быстрым таймером.

Виноградов Сергей Александрович — профессор биофизики и биохимии Пенсильванского университета. Его лаборатория специализируется на основах химии и синтезе молекулярных зондов для определения метаболически важных свойств тканей, таких как кислород.

FRET Публикации | W.M. Keck Center for Cellular Imaging, U.Va.

Окислительно-восстановительные состояния отдельных клеток, проанализированные с помощью показателей времени жизни флуоресценции и взаимодействия FRET триптофана с NAD (P) H
Ruofan Cao, et al.

РЕФЕРАТ: Редокс-изменения в живых клетках рака шейки матки HeLa после лечения доксорубицином могут быть проанализированы с помощью новой флуоресцентной микроскопии времени жизни (FLIM), основанной на редокс-соотношении NAD (P) H-a2% / FAD-a1%, называемом Редокс-коэффициент времени жизни флуоресценции или один из его компонентов (NAD (P) H-a2%), который фактически определяет это соотношение и предлагает более простой и альтернативный показатель, и оба сравниваются …

Цитометрия, часть A. 2019, 95: 110-121.

PDF

Внутриейрональная неправильная укладка тау-белка, индуцированная внеклеточными β-амилоидными олигомерами
, Lauren K. Rudenko, et al.

РЕФЕРАТ: Аномальное сворачивание и агрегация белка, связанного с микротрубочками, тау, является отличительным признаком нескольких нейродегенеративных заболеваний, включая болезнь Альцгеймера (БА). Хотя нормальный тау-белок является внутренне неупорядоченным белком, он действительно демонстрирует третичную структуру, благодаря которой N- и C-концы часто находятся в непосредственной близости друг от друга и от смежных повторяющихся доменов, связывающих микротрубочки, которые простираются на C-конце от середины белка. …

Journal of Alzheimer’s Disease, vol. Допечатная подготовка, нет. Допечатная подготовка, стр. 1-14, 2019

PDF

Трехцветная конфокальная Фёрстеровская (или флуоресцентная) резонансная микроскопия с переносом энергии: количественный анализ белковых взаимодействий при зародышеобразовании актиновых филаментов в живых клетках
Хорста Валлрабе и др.

РЕФЕРАТ: Для оценки нуклеации актиновых филаментов были проведены эксперименты с использованием 3-цветной Фёрстеровской (или флуоресцентной) микроскопии резонансного переноса энергии (FRET) живых клеток и соответствующего биохимического восстановления тех же белков in vitro.Демонстрируется новое применение трехцветных данных FRET, расширяющее анализ за пределы обычных расчетов эффективности передачи энергии (E%) ..

Cytometry A., PMID 25755111 (2015)

PDF

Разработка анализа на основе AP-FRET для характеристики взаимодействий РНК-белок при миотонической дистрофии (DM1)
, Shagufta Rehman, et al.

РЕФЕРАТ: Микроскопия с резонансным переносом энергии по Фёрстеру (FRET) — мощный инструмент, используемый для идентификации молекулярных взаимодействий в живых или фиксированных клетках с использованием безызлучательного переноса энергии от донорного флуорофора в возбужденном состоянии к акцепторному флуорофору в близость.FRET может быть очень чувствительным инструментом для изучения взаимодействий белок-белок и / или белок-нуклеиновые кислоты …

PLoS ONE 9 (4): e95957 (2014)

PDF

Исследование взаимодействий триптофан-NADH в живых клетках человека с использованием визуализации времени жизни трехфотонной флуоресценции и микроскопии с резонансным переносом энергии Фёрстера
Винод Джотикумар, Юаншенг Сан и Аммаси Периасами

РЕФЕРАТ: Представлен метод исследования метаболической активности внутриклеточного триптофана (TRP) и кофермента-NADH с использованием трехфотонной (3P) визуализации времени жизни флуоресценции (FLIM) и резонансного переноса энергии Ферстера (FRET).Посредством систематического анализа данных FLIM от онкогенных и неопухолевых клеток наблюдалось статистически значимое уменьшение времени жизни флуоресценции TRP в ответ на увеличение связанного с белком NADH, когда клетки обрабатывали глюкозой ..

J. Biomed. Опт. 18 (6): 060501 (2013)

PDF

Анализ взаимодействия IQGAP1 с помощью восстановления in vitro и трехцветной FRET-микроскопии живых клеток
Horst Wallrabe, et al.

РЕФЕРАТ: IQGAP1 стимулирует зарождение разветвленных актиновых филаментов путем активации N-WASP, который затем активирует комплекс Arp2 / 3. N-WASP может активироваться другими факторами, включая GTP-связанный Cdc42 или Rac1, которые также связывают IQGAP1. Здесь мы сообщаем об использовании очищенных белков для исследований связывания и полимеризации актина in vitro, а также микроскопии Фёрстера (или флуоресцентного) резонансного переноса энергии (FRET) культивируемых клеток для выявления функциональных взаимодействий между IQGAP1, N-WASP, актином и либо Cdc42, либо Rac1…

Цитоскелет, 70: 819-836 (2013)

PDF

Неинвазивная визуализация in vivo интернализации трансферрина клетками рака молочной железы с помощью FRET в ближней инфракрасной области
Ken Abe, et al.

РЕФЕРАТ: Конъюгация противораковых лекарственных средств с эндогенными лигандами оказалась эффективной стратегией для повышения их фармакологической селективности и доставки в опухолевые ткани.Поскольку для пролиферации клеток очень важно железо, раковые клетки экспрессируют высокие уровни рецепторов трансферрина (TfnR), что делает его лиганд, трансферрин (Tfn), представляющим большой интерес в качестве агента доставки для терапевтических средств ..

PLoS ONE 8 (11): e80269 (2013)

PDF

Фёрстеровская резонансная микроскопия с переносом энергии и спектроскопия для локализации белок-белковых взаимодействий в живых клетках
, Yuansheng Sun, et al.

РЕФЕРАТ: Фундаментальная теория резонансного переноса энергии Фёрстера (FRET) была основана в 1940-х годах. Его огромная сила была реализована только в последние 20 лет после разработки и применения различных методов в биологических экспериментах. Этот успех стал возможным благодаря наличию подходящих флуоресцентных зондов, передовой оптики, детекторов, приборов для микроскопии и аналитических инструментов ..

Цитометрия A. 83A (9): 780-793 (2013)

PDF

FRET-микроскопия в 2010 году: наследие Теодора Ферстера к 100-летию со дня его рождения
Автор Yuansheng Sun и др.

РЕФЕРАТ: Теодору Ферстеру в этом году исполнилось бы 100 лет, и он был бы изумлен, увидев влияние его научных достижений, которые все еще развиваются. Сочетание его количественного подхода (Фёрстера) резонансной передачи энергии (FRET) с современными методами цифровой визуализации позволяет ученым выйти за пределы разрешающей способности света (около 200 нм) в световой микроскопии ..

ChemPhysChem, 12: 462-474 (2011)

PDF

Трехцветная спектральная FRET-микроскопия локализует три взаимодействующих белка в живых клетках
, Yuansheng Sun, et al.

РЕФЕРАТ: Технологии FRET в настоящее время обычно используются для установления пространственных отношений между двумя клеточными компонентами (A и B). Добавление третьего целевого компонента (C) увеличивает сложность анализа между взаимодействиями AB / BC / AC. Здесь мы описываем новый метод анализа трехцветной (ABC) FRET-системы, называемой трехцветной спектральной FRET (3sFRET) микроскопией, которая полностью корректируется для спектрального просвечивания …

Биофизический J.Vol. 99, 1274-1283 (2010)

PDF

Дополнительная поправка для расчета эффективности передачи энергии в резонансной микроскопии передачи энергии Фёрстера на основе фильтров для получения более точных результатов
by Yuansheng Sun & Ammasi Periasamy

РЕФЕРАТ: Микроскопия резонансного переноса энергии Фёрстера (FRET) обычно используется для мониторинга взаимодействия белков с системами визуализации на основе фильтров, которые требуют коррекции сквозного спектрального эффекта (или перекрестных помех) для точного измерения эффективности передачи энергии (E).Образец с двойной меткой (донор + акцептор) возбуждается донорной длиной волны, излучение акцептора при условии нескорректированного сигнала FRET, а излучение донора (донорный канал) представляет собой тушеный донор (qD), основу для расчета E. ..

Дж Биомед. Опт. 15 (2) (стр. 1-3) (2010)

PDF

Характеристика оранжевого акцепторного флуоресцентного белка для сенсибилизированной спектральной флуоресцентной резонансной микроскопии с переносом энергии с использованием лазера белого света
, Yuansheng Sun, et al.

РЕФЕРАТ: Оранжевые флуоресцентные белки (FP) являются привлекательными кандидатами в качестве партнеров по Фёрстеровскому резонансному переносу энергии (FRET), преодолевая разрыв между зеленым и красным / дальним красным FP, но они создают серьезные проблемы при использовании обычных фиксированных длин волн лазера. Мы исследовали мономерный Kusabira orange 2 (mKO2) FP в качестве акцептора FRET для мономерного чирка FP (mTFP) в качестве донора на стандартной конструкции FRET с использованием аминокислотного линкера с фиксированным расстоянием, экспрессируемого в живых клетках..

J. Biomed. Опт. 14 (5) (2009)

PDF

PTK7 необходим для подвижности поляризованных клеток и конвергентного расширения во время гаструляции мышей
Wei Wei Yen, et al.

РЕФЕРАТ: Несмотря на участие в качестве механизма, управляющего гаструляцией и удлинением оси тела у эмбрионов мыши, клеточные механизмы, лежащие в основе конвергентного удлинения (CE) млекопитающих, неизвестны.Здесь мы демонстрируем с помощью покадровой визуализации живых эмбрионов мышей с высоким разрешением, что мезодермальный CE возникает за счет интеркаляции медиолатеральных клеток, управляемой поведением медиолатерально поляризованных клеток …

Развитие 136: 2039-2048 (2009)

PDF

Количественное определение белок-белковых взаимодействий: конфокальная FRET-микроскопия
, Ammasi Periasamy, et al.

РЕФЕРАТ: Фёрстеровский резонансный перенос энергии (FRET) — эффективный метод с высоким разрешением для мониторинга межбелковых взаимодействий в живых или фиксированных образцах.FRET можно использовать для оценки расстояния между взаимодействующими белковыми молекулами in vivo или in vitro с помощью конфокальной микроскопии FRET с лазерным сканированием. Спектральное перекрытие донора и акцептора, необходимое для FRET, также приводит к загрязнению сигнала FRET, которое следует удалить, чтобы с уверенностью провести количественный анализ данных ..

Мет. Cell Biol. 89: 569-598 (2009)

PDF

Характеристика улучшенного донорного флуоресцентного белка для микроскопии с резонансным переносом энергии Фёрстера
Ричард Н.Дэй, Синтия Ф. Букер и Аммаси Периасами

РЕФЕРАТ: Генетически кодируемые флуоресцентные белки (FP), используемые в сочетании с микроскопией с резонансным переносом энергии Фёрстера (FRET), предоставляют инструменты, необходимые для прямой визуализации белковых взаимодействий внутри живых клеток. Как правило, для исследований FRET используются голубые и желтые FP варианты Cerulean и Venus, но есть ограничения на их использование. Здесь Cerulean и недавно разработанный мономерный Teal FP (mTFP) сравниваются в качестве доноров FRET для Венеры с использованием измерений спектрального и флуоресцентного времени жизни живых клеток…

J. Biomed. Опт. 13 (стр 1-9) (2008)

PDF

Характеристика спектральной микроскопии изображений FRET для мониторинга ядерных белковых взаимодействий
, Ye Chen et al.

РЕФЕРАТ: Метод визуализации спектрально обработанного резонансного переноса энергии Ферстера (psFRET) обеспечивает эффективный и быстрый метод измерения межбелковых взаимодействий в живых образцах.Коммерчески доступные линейные алгоритмы несмешивания эффективно устраняют вклад донорских спектральных просачиваний в сигнал FRET. Однако акцепторный вклад в спектральное размытие в FRET-изображении не может быть удален аналогичным образом, поскольку акцепторный спектр идентичен спектру FRET ..

J Microscopy, 228: 139-152 (2007)

PDF

Рецепторные комплексы, котранспортируемые по поляризованным эндоцитарным путям, образуют кластеры с отдельными организациями
Хорст Валрабе и др.

РЕФЕРАТ: Ранее конфокальная микроскопия FRET показала, что полимерный IgA-рецептор (pIgA-R) распределен кластеризованным образом в апикальных эндосомах. Чтобы проверить, образуют ли различные мембраносвязанные компоненты кластеры во время переноса через мембрану, количественный FRET живых клеток был использован для характеристики организации pIgA-R и рецептора трансферрина (TFR) в эндоцитарных мембранах поляризованных клеток MDCK при интернализации донорного и акцепторного компонентов. меченые лиганды…

Мол. Биол. Клетка. 18: 2226-2243 (2007)

PDF

Локализация белок-белковых взаимодействий в живых клетках с использованием конфокальной и спектральной визуализации FRET-микроскопии
от Ye Chen & Ammasi Periasamy

РЕФЕРАТ: Микроскопия стала важным инструментом для исследования клеточных белков. Разработка новых флуоресцентных маркеров, таких как зеленые флуоресцентные белки, открыла значительные возможности для качественного и количественного мониторинга белок-белковых взаимодействий с использованием передовых методов флуоресцентной микроскопии, включая широкопольное, конфокальное, многофотонное, спектральное изображение, время жизни и корреляционную спектроскопию…

Indian J Exp. Биол., 45 (01): 48-57 (2007)

PDF

Мониторинг динамических взаимодействий белков с фотогашением FRET
Игнасио А. Демарко и соавт.

РЕФЕРАТ: Ядро клетки млекопитающих представляет собой динамическую и высокоорганизованную структуру. Большинство белков подвижны в ядерном компартменте, и эта подвижность отражает временные взаимодействия с хроматином, а также сетевые взаимодействия с множеством белковых партнеров.Чтобы изучить эти динамические процессы в живых клетках, мы разработали метод визуализации, который сочетает в себе фотоактивированный зеленый флуоресцентный белок (PA-GFP) и микроскопию флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET) ..

Природные методы 3 (7): 519-524 (2006)

PDF

Количественный анализ данных FRET на основе диапазона интенсивности для локализации белковых молекул в ядрах живых клеток
by Ye Chen & Ammasi Periasamy

РЕФЕРАТ: Фёрстеровский (флуоресцентный) резонансный перенос энергии (FRET) — идеальный метод для оценки расстояния между взаимодействующими белковыми молекулами в живых образцах с использованием микроскопии на основе интенсивности.Спектральное перекрытие донора и акцептора, необходимое для FRET, также приводит к искажению сигнала FRET ..

J. Флуоресценция. 16: 95-104 (2006)

PDF

Проблемы конфокальной микроскопии для количественного анализа FRET
Хорста Валлрабе и др.

РЕФЕРАТ: Ранее мы провели обширный количественный анализ данных резонансного переноса энергии (FRET) по Фёрстеру (или флуоресценции), чтобы показать, что полимерные рецепторы IgA и их лиганды группируются в эндоцитарных мембранах в процессе сортировки и транспортировки поляризованные клетки.Здесь мы используем аналогичную технику для анализа организации и распределения другого мембраносвязанного рецептора: рецептора трансферрина (TFR) и его лиганда, голо-трансферрина (Tfn), объясняя при этом пошаговые меры, которые необходимо предпринять для достижения успеха. количественный анализ данных FRET ..

Микроскопические исследования и методы. 69: 196-206 (2006)

PDF

Визуализация белковых молекул с использованием микроскопии FRET и FLIM
Horst Wallrabe & Ammasi Periasamy

РЕФЕРАТ: Фёрстеровский (или флуоресцентный) резонансный перенос энергии (FRET) и визуализация времени жизни флуоресценции (FLIM) занимают центральное место и все чаще становятся частью многогранных подходов к визуализации.Это дополнительные методологии, которые можно применять для расширенного количественного анализа …

Текущее мнение в области биотехнологии. 16: 19-27 (2005)

PDF

Конфокальная FRET-микроскопия для измерения кластеризации комплексов лиганд-рецептор в эндоцитарных мембранах
, Horst Wallrabe, et al.

РЕФЕРАТ: Динамика распределения белков в мембранах эндоцитов важна для многих клеточных процессов, таких как сортировка белков, биогенез органелл и микродоменов мембран, белок-белковые взаимодействия, функция рецепторов и передача сигналов…

Биофизический журнал 85: 559-571 (2003)

PDF

Освещение взаимодействия белков в ткани с использованием конфокальной и двухфотонной флуоресцентной резонансной микроскопии с переносом энергии
Джеймсом Д. Миллсом и соавт.

РЕФЕРАТ: Черепно-мозговая травма (ЧМТ) остается наиболее частой причиной смерти лиц моложе 45 лет в западном мире. Одним из основных факторов, определяющих заболеваемость и смертность после ЧМТ, является травматическое повреждение аксонов (TAI).Современные гипотезы о патогенезе TAI включают активацию апоптотических каскадов, вторичных по отношению к TBI. В то время как ряд исследований продемонстрировал прямые доказательства активации апоптотических каскадов в TAI, точный путь, по которому эти каскады инициируются, остается предметом интенсивных исследований ..

J. Biomed. Опт. 8: 347-356 (2003)

PDF

Одно- и двухфотонная флуоресцентная резонансная микроскопия с переносом энергии для установления кластерного распределения комплексов рецептор-лиганд в эндоцитарных мембранах
Horst Wallrabe, et al.

РЕФЕРАТ: Микроскопия с одно- и двухфотонным флуоресцентным резонансным переносом энергии (FRET) с использованием фильтров излучения с разной шириной полосы и нового алгоритма коррекции спектрального спилловера (алгоритм PFRET) обеспечивает основу для количественного подхода к измерению кластеризации рецепторов. в мембранах эндоцитов. Эмиссионные фильтры с более широкой полосой пропускания позволяют увеличить сигнал FRET и соответствующий побочный эффект ..

Дж Биомед. Опт.8 (3), 339-346 (2003)

PDF

Флуоресцентная микроскопия с резонансным переносом энергии (FRET), визуализация локализации белков живых клеток
Раджеш Бабу Секар и Аммаси Периасами

РЕФЕРАТ: Текущие достижения в области флуоресцентной микроскопии в сочетании с разработкой новых флуоресцентных зондов делают флуоресцентный резонансный перенос энергии (FRET) мощным методом изучения молекулярных взаимодействий внутри живых клеток с улучшенными пространственными (Ангстрем) и временными ( наносекунды), разрешение, диапазон расстояний и чувствительность, а также более широкий спектр биологических приложений….

Журнал клеточной биологии, том 160, номер 5, 3 марта 2003 г. 629-633
PDF; Приложение

Визуализация локальных белковых взаимодействий между Pit-1 и CCAAT / связывающим энхансером белком альфа (C / EBP?) В ядре живых клеток гипофиза
Ричард Н. Дэй и др.

РЕФЕРАТ: Белок гомеодомена (HD) Pit-1 взаимодействует с белком основной лейциновой молнии (b-ZIP) CCAAT / связывающим энхансером белком альфа (C / EBPα), чтобы контролировать ген гипофизарного пролактина (PRL). транскрипция.Ранее мы наблюдали, что C / EBPα концентрируется в областях центромерного гетерохроматина в клетках GHFT1-5 гипофиза и что коэкспрессируемый Pit-1 перераспределяет C / EBPα в субядерные сайты, занятые Pit-1 …

День и др. Пересмотренный ME 02-0136 (2003)
PDF

Наносекундная флуоресцентная резонансная передача энергии-микроскопия времени жизни флуоресценции для локализации белковых взаимодействий в отдельной живой клетке
Масиламани Элангован, Ричард Н.Day & Ammasi Periasamy

РЕФЕРАТ: Визуализация и количественная оценка белок-белковых взаимодействий — недавняя тенденция в области биомедицинской визуализации. Текущие достижения в области флуоресцентной микроскопии в сочетании с разработкой новых флуоресцентных зондов, таких как зеленые флуоресцентные белки, позволяют использовать резонансный перенос энергии флуоресценции (FRET) для изучения взаимодействия белков в живых образцах. FRET-микроскопия на основе интенсивности ограничена спектральным просвечиванием и концентрацией флуорофора…

J Микроскопия. 205: 3-14 (2002)

PDF

Характеристика микроскопии с одно- и двухфотонным возбуждением, флуоресцентной резонансной передачей энергии
, Masilamant Elangovan, et al.

РЕФЕРАТ: Достижения в области молекулярной биологии предоставляют различные методы для определения структуры и функции отдельных белков, которые образуют составные части субклеточных структур.Возможность увидеть динамическое поведение определенного белка внутри живой клетки стала возможной благодаря применению передовых методов микроскопии флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET) ….

Методы в печати (декабрь 2002 г.)
PDF

Флуоресцентная резонансная микроскопия передачи энергии локализованных взаимодействий белков в ядре живых клеток
Ричард Н. Дэй, Аммаси Периасами и Фред Шауфеле

РЕФЕРАТ: Клетки реагируют на сигналы окружающей среды, модифицируя белковые комплексы в ядре для изменения характера экспрессии генов.В этой статье мы рассмотрим методы, которые позволяют нам визуализировать эти белковые взаимодействия, как они происходят в живых клетках. Клонирование генов морских организмов, кодирующих флуоресцентные белки, дает возможность маркировать и контролировать внутриклеточное поведение экспрессируемых гибридных белков …

Методы 25, 4-18 (2001)
PDF

Флуоресцентная резонансная микроскопия с переносом энергии: мини-обзор
, Ammasi Periasamy

РЕФЕРАТ: Флуоресцентная микроскопия с резонансным переносом энергии (FRET) — лучший метод, чем дифракция рентгеновских лучей, ядерный магнитный резонанс или электронная микроскопия для изучения структуры и локализации белков в физиологических условиях.В этой статье мы описываем четыре различных метода световой микроскопии для визуализации взаимодействий фактора транскрипции CAATT / связывающего энхансера белка альфа (C / EBPa) в живых клетках гипофиза ..

Журнал биомедицинской оптики 6 (3) 28-291 (июль 2001 г.)
PDF

Визуализация взаимодействий белков Pit-1 в живых клетках
Аммаси Периасами и Ричард Н. Дэй

РЕФЕРАТ: Комбинированное использование микроскопии с флуоресцентным резонансным переносом энергии (FRET) и экспрессии генетических векторов, кодирующих белковые слияния с зеленым флуоресцентным белком (GFP) и синим флуоресцентным белком (BFP), обеспечивает исключительно чувствительный метод обнаружения взаимодействия. белковых партнеров в живых клетках….

Журнал биомедицинской оптики 3 (2), 154-160 (апрель 1998 г.)
PDF

Визуализация белковых взаимодействий в живых клетках с использованием цифровых изображений GFP и микроскопии FRET
Аммаси Периасами и Ричард Н. Дэй

РЕФЕРАТ: Определение того, когда и где определенные белки связываются друг с другом в живой клетке, имеет большое значение для многих биологов.С помощью традиционной флуоресцентной микроскопии белки, меченные различными флуофорами, могут быть локализованы в препаратах фиксированных или живых клеток ….

Методы клеточной биологии, Vol. 58 (1998)
PDF

Оценка степени молекулярного контакта между поверхностями целлюлозных волокон с помощью микроскопии FRET

Фёрстеровский резонансный перенос энергии (FRET)

Следующее краткое введение в теорию Фёрстера было взято из книги Б.W. Van der Meer (Meer 2013) и частично основан на оригинальных статьях Фёрстера. Эффективность передачи энергии между донорным и акцепторным красителем зависит от расстояния между двумя молекулами и, в принципе, определяется радиусом Ферстера (\ (\ text {R} _0 \)). Радиус Ферстера можно рассчитать для любой комбинации донорных и акцепторных молекул, как показано в дополнительной информации (Таблица S1). \ (\ text {R} _0 \) специфичен для каждой пары донор-акцептор в конкретной системе.6} \ end {align} $$

(1)

где r обозначает расстояние между донором и акцептором, а \ (\ text {R} _0 \) обозначает радиус Ферстера пары донор-акцептор. На практике эффективность FRET может быть измерена различными методами, которые могут быть реализованы либо в установках микроскопии, либо измерены с помощью спектрофотометрии, оба из которых были использованы в этой статье.

Независимо от метода измерения, процесс FRET может быть обнаружен по различным аспектам эффекта.FRET изменяет интенсивность излучения донора (гашение донора), интенсивность излучения акцептора (чувствительность акцептора), время жизни флуоресценции донора (измерения времени жизни) и поляризацию света (измерения анизотропии). Здесь мы использовали два из наиболее распространенных метода измерения FRET, а именно тушение донора (DQ) и акцепторную чувствительность (AS). Тушение донора измеряет уменьшение флуоресценции донора из-за FRET. Чувствительность акцептора измеряет увеличение флуоресценции акцептора из-за FRET.Хотя DQ является показателем для FRET, нельзя быть уверенным в этом, поскольку существуют другие механизмы, такие как гашение концентрации, которые могут дезактивировать возбужденный донор. AS, с другой стороны, предоставляет убедительные доказательства для FRET, поскольку флуоресценция акцептора может быть увеличена только за счет некоторого рода передачи энергии (Meer 2013). Отличный обзор реализации и подводных камней метода предоставлен Broussard et al. (2013). Здесь следует упомянуть одну важную часть использования FRET, чтобы тщательно проверить, действительно ли сигнал действителен, особенно когда спектроскопические данные недоступны.Это можно сделать, используя отрицательные контроли, динамический FRET или применяя более одного метода FRET.

Материалы

Красители 7- (диэтиламино) кумарин-3-карбогидразид (DCCH, Purity \ (95 {\%} \), CAS: 100343-98-4) и флуоресцеин-5-тиосемикарбазид (FTSC, Purity \ (99 {\%} \), CAS: 76863-28-0) были куплены у Santacruz Biotechnology. Растворители N, N-диметилформамид (DMF), тетрагидрофуран (THF) и ацетонитрил были приобретены в VWR. Все химические вещества использовались без дополнительной очистки.Поли (2-гидроксиэтилметакрилат) (pHEMA) для производства тонких пленок был приобретен у Sigma Aldrich. Модельные пленки наносились на фольгу из ПЭТФ. Используемая целлюлоза представляла собой небеленую крафт-целлюлозу из мягкой древесины промышленного производства.

Подготовка образцов

Для исследования волокон целлюлозы [беленая крафт-древесина, соотношение ель / сосна (90/10)] образцы готовили, как описано Thomson et al. (2007). Волокна окрашивали в 15 мл раствора любого из красителей в ДМФА (1 ммоль / л и 0.2 ммоль / л) в течение ночи при pH 5, регулируемом добавлением HCl. Красители образуют метастабильную связь с восстанавливающим концом молекулы целлюлозы, и при добавлении HCl это равновесие смещается в сторону метастабильных видов связи. После окрашивания к раствору немедленно добавляли боргидрат натрия \ (\ hbox {NaBH} _4 \) (0,02 ммоль \ (\ text {NaBH} _4 \) на 0,5 г волокон) и давали ему прореагировать в течение 1 часа. Боргидрат натрия приводит к восстановительному аминированию красителей с целлюлозой, что приводит к ковалентной связи между реагентами.После этого восстановительного аминирования образцы сначала промывали в ДМФ и снова промывали экстракцией Сокслета ацетонитрилом в течение не менее 4 часов для удаления любого нековалентно связанного красителя. Впоследствии окрашенные волокна хранили в водном буферном растворе с pH 9 с использованием буры 0,4 г / л. Волокнистые связки были приготовлены путем скрещивания одного окрашенного DCCH волокна и одного окрашенного FTSC волокна в капле воды (pH 9) и последующей их сушки в листообразователе Rapid Köthen. Затем для микроскопии связки волокон переносили на предметные стекла.Перекрестки волокон (отрицательный контроль для FRET) получали путем простого пересечения двух волокон и покрытия их покровным стеклом для микроскопии.

Модельные пленки были приготовлены методом докторблейдинга \ (500 \, {\ upmu} \ hbox {L} \) \ (10 {\%} \) pHema в растворе 95/5 EtOH / h3O, смешанном с растворенными красителями. в THF на полиэтиленовую пленку. Это привело к ок. \ (1.5 \, {\ upmu} \ hbox {m} \) толстая пленка. Для обеспечения щелочных условий к раствору добавляли объем \ (12 \, {\ upmu} \ hbox {L} \) триэтиламина. Фольга ПЭТ была очищена ацетоном перед нанесением лака.\ circ \ hbox {C} \) для \ (3 \, \ hbox {h} \) для установления контакта. Концентрации и применяемые методы измерения для образцов можно увидеть в Таблице 1.

Таблица 1 Концентрации и параметры для измерений FRET

FRET из спектрофотометрии

Спектры флуоресценции были записаны на RF-5301PC, спектрофлуорофотометре от Shimadzu. Эксперименты FRET проводились с концентрациями молекул, указанными в таблице 1. Также были приняты меры для минимизации воздействия окружающего света на любой из образцов, чтобы избежать фотообесцвечивания.Модельные пленки, с одной стороны, были исследованы с использованием этой установки флуорометрии, а с другой стороны, они были исследованы с помощью широкоугольного микроскопа с наборами фильтров, показанными в таблице 2. Спектры пленок pHema были записаны с использованием установки, показанной на рис. 3. Образцы исследовали под углом, который позволяет избежать обнаружения прямо отраженного света и измеряет только флуоресценцию, исходящую от образца.

Рис. 3

Установка для измерения пленок pHema во флуорометрии.В и настройка объясняется более подробно. Он был выбран таким образом, чтобы отраженный (REFL) луч, следующий за возбуждением (EX) образца, не попадал в детектор, и регистрировался только сигнал флуоресценции, испускаемый (EM) непосредственно от образца. a — c Образцы донора, акцептора и донора-акцептора, как они были исследованы

Эффективность передачи энергии FRET рассчитывается по измеренным спектрам и поясняется на рис.4. Из-за передачи энергии излучение донора гасится (\ (\ text {I} _ {DA} \)) по сравнению с нормальным излучением донора (\ (\ text {I} _ {D} \) ). Энергия, не испускаемая донором, затем передается акцептору и увеличивает (или сенсибилизирует) излучение (\ (\ text {I} _ {AD} \)) по сравнению с нормальной чувствительностью акцептора (\ (\ text {I}) _ {A} \)). Спектральное перекрытие, показанное на рис. 4, является необходимым требованием для FRET и в значительной степени определяет диапазон расстояний эффекта, как можно увидеть в уравнении.{1/6} $$

(2)

\ (\ text {R} _0 \) — радиус Ферстера, k — фактор ориентации, n — показатель преломления, (\ (\ text {Q} _ {D} \)) — квантовый выход донора и J интеграл перекрытия. Радиус Ферстера определяет расстояние передачи энергии, поскольку известно, что количественное определение FRET возможно только в пределах расстояний от \ ((\ frac {1} {2} — 2) \ text {R} _0 \), как также показано на рис. 2. Подробное описание того, как определить радиус Ферстера, можно найти в FRET — Förster Resonance Energy Transfer Мединца и Хильдебрандта (Meer 2013).

Рис. 4

Спектры возбуждения и излучения типичной донорно-акцепторной пары. FRET влияет на интенсивность излучения донора (тушение донора) и интенсивность излучения акцептора (чувствительность акцептора). Также показано спектральное перекрытие донорного излучения и спектра возбуждения акцептора.

Спектры флуоресцентного излучения DCCH и FTSC частично перекрываются, как показано на рис. 7. Следовательно, для точного измерения эффективности FRET спектры должны быть спектрально несмешанными.Для этого в спектрометре мы подгоняли пики излучения и использовали площадь под пиками как интенсивность подобранного сигнала. Практически это было сделано путем подгонки гауссовых пиков к зарегистрированным спектрам излучения чистого донорного образца (результат \ (\ text {I} _ {D} \)), чистого акцепторного образца (результат \ (\ text {I}) _ {A} \)) и образец, представляющий интерес (в результате были \ (\ text {I} _ {DA} \) и \ (\ text {I} _ {AD} \)), как на рис. 11. Полные параметры подгонки можно найти в дополнительной информации (рисунок S3 и таблица S2).Полученная информация об интенсивности использовалась с уравнениями. 3 и 4, чтобы получить эффективность FRET. Для тушения донора (уравнение 3) и акцепторной чувствительности (уравнение 4) использовались следующие уравнения.

$$ \ begin {выравнивается} \ eta _ {FRET} = 1 — \ frac {I_ {DA}} {I_D} \ end {выравнивается} $$

(3)

$$ \ begin {align} \ eta _ {FRET} = \ left (\ frac {I_ {AD}} {I_A} — 1 \ right) \ frac {\ epsilon _A} {\ epsilon _D} \ end { выровнено} $$

(4)

\ (\ epsilon _ {A} \) и \ (\ epsilon _ {D} \) — коэффициенты экстинкции акцептора и донора на длине волны возбуждения (Meer 2013; Clegg 1992, 1995).Отношение \ (\ frac {\ epsilon _ {A}} {\ epsilon _ {D}} \) было определено равным 0,02, и его можно найти в дополнительной информации (Таблица S1). Чувствительность акцептора и эмиссия донора схематически показаны на рис. 4.

FRET с помощью оптической микроскопии

Бумажные волокна были исследованы с использованием установки для широкопольной микроскопии (WM), оснащенной наборами фильтров, показанными в таблице 2. WM работал с Галогенная лампа 50 Вт и КМОП-детектор от QI Imaging (Optimos).

Таблица 2 Наборы фильтров, используемые для флуоресцентной микроскопии

Как интенсивность лампы, так и чувствительность детектора показывают зависимость от длины волны и были скорректированы путем расчета поправочных коэффициентов из спектра излучения лампы, сложенного с фильтрами возбуждения и коэффициентом экстинкции. и чувствительность детектора, сложенная с фильтрами излучения и спектрами излучения.Эти поправочные коэффициенты были применены к записанным изображениям, чтобы получить истинное представление об измеренной интенсивности.

Схематическое изображение окрашенных волокон и пленок pHema можно увидеть на рис. 5. Изображения имеют ложный цвет, чтобы подчеркнуть различия в волокнах / пленках. Образцы исследовались при увеличении в \ (400 \ раз \) для волокон и \ (50 \ раз \) в случае пленок. Чтобы минимизировать фоновый шум, микроскоп использовался в коробке, окруженной черной тканью.

Рис. 5

Ложные цветные изображения a a волоконного соединения и b a pHema пересечения, измеренного с помощью широкопольного флуоресцентного микроскопа. В b также показаны типичные области интереса для алгоритмов Xia. Области выбраны так, чтобы минимизировать рассеянный свет от другого волокна / пленки.

При использовании микроскопа спектральные характеристики используются для получения пространственной информации и теряются преимущества применения этого простого метода подбора, описанного выше.Здесь Гордон и др. Разработали сложный алгоритм, который приводит к полностью скорректированной оценке эффективности FRET. (1998). В методе используются изображения, записанные с помощью трех различных наборов фильтров из Таблицы 2 трех разных образцов. Обычно в результате получается всего девять изображений, но при расположении, показанном на рис.5, можно получить ту же информацию только из трех изображений вместо этого, поскольку на каждом изображении автоматически присутствует чистый донор, чистый акцептор и область FRET. включены.Подробное описание алгоритма см. В исходной статье (Gordon et al. 1998). Вкратце, этот метод вычисляет интенсивность FRET, скорректированную для всех возможных сценариев спектрального просвечивания, в соответствии со следующими уравнениями.

$$ \ begin {align} {\ overline {Afa}} = \ frac {Af — \ left (\ frac {Ad} {Fd} \ right) Ff} {1 — \ left (\ frac {Fa} { Aa} \ right) \ left (\ frac {Ad} {Fd} \ right)} \ end {align} $$

(5)

$$ \ begin {align} FRET1 = \ frac {\ left (Ff — \ left (\ frac {Fd} {Dd} \ right) Df — {\ overline {Afa}} \ left [\ left (\ frac {Fa} {Aa} \ right) — \ left (\ frac {Fd} {Dd} \ right) \ left (\ frac {Da} {Aa} \ right) \ right] \ right)} {G \ left [ 1 — \ left (\ frac {Da} {Fa} \ right) \ left (\ frac {Fd} {Dd} \ right) \ right]} \ end {align} $$

(6)

$$ \ begin {align} {\ overline {Dfd}} = Df + FRET1 \ left [1 — G \ left (\ frac {Da} {Aa} \ right) \ right] — {\ overline {Afa} } \ left (\ frac {Da} {Aa} \ right) \ end {align} $$

(7)

$$ \ begin {align} FRETN = \ frac {FRET1} {{\ overline {Afa}} * {\ overline {Dfd}}} \ end {выравнивается} $$

(8)

Уравнения состоят из переменных, состоящих из двух букв.Первая буква обозначает использованный набор фильтров, как показано в таблице 2, вторая буква — исследуемый образец (d = только донор, a = только акцептор, f = область FRET). Например. Следовательно, Af означает область FRET (связанная область), исследованная с помощью набора акцепторных фильтров. Переменные представляют собой измеренные значения интенсивности света из вышеупомянутых изображений микроскопа, записанные как 16-битные значения серого. \ ({\ overline {Afa}} \) относится к сигналу акцептора, который был бы, если бы не присутствовал донор и, следовательно, не возникла FRET.Точно так же \ ({\ overline {Dfd}} \) относится к донорскому сигналу, который был бы, если бы не присутствовал акцептор и, следовательно, не было бы FRET. На изображениях были выбраны интересующие области, как показано на рис. 5b. Оценка производилась по пикселям. G — фактор, связывающий потерю донорного сигнала с увеличением сигнала акцептора (см. Дополнительную информацию в таблице S3). В этой работе мы использовали несколько иной алгоритм Xia et al. который отличается только нормализацией значения \ (\ text {N} _ {\ text {FRET}} \), но в остальном эквивалентен алгоритму Гордона (Xia and Liu 2001).

$$ \ begin {выровнен} N_ {FRET} = \ frac {FRET1} {\ sqrt {{\ overline {Afa}} * {\ overline {Dfd}}}} [-] \ end {выровнен} $$

(9)

Рис. 6

Демонстрация анализа FRET пересечения волокон a a и b a. В и можно увидеть две типичные проблемы с анализом. Сначала высокий сигнал FRET часто обнаруживался на краях как области склеивания, так и волокон. Во-вторых, сильный ложноположительный сигнал FRET можно увидеть в области, которая явно не может показать FRET.На микроскопическом изображении можно увидеть метод эрозии, использованный для анализа.

Для возможности воспроизведения области молекулярного контакта был разработан метод, позволяющий всегда выбирать подходящую область. Метод состоял в том, чтобы вручную нарисовать ROI (интересующую область), захватывая «оптически связанную» область на рис. 6. Затем мы применили эрозию изображения, чтобы избежать краев и, таким образом, получили размытую область интереса (рис. 6, нижние изображения), которая затем использовали для оценки интенсивности FRET. Избегать краев было необходимо, потому что области экстремальной интенсивности, по-видимому, дают ложноположительный сигнал FRET.Кроме того, ложные срабатывания также были обнаружены в областях, на которых невозможно отобразить FRET, таких как область, показанная на фиг. 6a, которая не находится в связанной области.

Другие эксперименты FRET

Здесь следует упомянуть, что другие эксперименты FRET также использовались. Конфокальный лазерный сканирующий микроскоп (CLSM, Leica TCS SPE) с фотоумножителем от Hamamatsu был использован для исследования фотообесцвечивания акцептора и сенсибилизированного излучения акцептора в связях волокно-волокно. Идея заключалась в том, что благодаря превосходной настройке будет достигнуто лучшее соотношение сигнал / шум.

Разработка FRET позволяет визуализировать отдельные молекулы

Используя флуоресцентные маркеры, исследователи разработали резонансный перенос энергии Ферстера (FRET) для изображения сборки, функций и взаимодействий молекул.

Новый метод оптического изображения был разработан исследователями, использующими Фёрстеровский резонансный перенос энергии (FRET) для наблюдения за действующей отдельной молекулой, в Научном колледже Университета Клемсона, США, в сотрудничестве с учеными из Университета Генриха Гейне в Германии.

Команда предполагает, что их метод, основанный на флуоресценции, может ускорить развитие области структурной биологии, помогая исследователям лучше понять, как молекулы собираются, функционируют и взаимодействуют, что, в свою очередь, может помочь в разработке лекарств на основе структуры.

Ученые использовали FRET для изучения лизоцима бактериофага Т4, который, по их словам, лежит в основе основных этапов реакции биомолекулярных машин (ферментов).

«Наши исследования FRET демонстрируют необходимость третьего функционального состояния в известной кинетике Михаэлиса-Ментен», — сказал соавтор Клаус Зайдель, председатель Института молекулярной физической химии Университета Генриха Гейне.«Описание Михаэлиса-Ментен — одна из самых известных моделей кинетики ферментов».

Команда помогает создать базу данных, в которой их основанные на FRET структурные модели аналогичных биомолекулярных моделей могут быть сохранены и доступны другим ученым »

Центральным элементом этого инструмента визуализации является микроскоп на основе FRET, сложная и мощная машина, способная визуализировать биомолекулы размером всего несколько нанометров.

Чтобы увидеть биомолекулы в действии, команда поместила два флуоресцентных маркера на набор молекул, которые создали линейку на молекулярном уровне.Используя разные местоположения маркеров, команда собрала набор расстояний, которые описывают форму и форму наблюдаемой молекулы.

По сути, этот процесс генерировал набор точек данных, которые были обработаны с помощью вычислений, что позволило исследователям различать, как молекула выглядит и как она движется.

«Мы наблюдаем изменения в структуре, и поскольку наш сигнал зависит от времени, мы также можем получить представление о том, как молекула движется с течением времени», — сказал ведущий исследователь Хьюго Санабриа, доцент физики и астрономии в Клемсоне.

В исследовании Санабриа и его команда объединили микроскоп на основе FRET с молекулярным моделированием для изучения лизоцима, фермента, обнаруженного в слезах и слизи. Лизоцим разрушает защитные углеводные цепи, окружающие клеточную стенку бактерий. Ученые широко используют лизоцим для изучения структуры и функции белков, потому что это такой стабильный фермент.

«Мы можем отслеживать лизоцим бактериофага Т4, поскольку он обрабатывает свой субстрат на почти атомистическом уровне с беспрецедентным пространственным и временным разрешением», — сказал Санабриа.«Мы подняли область визуализации на совершенно новый уровень».

Новый оптический метод показал, что структура лизоцима отличается от ранее предполагавшейся. До сих пор ученые в основном определяли структуру белков, таких как лизоцим, в основном с помощью таких методов, как рентгеновская кристаллография, спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) и криоэлектронная микроскопия.

«Долгое время эта молекула считалась молекулой с двумя состояниями из-за того, как она получает субстрат или клеточную стенку бактерий-мишеней», — сказал он.«Однако мы определили новое функциональное состояние».

Команда помогает создать базу данных, в которой их основанные на FRET структурные модели аналогичных биомолекулярных моделей могут быть сохранены и доступны другим ученым. Они также работают над разработкой рекомендаций для микроскопии FRET вместе с другими учеными FRET.

«Этот оптический метод можно использовать для изучения сворачивания и неправильного сворачивания белков или любой структурной организации биомолекул», — сказал Санабриа.«Его также можно использовать для скрининга и разработки лекарств, что требует знания того, как выглядит биомолекула, чтобы лекарство нацелилось на нее».

«Эта работа является важной вехой в определении структуры с использованием FRET для картирования короткоживущих функционально релевантных состояний ферментов», — заключил Зайдель.

Исследование было опубликовано в Nature Communications.

Разное