ВАЗ 2104,2105 с двигателями 1.5, 1.5i, устройство 1.6i, обслуживание, диагностика, ремонт (PDF, 57MB)
Настоящая книга по ремонту классических вазонов семейства с полноцветной иллюстрацией.Процесс разборки и ремонта снабжен подробными фотографиями и комментариями. Книга предназначена для автолюбителей, своими силами служащими «Жигулям».

ВАЗ-2104,2105 и модификации Руководство по ремонту (PDF, 31МБ)
Руководство по обслуживанию и ремонту автомобилей «Жигули» четвертой и пятой моделей. Рассматривается ремонт на базе готовых запчастей, есть возможные неисправности и способы их устранения.
В руководстве описаны следующие автомобили:
— Седан ВАЗ-2105 с двигателем 1.Двигатель 3 л.
— Седан ВАЗ-21051 с двигателем 1,1 л.
— Седан ВАЗ-21053 с двигателем 1,5 л.
— Рамесажир «Универсал» на ВАЗ-2104 на базе 2105
— Универсал ВАЗ-21043 с двигателем 1,5 л.

Автомобили «Жигули» ВАЗ-2104, -2105, -2107 Устройство и ремонт (DJVU, 7MB)
Описание «Жигулей» четвертой, пятой и седьмой модели в объеме, достаточном для качественного ремонта. Возможные неисправности, пределы износа и допуски. Издание 3-е, первое издание вышло в 1989 году.Авторы В.А. Верчигора, А.П. Игнатов, К.В. Новокшонов, К.Б. Пятков, ред. Транспорт, 1996.

Руководство по ремонту и обслуживанию автомобилей семейства ВАЗ-2104, 2105 (ДЖВУ, 48МБ)
Очередная книга ВАЗ по ремонту. Предназначен для специалистов СТО и индивидуальных владельцев.

Руководство по ремонту и каталог деталей ВАЗ 2104, 2105. Официальное издание ОАО «АвтоВАЗ», Москва 2001 (DJVU, 14MB)
Наиболее полное пособие по ремонту автомобилей ВАЗ 2104, ВАЗ-2105 и их модификаций по материалам производителя АвтоВАЗ на вопросы устройства, обслуживания и ремонта.Может быть, послужит плюсом при подготовке специалистов на сотню. Это книга ВАЗа.

Альбомы на классические автомобили ВАЗ

Большой альбом ВАЗ-2103, ВАЗ-2106 и их модификации (PDF, 13MB)
Иллюстрированное многоразовое пособие знакомит читателя с общей компоновкой и устройствами основных узлов и механизмов автомобилей ВАЗ-2103 и ВАЗ-2106, и их модификации ВАЗ-21033, ВАЗ-21035, ВАЗ-21061, ВАЗ-21063, ВАЗ-21065. Художники Э. Брейкин, В.Ф. ермолин, Н.П.Омаков, В. Скребников.

Одним из самых популярных автомобилей, выпускаемых заводом ВАЗ, является Жигули пять , а именно ВАЗ 2105 «Жигули». С конвейера этот автомобиль вернулся в 1980 году. По своему формату «Вазовская пятерка» — заднеприводный четырехдверный седан, рассчитанный на пятерых пассажиров. Позже в основе этой модели появились не менее известные модели:

. — ВАЗ-2107. ;
— ВАЗ-2104 универсал.

Внешний вид автомобиля полностью соответствовал своему времени, а именно восьмидесятому.Кузов пятерки состоял из прямых линий, бампер из алюминия, объемные фары прямоугольной формы. Далее описывать внешние данные всем известной пятерки, смысла нет. Даже спустя более 30 лет этот автомобиль остается узнаваемым и популярным.

Изначально ВАЗ-2107 комплектовался карбюраторным двигателем объемом 1,3. Но были и комплектации двигателей с масляными фильтрами по типу 2101. Двигатели на этой модели постоянно модернизировались, делая их более мощными и бесконечными.

Технические характеристики ВАЗ-2105: Двигатель объемом 1,3 и мощностью 64 л.с. Размеры кузова снаружи следующие: длина — 4130 мм, ширина — 1620 мм, высота — 1446 мм. Дорожный просвет адаптирован к нашему бездорожью и составляет 17 сантиметров. Но багажник имеет не большой объем, всего 385 литров. Расход топлива в смешанном цикле — около 10 литров на 100км.

Модель ВАЗ-2105 полюбилась еще и за то, что она не совсем хороша в эксплуатации. Это позволяет сделать несложный ремонт и тюнинг своими руками.

Несмотря на частые ремонты и несоответствие стандартам современного автомобилестроения, ВАЗ-2105 остается одной из самых популярных моделей. Невысокая стартовая стоимость, простота ремонта и обслуживания делают эту модель правдой в народе.

Машины советского производства просты в эксплуатации и обслуживании. Ремонт ВАЗ 2105 можно провести в гараже. Речь идет не о капитальном ремонте, а о наладке и устранении неисправностей.

ВАЗ 2105 — советская модель малого класса.Впервые фиделайн появился в 1980 году. Последний автомобиль модели 2105 сошел с конвейера в сентябре 2012 года.

ВАЗ 2105 создан на базе итальянского автомобиля Fiat 124 1966 года выпуска.

Второе название Ваза 2105 — «Жигулевская пятерка». После распада СССР модель была переименована в LADA 2105.

ВАЗ 2105 был представлен в большом количестве модификаций. Производители изготовили версию модели для служб безопасности и для участия в митинге.

Технические характеристики

ВАЗ 2105 — доработанная модель ВАЗ 2101. Кузов и подвесные детали позаимствованы у прародителя 2105. Остальные узлы прошли доработку.

Салон

Элементы салона выполнены из некачественного пластика. Автовладельцы жалуются на появление сверчков. Внутри салона мало — троим на заднем сиденье будет тесно. За 30 лет производители не внесли существенных изменений во внутреннее устройство автомобиля.

Низкая шумоизоляция. В машине гудит работающий мотор.

Двигатель

Производители предлагали две версии двигателей:

• 1,5-литровый силовой агрегат мощностью 72 л. из.;
• 1,3-литровый силовой агрегат 64 л. из.

1,3-литровым двигателем комплектовали экспортные автомобили ВАЗ 2105. Для внутреннего рынка производители выпускали модель всего с 1,5-литровым силовым агрегатом.

Двигатель унаследовал блок цилиндров от ВАЗ-2101.Производители отказались от использования цепи и оснастили распредвал с приводом от двигателя. Модификация снизила шумность силового агрегата. Но полностью проблему не устранил.

Подвеска

Дизайн ВАЗ-2105 копия всей ВАЗской «классики». Передняя подвеска — двойная, задняя — неразрезной мост. За 30 лет выпуска глобальных апгрейдов основы конструкции не заложили.

ВАЗ-2105 сохранил недостатки «классики».

Коробка передач

Изначально модель выпускалась с 4-ступенчатой ​​механикой. Более поздние модели стали набирать 5-ступенчатую МКПП — положительно сказалось на расходе топлива.

Тюнинг

Любители отечественного автопрома тюнингуют ВАЗ 2105. Дорабатываем заводские неисправности и меняем внешний вид с помощью воздушных змеев, покраски авто, подсветки.

Технический тюнинг можно сделать и без сотки. Заменен поршень и сцепление, подбор передаточного числа в коробке.Увеличивают жесткость подвески и могут быть заменены амортизационные пружины и рычаги.

После изменения технических показателей ВАЗ-2105 необходимо доработать тормозную систему автомобиля — обновить тормозные колодки, задние суппорты.

Книга из серии самостоятельных полноцветных иллюстрированных руководств по ремонту автомобилей. В инструкции показаны особенности конструкции узлов и систем автомобилей ВАЗ-2104, -2105. Подробно описаны основные неисправности, их причины и способы устранения.Процессы разборки и ремонта иллюстрированы и снабжены комментариями. Отдельный раздел посвящен особенностям ремонта автомобилей с двигателями, оснащенными системой впрыска топлива. В приложениях представлены инструменты, смазочные материалы и эксплуатационные жидкости, неровные уплотнения, подшипники, моменты затяжки резьбовых соединений, а также электрооборудование. Книга рассчитана на водителей, желающих отремонтировать машину своими силами, а также на сотню рабочих.

На нашем сайте вы можете скачать книгу «ВАЗ-2104, -2105 с моторами 1.5; 1.5i; 1.6i. Устройство, обслуживание, диагностика, ремонт: «Иллюстрированное руководство» бесплатно и без регистрации в формате FB2, RTF, EPUB, PDF, TXT, прочтите книгу онлайн или купите книгу в интернет-магазине.

Какой из них вам подходит? — Ключ

13 октября 2014 г.

Когда вы покупаете подержанные автомобили в нашем автосалоне в Оклахома-Сити, покупайте здесь, платите здесь, вам придется принять решение: , должен ли я получить автомобиль с автоматической коробкой передач или с механической коробкой передач? Хотя автоматика гораздо более популярна в Соединенных Штатах, и руководства, и автоматика имеют свои преимущества.Знание этих преимуществ поможет вам выбрать правильный подержанный автомобиль из нашей партии подержанных автомобилей в Оклахома-Сити.

Механическая коробка передач

Скорее всего, вы знаете хотя бы одного человека, который все еще водит механическую коробку передач, потому что «они просто лучше, чем автомат». Хотя руководства действительно имеют некоторые преимущества перед автоматическими коробками передач, их также окружают некоторые мифы и заблуждения.

Преимущество №1: меньше обслуживания

Одно из самых больших преимуществ механических коробок передач по сравнению с автоматикой состоит в том, что они механически проще.Это означает, что они требуют меньше работы для обслуживания и дешевле ремонтировать, если что-то пойдет не так.

Самый распространенный ремонт, необходимый для механических трансмиссий, — это замена диска сцепления. Сцепление — это соединение между двигателем и трансмиссией, и оно постепенно ухудшается при частом использовании и со временем. Ремонт или замена сцепления обычно стоит от 500 до 1500 долларов, в зависимости от степени повреждения системы или необходимости замены каких-либо других деталей.

Напротив, автоматические коробки передач намного дороже ремонтировать, если что-то пойдет не так.Современная автоматика использует сложную комбинацию электроники, гидравлики и механических соединений для обеспечения питания колес — эта обширная статья HowStuffWorks [ссылка: http://auto.howstuffworks.com/automatic-transmission.htm] дает хороший обзор сложность автоматических трансмиссий. Поскольку они намного сложнее, их ремонт и обслуживание также обходятся гораздо дороже: восстановление автоматической коробки передач может стоить от 3000 до 5000 долларов.

Преимущество 2: лучшая экономия топлива (обычно)

В целом, автомобиль с механической коробкой передач расходует больше бензина, чем с автоматической коробкой передач.Руководства, поскольку они проще, передают мощность от двигателя на колеса более эффективно, чем автоматика. Диск сцепления с механической коробкой передач обеспечивает лучшее соединение с двигателем, позволяя передавать больше мощности на дорогу с меньшими потерями. Это, в свою очередь, означает, что двигателю не нужно работать так тяжело, чтобы автомобиль двигался, что приводит к большей экономии топлива.

Тем не менее, некоторые современные автомобили меняют эту тенденцию: многие новые автоматические трансмиссии на самом деле более эффективны, чем механические.Эта высокотехнологичная автоматика обычно устанавливается на экологически чистые автомобили и внедорожники. В конце концов, если вы хотите максимально использовать пробег на своем подержанном автомобиле, обязательно сравните ручную и автоматическую версии, чтобы увидеть, какая из них работает лучше всего.

Преимущество № 3: Руководства делают вас более внимательными

Наконец, у руководств есть еще одно чуть менее ощутимое преимущество: они делают вас более внимательным водителем. Поскольку вам нужно обращать внимание на то, что делают двигатель и трансмиссия, вы не сможете «выйти из зоны» и ехать на автопилоте.

Это не означает, что руководства обязательно более безопасны — существуют исследования, которые показывают, что и руководства, и автоматика более подвержены несчастным случаям. Однако нельзя утверждать, что механическая трансмиссия оставляет меньше места для отвлечения внимания и требует большего участия от водителя.

Недостаток 1: сложнее использовать

Итак, если их легче обслуживать и они имеют больший пробег, почему большинство людей избегают автомобилей с ручным управлением? Главный фактор в том, что ими просто не так легко управлять, особенно если вы живете в городе или в другом месте с интенсивным движением.Плавное переключение передач требует практики и терпения, и даже тогда они могут быть утомительными при движении в пробке или на малых скоростях с частыми остановками.

Этот недостаток исчезает по мере того, как вы учитесь эффективно работать с руководством, но для начинающих водителей он может стать серьезным камнем преткновения. Если вы часто ездите в пробке или много бегаете в местах со знаками остановки или светофорами, руководство может оказаться не очень привлекательным.

Недостаток 2: реже

Если вашим автомобилем должен управлять кто-то другой, серьезной проблемой может стать механическая коробка передач.Почему? Скорее всего, другой человек не знает, как с этим работать. В США менее 7% всех проданных в 2014 году автомобилей были оснащены механическими коробками передач. Хотя число водителей, которые могут использовать руководство, несомненно, больше, чем это, по-прежнему составляет значительное меньшинство всех водителей на дороге.

Другими словами, если вы планируете приобрести автомобиль с механической коробкой передач, вы должны знать, что вы принадлежите к крайне малочисленному меньшинству. Вполне вероятно, что многие люди, от друзей и соседей до механиков в магазине смазочных материалов, не знают, как водить вашу машину.

Автоматические коробки передач

В отличие от механических коробок передач, автоматические коробки передач гораздо более распространены и популярны у большинства покупателей новых и подержанных автомобилей. У них также есть несколько преимуществ, которые водители могут оценить по сравнению с руководствами.

Преимущество №1: проще использовать

Самым большим преимуществом автоматических трансмиссий является то, что они проще в управлении и требуют меньше усилий. Поскольку их не нужно постоянно контролировать и переключать, автоматическую коробку передач намного проще вести в пробке.У автоматики также нет проблем со стартом в гору или откатом назад с остановки.

Благодаря этому, автоматика облегчает всем процесс обучения вождению и передвижению. Если ваша главная забота при покупке подержанного автомобиля в Оклахома-Сити — просто добраться с места на место, возможно, вам подойдет автомат.

Преимущество № 2: отсутствие сцепления

Автоматика не только упрощает работу, но и избавляется от самой утомительной части механических трансмиссий: педали сцепления.Поскольку сцепление является единственным связующим звеном между двигателем и трансмиссией, требуется определенное усилие, чтобы выключить его, нажав на педаль. Автомобили с тяжелыми педалями сцепления могут быть утомительными и трудными для управления. Их использование требует больших усилий, особенно в пробках.

В отличие от этого, автоматика не имеет педали сцепления и, таким образом, избавляет вас от усилий по ее эксплуатации. Это может показаться вопросом удобства, но на самом деле педаль сцепления была связана с некоторыми негативными физическими эффектами.Длительное использование тяжелого сцепления вызывает нагрузку на суставы и мышцы. Со временем это может перерасти в стойкую болезненность или другие физические проблемы. Автоматика полностью обходит эти проблемы.

Преимущество № 3: Лучшее ускорение и крутящий момент

Если вы не опытный гонщик, вы, вероятно, добьетесь лучших результатов на машине с автоматической коробкой передач, чем с механической коробкой передач. Это происходит по двум причинам: автоматика переключается быстрее и плавнее, чем руководство, и она вырабатывает больший крутящий момент на более низких оборотах.

Идея о том, что автоматика работает быстрее, чем руководства, в лучшем случае спорна. Многим опытным водителям нравится думать, что они могут заменить автомат. На старых и менее продвинутых машинах они могли быть правы. Однако в современной более совершенной автоматике соревнования просто нет. В конце концов, есть причина, по которой многие производители роскошных и высокопроизводительных автомобилей, такие как Porsche, Mercedes, BMW, Ferrari и Lamborghini, предлагают в своих новых автомобилях автоматику с двойным сцеплением и подрулевые лепестки переключения передач.

Кроме того, автоматика производит больший крутящий момент — вращающую силу, приводящую в движение колеса — при более низких оборотах, чем ручные. Это связано с тем, как устроен автомат. Вместо сцепления двигатель и трансмиссия соединены вместе с гидротрансформатором — гидравлической муфтой, которая позволяет двигателю работать, когда автомобиль стоит на месте. Когда двигатель ускоряется, гидротрансформатор увеличивает крутящий момент, доступный для колес, что делает двигатель сильнее. Это делает автоматику предпочтительной для буксировки тяжелых грузов или для быстрого ускорения — например, большинство драгрейсеров используют автоматику.

Недостаток 1: более сложный

Как мы уже отмечали выше, автоматические трансмиссии представляют собой очень сложные механизмы с десятками или даже сотнями движущихся частей. Это делает ремонт более дорогим и трудоемким.

Также автоматические трансмиссии требуют более регулярного обслуживания. Если у вас есть автомобиль с автоматической коробкой передач, вам следует регулярно проверять трансмиссионную жидкость, чтобы убедиться, что в машине достаточно для правильной работы. Эксплуатация вашего автомобиля с маслом с низким содержанием трансмиссии может привести к сгоранию трансмиссии, о чем вы и ваш кошелек наверняка пожалеете.

Недостаток 2: отсутствие торможения двигателем

Одна замечательная вещь в руководстве, с которой не может справиться автоматика, — это торможение двигателем. Это метод, используемый водителями для управления своей скоростью, просто переключая передачи, а не нажимая на тормоза. Поскольку руководства предлагают прямую механическую связь между колесами и двигателем, вы можете фактически использовать двигатель, чтобы замедлить автомобиль с более высоких оборотов, переключаясь с пониженной передачи на более низкую передачу.

предлагает меньше возможностей для торможения двигателем.В какой-то степени они могут это сделать, но системы повышающей передачи и отсутствие прямого сцепления делают это менее эффективным и практичным. Со временем это означает больший износ тормозов и снижение точности на поворотах.

Недостаток 3: меньше удовольствия

Одна вещь, которую вы будете слышать снова и снова о споре о механической и автоматической трансмиссии, заключается в том, что водить автомобили с механической коробкой передач просто веселее. Хотя они не так практичны, как их автоматические собратья, руководства более интересны. Они полностью вовлекают водителя в процесс вождения.С другой стороны, автоматика держит вас на расстоянии вытянутой руки от действия. Если вы хотите получить удовольствие от вождения, руководство — единственный выбор.

Независимо от того, какой автомобиль вы ищете, вы сможете найти его в нашем представительстве , Оклахома-Сити, заплатите здесь, заплатите здесь . В KEY представлено огромное количество популярных подержанных автомобилей от крупных производителей, поэтому вы сможете найти идеальный автомобиль для вашей личности и вашего бюджета. Приходите к нам сегодня, чтобы проверить наш инвентарь, или получите предварительное подтверждение онлайн менее чем за две минуты!

Металлопротеаза SPRTN / DVC1 управляет репликационно-связанной репарацией перекрестных связей ДНК-белок

Резюме

Цитотоксичность перекрестных связей ДНК-белок (DPC) в значительной степени приписывается их способности блокировать развитие репликации ДНК.DPC часто возникают в клетках либо в результате метаболизма, либо в результате воздействия экзогенных агентов, но механизм репарации DPC до конца не изучен. Здесь мы характеризуем SPRTN как специализированную ДНК-зависимую и связанную с репликацией ДНК металлопротеиназу для репарации DPC. SPRTN расщепляет различные ДНК-связывающие субстраты во время S-фазы прогрессирования и, таким образом, защищает пролиферативные клетки от токсичности DPC. Клетки пациентов с синдромом Руйса-Альфа (RJALS) с моногенными и двуаллельными мутациями в SPRTN являются гиперчувствительными к агентам, индуцирующим DPC, из-за дефекта в развитии вилки репликации ДНК и неспособности устранить DPC.Мы предполагаем, что протеаза SPRTN представляет собой специализированный путь репарации DPC, связанный с репликацией ДНК, необходимый для прогрессирования репликации ДНК и стабильности генома. Дефектный SPRTN-зависимый клиренс DPC является молекулярным механизмом, лежащим в основе RJALS, а DPC вносят вклад в ускоренное старение и рак.

Ключевые слова: SPARTAN / DVC1, ДНК-зависимая металлопротеиназа, репарация перекрестных связей ДНК-белок, репликация ДНК, синдром Руйса-Альфа / СПАРТАНЦА, рак, старение

Введение

Многочисленные эндогенные и экзогенные факторы постоянно атакуют геном, вызывая разнообразие химически различных повреждений ДНК (Lindahl, 1993).Если такие повреждения ДНК не восстанавливать, они приводят к нестабильности генома и гибели клеток (Jackson and Bartek, 2009). Клетки развили множество путей репарации ДНК, специализирующихся на различных типах повреждений ДНК (Friedberg et al., 2006, Lindahl and Wood, 1999). Сшивки ДНК-белок (ДПК) представляют собой пока еще недостаточно изученный тип повреждения ДНК, вызванный ковалентным присоединением белков к азотистым основаниям, сахару или разорванным фосфодиэфирным связям в основной цепи ДНК (Ashour et al., 2015, Tretyakova et al., 2015).Очень мало известно о том, как клетки удаляют DPC и восстанавливают вызванные DPC повреждения ДНК (Barker et al., 2005, Connelly and Leach, 2004, Stingele and Jentsch, 2015, Tretyakova et al., 2015). DPC индуцируются химическими реакциями, катализируемыми продуктами клеточного метаболизма, такими как альдегиды, или экзогенными источниками, включая УФ-свет и ионизирующее излучение (Ide et al., 2011, Shi et al., 2004). Практически любой белок в непосредственной близости от ДНК может образовывать неферментативный DPC в присутствии сшивающего соединения, такого как формальдегид (FA) (Shoulkamy et al., 2012). DPC также индуцируются ферментативно, когда определенные ДНК-связывающие ферменты образуют временные ковалентные взаимодействия с ДНК во время их физиологических реакционных циклов. Наиболее изученными ферментативными DPC являются топоизомеразы 1 и 2α (Topo1 и Topo2α), известные как комплексы расщепления Topo1- или Topo2α (Topo-ccs) (Ashour et al., 2015, Maede et al., 2014). Topo1-ccs или Topo2-ccs удаляются тирозил-ДНК фосфодиэстеразой-1 или -2 (TDP1 или TDP2) после протеолиза Topos на небольшие пептидные фрагменты (максимум 15–108 аминокислот) неизвестным механизмом (Debéthune et al., 2002, Интерталь и Шампу, 2011). Это указывает на существование протеазы, которая обрабатывает Topos выше TDP1 или 2 (Zhang et al., 2006). Несмотря на частое появление эндогенных неферментативных и ферментативных DPC в клетках, механизм удаления DPC все еще в значительной степени неизвестен (Ide et al., 2015).

Исследования на бактериях, дрожжах и высших эукариотах предполагают, что в удалении DPC участвуют несколько канонических путей репарации ДНК, включая эксцизионную репарацию нуклеотидов, гомологичную рекомбинацию и путь репарации анемии Фанкони вместе с протеасомозависимой деградацией белка (Barker et al. ., 2005, де Грааф и др., 2009, Накано и др., 2007, Салем и др., 2009). Недавно было показано, что дрожжевая ДНК-зависимая протеаза Wss1 (слабый супрессор smt3) защищает дрожжевые клетки от FA-индуцированной токсичности и, в координации с Tdp1, обрабатывает Topo1-ccs (Stingele et al., 2014).

В настоящее время нам неизвестны какие-либо специализированные пути репарации DPC у многоклеточных животных, хотя удаление DPC важно для прогрессирования репликационной вилки ДНК (Kuo et al., 2007, Reardon et al., 2006). Недавние биохимические данные в экстракте яиц Xenopus продемонстрировали, что удаление DPC связано с репликацией ДНК протеасомно-независимым, но зависимым от протеаз образом образом (Duxin et al., 2014). Однако протеаза, необходимая для удаления DPC во время репликации ДНК, оставалась неизвестной (Duxin and Walter, 2015, Reardon et al., 2006).

Синдром Руйса-Алфса (RJALS), также известный как СПАРТАНСКИЙ синдром, представляет собой аутосомно-рецессивное заболевание человека, характеризующееся хромосомной нестабильностью, преждевременным старением и ранним началом гепатоцеллюлярной карциномы у детей. RJALS вызывается моногенными и двуаллельными мутациями в SPRTN ( DVC1 ), а единственная миссенс-мутация в предполагаемом домене SprT металлопротеазы (SPRTN ^Y117C ) является патогенной и ответственна за преждевременное старение и рак печени у людей (Lessel et al. al., 2014, Рамадан и др., 2016). В то время как роль C-концевых доменов SPRTN была подробно охарактеризована в синтезе ДНК трансформации и привлечении к очагам повреждения ДНК, функция домена SprT, локализованного в N-концевой части, полностью неизвестна (Centore et al., 2012, Davis et al., 2012, Ghosal et al., 2012, Mosbech et al., 2012). На клеточном уровне клетки RJALS испытывают стресс репликации ДНК, в частности более медленную репликацию и повышенное количество остановившихся вилок и двухцепочечных разрывов ДНК (Lessel et al., 2014).

Учитывая важность SPRTN для стабильности генома и тот факт, что биоинформатический анализ предполагает, что SPRTN и дрожжевая протеаза Wss1 отдаленно связаны с семейством металлопротеаз Zinicin (Stingele et al., 2015), мы спросили, является ли SPRTN металлопротеиназа, отвечающая за восстановление ЦОД.

Здесь мы показываем, что SPRTN является ДНК-зависимой протеазой, которая защищает пролиферативные клетки человека от токсичности DPC. SPRTN связывается с механизмом репликации ДНК и удаляет DPC во время синтеза ДНК, и, таким образом, RJALS вызывается дефектом в репарации DPC.В целом мы определили механизм удаления DPC из хроматина в клетках человека и подчеркнули важность этого механизма для стабильности генома и его значимость для патогенеза человека при ускоренном старении и канцерогенезе.

Результаты

SPRTN предотвращает накопление эндогенных перекрестных связей ДНК-белок

Чтобы исследовать роль SPRTN в репарации DPC, мы выделили общую геномную ДНК из клеток HeLa и проанализировали количество DPC, используя быстрый подход к восстановлению аддуктов ДНК (RADAR) в сочетании с SDS-PAGE / окрашиванием серебром (A) (Kiianitsa and Maizels, 2013).Выделение ДНК в жестких денатурирующих условиях позволяет нам обнаруживать исключительно белки, сшитые с ДНК (DPC). Изоляты DPC количественно определяли по общему количеству ДНК, чтобы гарантировать равное количество ДНК для анализа DPC, а затем обрабатывали бензоназой для удаления всей ДНК и РНК перед детектированием с помощью SDS-PAGE / окрашивания серебром. Обработка протеиназой К DPC, обработанных бензоназой, подтверждает специфичность окрашивания белка методом окрашивания серебром (рис. S1A). Кроме того, обработка клеток известными агентами, индуцирующими DPC, FA, камптотецином (CPT) или этопозидом (ETO), как и ожидалось, вызывает огромное накопление общих (B) или специфических DPC (рисунок S1B).

SPRTN предотвращает накопление перекрестных связей между базальными ДНК и белками

(A) Схема протокола выделения DPC (RADAR).

(B) Накопление DPC в клетках HeLa после обработки FA (2,5 мМ, 30 мин).

(C) Дефицит SPRTN приводит к накоплению DPC (окрашивание серебром). Показаны профили количественной оценки и клеточного цикла (правые изображения).

(D) Количественное определение изолятов DPC методом осаждения SDS / KCl.

(E) Схема доменов белка SPRTN и предполагаемого активного сайта протеазы.

(F) Схема двуаллельных мутаций SPRTN у пациентов с RJALS.

(G) Общие уровни DPC после эктопической экспрессии SPRTN WT или E112A в Δ-SPRTN клетках HeLa и соответствующая количественная оценка. цельноклеточный экстракт: WCE.

(H) Общие уровни DPC в LCL пациентов с RJALS из семьи B (два пациента; B-II: 1 и B-II: 4) и контрольных LCL (CTR). Показаны профили количественной оценки и клеточного цикла (правое изображение). Среднее ± SEM, n = 3.

См. Также рисунок S1.

Количественный анализ общего количества DPC путем окрашивания серебром в различных клеточных линиях (HeLa, HEK293 и T24) показал, что истощение SPRTN приводит к 2-5-кратному увеличению общего количества белков, ковалентно связанных с ДНК (Рисунки S1C и S1D и данные не показаны).Сходным образом, созданные CRISPR / Cas9 клетки HeLa с частичным нокаутом SPRTN (Δ-SPRTN, Figures S1E – S1G) показали 3–4-кратное увеличение общего количества DPC (C). Накопление DPC, наблюдаемое в Δ-SPRTN клетках, было дополнительно подтверждено анализом преципитации SDS / KCl, косвенным методом выделения DPC (D). Увеличение количества DPC в SPRTN-дефицитных клетках не было связано с различиями в стадиях клеточного цикла (C, S1C и S1D). Чтобы исследовать, играет ли предполагаемый протеазный домен в SPRTN роль в удалении DPC, мы эктопически экспрессировали SPRTN дикого типа (SPRTN ^WT ) или E112A (SPRTN ^E112A ), вариант, содержащий замену глутаминовой кислоты на аланин в прогнозируемой активный центр протеазы (HEXXH, H; гистидин, E; глутаминовая кислота, X; и любая аминокислота; E) в Δ-SPRTN клетках HeLa.Сверхэкспрессия SPRTN ^WT , но не SPRTN ^E112A , полностью спасала базальное накопление DPC (G, сравните дорожки 3 и 4). Чтобы выяснить, являются ли линии лимфобластоидных клеток (LCL) RJALS с моногенными и двуаллельными мутациями в SPRTN (F; SPRTN-ΔC / SPRTN ^Y117C ) также недостаточны в удалении DPC, мы выделили и проанализировали общее количество DPC в этих клетках (H ). Клетки RJALS показали увеличение общего количества DPC в 1,5–2 раза по сравнению с контрольными LCL (H, сравните дорожку 1 с дорожками 2 и 3).

Пути эксцизионной репарации нуклеотидов (NER) и гомологичной рекомбинации (HR) также участвуют в репарации DPC. Однако истощение основных компонентов NER (XPC) и HR (MRE11) малой интерферирующей (si) РНК не привело к увеличению общего количества DPC (рисунок S2A). Точно так же нарушение пути репарации межцепочечных сшивок ДНК, анемия Фанкони, из-за истощения FANCD2 не вызывало накопления DPC по сравнению с контрольными клетками (фигура S2A). В целом, эти результаты показывают, что SPRTN является основным игроком, участвующим в удалении DPC, и, более конкретно, что его предполагаемый активный остаток металлопротеазы (E112) важен для удаления эндогенно возникающих DPC в пролиферативных клетках человека.

RJALS и истощенные SPRTN клетки гиперчувствительны к агентам, индуцирующим DPC

Мы также спросили, являются ли LCL пациентов RJALS и истощенные siRNA SPRTN клетки HeLa гиперчувствительными к агентам, индуцирующим DPC. Мы использовали FA и метилглиоксаль, которые индуцируют общие DPC (B и данные не показаны), а также CPT и ETO, которые индуцируют специфические ферментативные DPC (рисунок S1B). И клетки пациента RJALS (A), и клетки с истощенным SPRTN (B и S2B) были гиперчувствительны к агентам, индуцирующим DPC. Чтобы проанализировать, как отдельные мутации SPRTN, обнаруженные у пациентов с RJALS, влияют на чувствительность клеток к агентам, индуцирующим DPC, мы создали индуцируемые доксициклином (DOX) и стабильные линии клеток Flp-In HeLa, экспрессирующие ферментативный мертвый белок (E112A) дикого типа (WT), и варианты пациента SPRTN (C – 2H и S2C – S2F).Эктопическая экспрессия SPRTN ^WT , где эндогенный SPRTN был истощен siRNA, нацеленной на 3′-UTR транскриптов SPRTN, спасал гиперчувствительность SPRTN-истощенных клеток к FA (D) или CPT (рисунок S2C). Напротив, сверхэкспрессия SPRTN ^E112A или варианта пациента SPRTN ^Y117C не способна избавить от гиперчувствительности к FA (E и 2F, соответственно) или CPT (рисунки S2D и S2E, соответственно). Эктопическая экспрессия усеченного варианта пациента SPRTN-ΔC, который все еще содержит интактный предполагаемый домен металлопротеазы, частично устраняет гиперчувствительность к FA (G) или CPT (рисунок S2F).Обе мутации пациента обладают дефектной способностью защищать клетки от DPC, хотя SPRTN-ΔC в меньшей степени, поскольку LCL RJALS гиперчувствительны к агентам, индуцирующим DPC (A).

RJALS и SPRTN-истощенные клетки гиперчувствительны к DPC-индуцирующим агентам

(A) Анализы жизнеспособности клеток RJALS (B-II: 1 и B-II: 4) и контрольных (CTR) LCL после обработки указанными химическими веществами.

(B) Анализ клоногенной выживаемости контрольных siRNA (CTR) или клеток HeLa, истощенных siRNA SPRTN, после обработки указанными химическими веществами.

(C) Схема экспериментальной установки для анализа клоногенной выживаемости в клеточных линиях HeLa, индуцируемых доксициклином (+ Dox) SPRTN Flp-In.

(D – G) Эктопическая экспрессия SPRTN ^WT (D), SPRTN ^E112A (E), SPRTN ^Y117C (F) и SPRTN-ΔC (G) после истощения эндогенного SPRTN.

(H) Вестерн-блоттинг (WB) демонстрирует истощение и / или сверхэкспрессию SPRTN. Среднее ± SEM, n = 3.

См. Также рисунок S2.

Затем, чтобы выяснить, вызвана ли цитотоксичность, наблюдаемая в SPRTN-дефицитных клетках, накоплением DPC, мы совместно истощили Topo1 и SPRTN и контролировали выживаемость клеток после лечения CPT.Совместное истощение Topo1 полностью спасло чувствительность к CPT в SPRTN-истощенных клетках (рисунок S2G), подтверждая, что CPT-индуцированная токсичность в SPRTN-истощенных клетках обусловлена ​​накоплением Topo1-ccs. Совместное истощение TDP1, ключевого игрока в удалении Topo1-cc, не приводит к дальнейшей гиперчувствительности SPRTN-истощенных клеток к CPT, предполагая, что оба белка работают по одному и тому же пути (рис. S2H).

Известно, что путь анемии Фанкони защищает от токсичности, вызванной формальдегидом. Как и ожидалось, инактивация пути анемии Фанкони истощением миРНК FANCD2 вызывает гиперчувствительность клеток к лечению FA, но не к лечению CPT (рисунок S2I).Это также свидетельствует о том, что путь анемии Фанкони строго участвует в репарации перекрестных связей между нитями ДНК (также индуцированных обработкой FA), но не в перекрестных связях ДНК-белок (например, удаление специфического DPC, индуцированного CPT). В целом эти результаты предполагают, что SPRTN формирует уникальный путь репарации ДНК для удаления DPC.

SPRTN представляет собой ДНК-зависимую металлопротеазу

В результате интенсивной работы нескольких лабораторий не удалось идентифицировать активность протеазы SPRTN (Davis et al., 2012, Kim et al., 2013, Mosbech et al., 2012). Наши результаты заставили нас переоценить опубликованные данные и исследовать, действительно ли SPRTN является протеазой. С этой целью мы очистили SPRTN ^WT , SPRTN ^E112A , два варианта пациентов (SPRTN ^Y117C и SPRTN-ΔC) и несколько вариантов SPRTN, усеченных на С-конце, с использованием системы экспрессии белка E. coli .

Учитывая, что домен SprT классифицируется как предполагаемый домен металлопротеиназы, мы сначала проанализировали присутствие металла в белке SPRTN.Мы очистили SPRTN без C-концевого Zn-связывающего домена UBZ и PIP-бокса (SPRTN 1-268) и проанализировали его с помощью масс-спектрометрии. Анализ интактного белка SPRTN в нативных и денатурирующих условиях показал увеличение массы на 126 дальтон, что соответствует присутствию двух ионов цинка (рисунок S3A). Недавнее открытие, что дрожжевой протеазе Wss1 необходима ДНК для проявления протеолитической активности (Balakirev et al., 2015, Stingele et al., 2014), привело нас к исследованию, связывает ли SPRTN ДНК. Мы использовали двухцепочечные ДНК-зонды (дцДНК) длиной 63 п.н., меченные флуоресцеинизотиоцианатом (FITC), для анализа аффинности связывания SPRTN по поляризации флуоресценции.Белок SPRTN ^WT показал высокое сродство к дцДНК (константа диссоциации [K _D ] ≈100 нМ) (A). Анализ in silico вторичной структуры SPRTN выявил наличие пяти участков связывания ДНК: четырех мотивов в С-концевой части белка и одного в протеазном домене SprT (B и S3B). Удаление предсказанных C-концевых участков связывания ДНК сильно снижает аффинность связывания ДНК SPRTN (A).

SPRTN представляет собой ДНК-зависимую металлопротеиназу с аутопротеолитическими свойствами

(A) Анализ связывания ДНК с флуоресцентной поляризацией SPRTN и его усеченных на С-конце вариантов.

(B) Схема предсказанных in silico областей связывания ДНК (зеленые квадраты) в белке SPRTN и в вариантах SPRTN, усеченных на С-конце.

(C) Аффинность связывания ДНК SPRTN ^WT , SPRTN ^E112A и SPRTN ^Y117C в отношении ds, ss и расширенной ДНК.

(D) ДНК индуцирует аутопротеолиз SPRTN. Мутация E112A или 1,10 фенантролин (фен) подавляет активность SPRTN. Расщепление анализировали на гелях SDS-PAGE и визуализировали окрашиванием кумасси синим.

(E) WB, иллюстрирующий авторасщепление SPRTN.

(F) WB общих клеточных лизатов после эктопической экспрессии FLAG-SPRTN (WT или E112A) после обработки FA. Антифосфо (P) Chk2 представляет собой положительный контроль для активации передачи сигналов повреждения ДНК.

(G и H) Ферментативные реакции in vitro, как в (D), с указанными мутациями пациента.

(I) Количественная оценка активности авторасщепления. Среднее ± стандартное отклонение, n = 3.

См. Также рисунок S3.

Затем мы спросили, связывает ли SPRTN разные структуры ДНК.SPRTN ^WT связывает одноцепочечную ДНК (оцДНК), дцДНК и расширенную ДНК с аналогичным сродством (С). SPRTN ^E112A и SPRTN ^Y117C проявили сходное сродство к ДНК, как SPRTN ^WT . Укороченный вариант SPRTN-ΔC (1-246) показал пониженное сродство к ДНК (K _D ≈ 0,48 мкМ; A), что коррелирует с потерей предполагаемых сайтов связывания ДНК (B и S3B).

Мы наблюдали повышенные уровни деградации SPRTN ^WT , когда реакцию SPRTN и ДНК инкубировали в течение более длительного периода времени и анализировали с помощью SDS-PAGE / окрашивания кумасси синим.Полноразмерный белок SPRTN ^WT был в основном интактным и имел прогнозируемый размер 55 кДа (D, дорожка 1). Однако инкубация SPRTN ^WT с дцДНК индуцировала сильную деградацию SPRTN с несколькими видимыми полосами белка и заметным накоплением фрагмента ~ 25 кДа (D, дорожка 2). Масс-спектрометрический анализ продуктов деградации SPRTN ^WT идентифицировал по меньшей мере пять различных продуктов расщепления в белке SPRTN (фигура S7C) с сайтами расщепления, расположенными в его C-концевой части (фигура S3C).Активность авторасщепления SPRTN ^WT ингибировалась в присутствии 1,10 фенантролина, известного ингибитора Zn ²⁺ -зависимых металлопротеаз (D, дорожка 3). Активность авторасщепления SPRTN была отменена мутацией E112A (D, дорожка 5). Вестерн-блот-анализ продуктов авторасщепления SPRTN ^WT с антителами, индуцированными против N- или C-концевых фрагментов SPRTN, дополнительно подтвердил данные масс-спектрометрии и продемонстрировал, что белок SPRTN в основном расщеплялся в его C-концевой части, в то время как N-концевой фрагмент остался в основном неповрежденным (E, дорожки 2 и 5).Эти данные позволяют предположить, что SPRTN является ДНК и Zn-зависимой протеазой, которая обладает активностью авторасщепления in vitro. SPRTN ^WT , но не SPRTN ^E112A , продукты авторасщепления также были видны в клетках HEK293, особенно после обработки FA, демонстрируя активность авторасщепления SPRTN in vivo (F).

Мы также спросили, какова минимальная длина ДНК, необходимая для активации активности расщепления SPRTN (рисунок S3D). Зонды оц- или дцДНК разного размера инкубировали с белком SPRTN ^WT .Фрагменты ДНК 100-мерной оцДНК или дцДНК были наиболее эффективными активаторами активности авторасщепления SPRTN.

Чтобы исследовать, являются ли мутации пациентов RJALS дефектными в отношении их активности авторасщепления, мы протестировали два варианта пациентов, SPRTN ^Y117C и SPRTN-ΔC (G – 3I). SPRTN-ΔC продемонстрировал активность авторасщепления, аналогичную SPRTN ^WT , тогда как SPRTN ^Y117C показал снижение активности авторасщепления на ~ 80% по сравнению с SPRTN ^WT (I).Учитывая, что SPRTN ^Y117C связывает ДНК со сродством, аналогичным SPRTN ^WT , мы заключаем, что его ферментативный дефицит не связан с нарушением связывания ДНК. Наши результаты предполагают, что SPRTN ^Y117C напрямую влияет на активный центр протеазы (E112), который расположен всего в пяти аминокислотах выше мутации. SPRTN-ΔC (1-246) все еще сохраняет активность авторасщепления, аналогичную SPRTN ^WT (H и 3I), несмотря на его более низкое сродство к ДНК (A).

Транс-расщепляющая активность металлопротеазы SPRTN

Чтобы выяснить, происходит ли авторасщепление SPRTN в цис- или транс-, мы инкубировали SPRTN ^WT с ферментативно-мертвым вариантом SPRTN (SPRTN ^{).SPRTN WT расщепил SPRTN E112A (рисунок S3E, сравните дорожки 2 и 4). Эти данные предполагают, что SPRTN расщепляет себя на транс . Чтобы проверить важность связывания ДНК для активности транс-расщепления, мы инкубировали два усеченных на С-конце варианта SPRTN, которые имеют среднее (SPRTN 1-268 ) или низкое (SPRTN 1-218 ) сродство к ДНК с SPRTN . E112A (A для сродства к ДНК). SPRTN 1–268 расщепил SPRTN E112A с эффективностью, аналогичной SPRTN WT (рисунок S3E, сравните дорожку 4 с дорожкой 6).Напротив, SPRTN 1-218 заметно потерял активность транс-расщепления (рисунок S3E, сравните дорожку 4 с дорожкой 8). Затем мы спросили, является ли ДНК каркасом или аллостерическим активатором активности авторасщепления SPRTN. Активность авторасщепления SPRTN WT была максимальной при эквимолярных концентрациях белка и ДНК в реакции. Повышение концентрации ДНК постепенно подавляло активность SPRTN (рисунок S3F). В целом эти результаты показывают, что ДНК служит каркасом, который сближает SPRTN и его субстрат, а не действует как аллостерический активатор.Потеря его C-концевых участков связывания ДНК делает SPRTN неспособным выполнять свою протеолитическую активность, предполагая, что саморасщепление снижает протеолитическую активность расщепленных форм.}

Идентификация субстратов SPRTN

Мы выделили DPC из контрольных и истощенных SPRTN клеток HeLa (рис. S4A) и проанализировали их с помощью безметочной количественной масс-спектрометрии. Три независимых эксперимента выявили 84 значительно увеличенных (в 1,5 раза) белков в DPC в SPRTN-истощенных клетках по сравнению с контрольными клетками (рисунок S4B и репозиторий исходных данных: PRIDE).Хотя многие из идентифицированных субстратов были ДНК- и РНК-связывающими белками, большинство из них не были ДНК-связывающими белками (рис. S4C). Учитывая, что любой белок в непосредственной близости от ДНК может быть сшит, особенно белки ядерного матрикса, это неудивительно. Соответственно, белки, не связывающие ДНК, такие как Lamin B1 и DNA-PK, обогащены DPC, выделенными из Δ-SPRTN клеток (G).

Удаление DPC во время S-фазы клеточного цикла

(A) Схема экспериментального подхода, используемого для синхронизации клеток T24 в G0 и мониторинга уровней DPC во время входа в S-фазу.

(B) Общие уровни DPC в G0-, поздней G1- и S-фазе до и после истощения SPRTN в клетках HeLa, визуализированные с помощью окрашивания серебром. WB циклина A и профили клеточного цикла использовали в качестве контроля входа в S-фазу.

(C) WB, демонстрирующий экспрессию или истощение SPRTN в нерепликативных и репликативных клетках T24.

(D) Схема измерения жизнеспособности репликативных и нерепликативных клеток.

(E) Жизнеспособность репликативных и нерепликативных клеток T24 после истощения SPRTN и обработки FA.

(F) Общие уровни DPC после высвобождения G1 / S в клетках HeLa WT и Δ-SPRTN, визуализированные окрашиванием серебром. WB циклинов и профили клеточного цикла (нижние изображения) использовали для контроля прогрессирования S-фазы.

(G) WB, демонстрирующий присутствие ДНК-PK и ламина B1 в DPC в Δ-SPRTN клетках HeLa после высвобождения G1 / S. Экстракт цельных клеток: WCE. Среднее ± SEM, n = 3.

Мы сосредоточились на гистонах и ДНК-топоизомеразах, ДНК-связывающих белках с хорошо охарактеризованными клеточными функциями, которые оказались среди лучших хитов (≥1.98-кратное увеличение) в нашем масс-спектрометрическом анализе (рисунок S4D). Чтобы подтвердить данные масс-спектрометрии, мы проанализировали конкретные DPC, выделенные, как показано на A, методом иммунодетекции слот-блоттингом. Истощение SPRTN двумя разными миРНК значительно увеличивало количество Topo1, Topo2α, гистона h4 и гистона h5 (A и 4B). Чтобы продемонстрировать, что гипераккумуляция Topo1 специфична для потери активности протеазы SPRTN, мы эктопически экспрессировали SPRTN ^WT или SPRTN ^E112A в клетках, нацеленных на 3′-UTR siRNA, истощенных SPRTN.Эктопическая экспрессия SPRTN ^WT , но не SPRTN ^E112A , спасала накопление Topo1 (Topo1-cc) (рисунок S4E). Мы дополнительно проанализировали Topo1-ccs после лечения CPT (C). И SPRTN-истощенные клетки, и LCL пациентов накапливают больше Topo1-ccs по сравнению с контрольными клетками, что дополнительно подтверждает фундаментальную важность активности протеазы SPRTN в удалении Topo1-ccs и защите от цитотоксичности DPC (Рисунки S2B – S2H).

Идентификация субстратов SPRTN

(A) Слот-блоты, показывающие присутствие DPC Topo1, Topo2α, h4 и h5 после истощения SPRTN в клетках HeLa и соответствующие количественные оценки.Среднее ± SEM, n = 3.

(B) контроли загрузки ДНК для анализа DPC, до обработки бензоназой, как в (A).

(C) Слот-блоты, показывающие накопление Topo1-ccs после непрерывной обработки CPT, как указано, в Δ-SPRTN клетках (левое изображение) и LCL RJALS (правое изображение).

(D) WB и соответствующая количественная оценка, показывающая, что SPRTN расщепляет гистон h4 в присутствии ДНК. Среднее ± стандартное отклонение, n = 3.

(E) Временная кинетика расщепления h4 по сравнению с саморасщеплением SPRTN в одних и тех же реакционных смесях, выраженная как увеличение расщепления h4 или SPRTN с течением времени (мин).Среднее ± SD, n = 3.

(F) Сравнение времени, реакции расщепления h4 для SPRTN ^WT и SPRTN-ΔC, как в (D). Ось y была нормализована по шкале от 0% до 100%. Среднее ± SD, n = 3.

(G) Гистон h4, Topo1 и Topo2α являются субстратами протеазы SPRTN. Продукты расщепления ( ^* ) были обнаружены WB с использованием антител против гистона h4 (верхнее изображение), Topo2α (среднее изображение) или Topo1 (нижнее изображение). FL, полная длина.

(H) Множественное выравнивание последовательностей продуктов расщепления гистонов (CP), показывающее сайты расщепления (стрелка) в их неструктурированных N-концевых хвостах ( ^* обозначает альтернативные продукты расщепления).

См. Также рисунки S4 и S5.

Характеристика ферментативной активности SPRTN

Чтобы охарактеризовать способность SPRTN расщеплять идентифицированные субстраты, мы выполнили анализы активности расщепления in vitro с использованием очищенного белка SPRTN ^WT . SPRTN ^WT расщеплял все тестируемые гистоны, h3A, h3B, h4 и h5, ДНК-зависимым образом, но не цитозольный белок глутатион-S-трансферазу (D, S5A и S5B). Кинетический анализ авторасщепления SPRTN и расщепления гистона h4 в одной и той же реакции показал, что SPRTN расщепляет h4 с немного более быстрой кинетикой, чем он сам (E).Это говорит о том, что SPRTN одновременно расщепляет субстраты и себя, но с более высоким предпочтением субстрату. Это, скорее всего, приводит к инактивации SPRTN, поскольку расщепленные продукты SPRTN теряют аффинность связывания ДНК (A), ферментативную активность (рисунок S3E) и имеют в 2 раза более низкую кинетику процессивности субстрата (F). Это может быть одним из механизмов, помимо регуляции клеточного цикла (см. Ниже), с помощью которого протеаза SPRTN саморегулируется, чтобы предотвратить вредное и неконтролируемое расщепление в непосредственной близости от нее.

Затем мы протестировали активность расщепления различных вариантов SPRTN, уделяя особое внимание гистону h4 (D и 4G). Как и ожидалось, каталитически неактивный SPRTN ^E112A не расщеплял гистон h4. Подобно активности авторасщепления SPRTN, вариант пациента SPRTN ^Y117C сильно пострадал в отношении расщепления гистона h4 (~ 8% активности), тогда как SPRTN-ΔC сохранил активность, аналогичную SPRTN ^WT . Мы распространили анализ активности расщепления на два других идентифицированных субстрата, Topo1 и Topo2α.С этой целью мы очистили YFP-Topo1 и GFP-Topo2α из экстрактов целых клеток в денатурирующих условиях и инкубировали их с различными вариантами SPRTN. SPRTN ^WT , но не SPRTN ^E112A , расщеплял Topo1 и Topo2α in vitro, тем самым подтверждая, что Topo1 и Topo2α являются субстратами SPRTN (G, дорожки 2 и 3). Характеристика мутаций пациентов показала, что SPRTN ^Y117C не может расщеплять Topo1 и Topo2α. Неожиданно, в отличие от авторасщепления (H) и расщепления гистона h4 (D и 4G), SPRTN-ΔC показал сильно сниженный протеолиз Topo1 и Topo2α in vitro, аналогично наименьшей авторасщепленной форме SPRTN (1–227). ) (G, дорожки 5 и 6).Эти данные показывают, что протеаза SPRTN расщепляет различные ДНК-связывающие субстраты ДНК-зависимым образом. Активности протеазы SPRTN серьезно препятствует мутация Y117C пациента для всех тестируемых субстратов. Укороченный пациентом вариант SPRTN-ΔC, хотя и способен расщеплять сам себя и гистон h4, проявляет сильно сниженную активность по отношению к Topo1 и Topo2α, предполагая, что С-концевая часть SPRTN необходима для оптимального протеолиза этих субстратов.

SPRTN — плейотропная протеаза для ДНК-связывающих белков

Затем мы стремились идентифицировать сайты расщепления протеазой SPRTN и спросили, расщепляется ли протеаза SPRTN по конкретному мотиву аминокислотной последовательности.Продукты расщепления h3A, h3B, h4 и h5, а также продукты авто-расщепления SPRTN анализировали с помощью масс-спектрометрии для идентификации сайтов расщепления (H и S5C). Мы обнаружили, что SPRTN расщепляет гистоны h3A, h3B, h4 и h5 в пределах их неструктурированного, положительно заряженного N-концевого хвоста. Все идентифицированные области расщепления были обогащены остатками аргинина и лизина и в большинстве случаев находились в очень непосредственной близости от остатков серина. Анализ сайтов авторасщепления SPRTN (CS) также показал обилие остатков лизина, аргинина и серина (CS 1 и 3), в то время как, в частности, CS3 сильно обогащен серинами (и, в меньшей степени, лизинами и аргининами) ( Рисунок S3C).Подобно сайтам расщепления гистонов, которые присутствуют в неупорядоченных областях белка (N-конец), SPRTN расщепляет себя во многих местах на своем С-конце, который преимущественно неупорядочен (рисунок S5D). Эти результаты предполагают, что SPRTN не является протеазой, специфичной для последовательности, а расщепляет неструктурированные белковые области вблизи остатков лизина, аргинина и серина.

Чтобы проверить, расщепляет ли SPRTN также DPC in vitro, мы выделили общие DPC с помощью анализа преципитации SDS / KCl и инкубировали их с рекомбинантным SPRTN.SPRTN ^WT , но не SPRTN ^E112A , расщепляет DPC in vitro (рисунок S6A). На данный момент наши результаты in vitro и in vivo предполагают, что SPRTN расщепляет ДНК-связывающие белки независимо от их статуса связывания с ДНК (т.е. ковалентные DPC или нековалентные). Чтобы дополнительно проверить это наблюдение, мы выделили связанный с хроматином Topo1 или Topo2 в денатурирующих условиях как из необработанных клеток HEK293, так и из клеток, обработанных CPT или ETO, соответственно. Эффективность расщепления SPRTN иммуноочищенных Topo1 и Topo2α была сходной для необработанных и обогащенных Topo1 / 2α-cc образцов (обработанных CPT и ETO, соответственно; Фигуры S6B и S6C).В целом, эти данные предполагают, что SPRTN не специфически расщепляет DPC, а специфически расщепляет ДНК-связывающие субстраты, и что SPRTN действительно является плейотропной протеазой, поскольку он расщепляет большинство высокомолекулярных DPC in vitro (рисунок S6A, сравните дорожки 1 и 2). .

SPRTN удаляет DPC во время S-фазы и защищает пролиферативные клетки от DPC-индуцирующих агентов

Учитывая, что экспрессия SPRTN отсутствует в G1-фазе клеточного цикла и быстро активируется, когда клетки входят в S-фазу (Mosbech et al. al., 2012), мы предположили, что SPRTN участвует в удалении DPC во время синтеза ДНК. Чтобы проверить эту гипотезу, мы проанализировали уровни DPC во время S-фазы прогрессирования в контрольных и истощенных SPRTN клетках. Мы использовали клетки T24, которые останавливаются в фазе G0 за счет контактного ингибирования при 100% конфлюэнтности и синхронно входят в S-фазу при разведении до более низких плотностей. Клетки задерживали в G0, обрабатывали контрольной миРНК или SPRTN-миРНК в течение 2 дней, а затем разбавляли для перехода в S-фазу (А). Мы контролировали общее количество эндогенных DPC во время прогрессирования S-фазы.DPC быстро удаляли по мере прохождения контрольных клеток через S-фазу. Напротив, клетки с истощенным SPRTN показали замедленную кинетику удаления DPC во время S-фазы прогрессирования (B, сравните дорожки 2 и 3 с 5 и 6). Вестерн-блот-анализ клеток T24 показал, что SPRTN не экспрессируется в клетках G0 (C), что дополнительно указывает на важную роль SPRTN в защите от DPC во время синтеза ДНК. Чтобы исследовать эту гипотезу, мы обрабатывали G0-арестованные или пролиферативные клетки T24 контрольной или siRNA SPRTN в течение 2 дней, подвергали клетки воздействию сублетальной дозы FA в течение дополнительных 2 дней, а затем контролировали жизнеспособность клеток (D).Действительно, только пролиферативные клетки с истощенным SPRTN, но не G0-арестованные клетки, были гиперчувствительными к FA (E). Кроме того, Δ-SPRTN клетки HeLa в огромной степени накапливают общие DPC во время прогрессирования S-фазы по сравнению с контрольными клетками (F). Эти данные показывают, что SPRTN обрабатывает DPC во время S-фазы прогрессирования, таким образом защищая клетки от цитотоксичности DPC.

SPRTN является составной частью механизма репликации ДНК

Продемонстрировав, что SPRTN защищает пролиферативные клетки человека от DPC, и зная, что мутация пациента SPRTN ^Y117C важна для невозмущенного прогрессирования вилки репликации ДНК (Lessel et al., 2014), мы спросили, является ли SPRTN частью механизма репликации ДНК. Мы изолировали SPRTN-SSH из общих экстрактов клеток HEK293 над стрептактин-сефарозой в условиях высокого содержания соли и детергента, чтобы удалить все неспецифические связывающие белки из SPRTN-комплексов in vivo. SPRTN соосаждался с основными компонентами аппарата репликации ДНК: PCNA, субъединицами 2 и 6 комплекса поддержания минихромосом (MCM) и ДНК-полимеразой δ (A). Затем мы спросили, присутствует ли SPRTN физически на сайтах вилок репликации ДНК.Чтобы ответить на этот вопрос, мы выделили белки из зарождающейся ДНК с помощью технологии iPOND. Подобно PCNA, MCM3 и ДНК-полимеразе δ, SPRTN присутствовал на формирующейся ДНК (B, дорожка 2) и перемещался вместе с реплисомой, как показано тимидиновой погоней (B, дорожка 3). В целом эти данные предполагают, что SPRTN является частью механизма репликации ДНК и перемещается вместе с реплисомой во время синтеза ДНК.

SPRTN является частью механизма репликации ДНК и регулирует прогрессию вилки репликации ДНК

(A) CoIP SPRTN-Strep-Strep-His (SSH) из клеток Flp-In HEK293, стабильно экспрессирующих SPRTN при индукции Dox, демонстрируя связь с реплисомой белки.

(B) Схема подхода iPOND (верхнее изображение). iPOND демонстрирует, что SPRTN движется вместе с реплисомой. Клетки HEK293 обрабатывали EdU в течение 10 мин для мечения растущей ДНК (дорожка 2), а затем гнали тимидином, где указано (зрелая ДНК, дорожка 3).

(C) iPOND, демонстрирующий повышенное удерживание белков реплисом на зрелой ДНК в Δ-SPRTN клетках HeLa (дорожки 6 и 7).

(D) Анализ волокон ДНК в клетках HeLa после сверхэкспрессии FLAG-SPRTN ^WT или пустого вектора FLAG.Показаны типичные волокна ДНК (верхнее изображение). Показана количественная оценка длины IdU-меченного тракта в присутствии агентов, индуцирующих DPC (50 мкМ FA, 25 нМ CPT). Цифры (зеленые) — средние значения длины тракта в килобазах.

(E) Анализ ДНК-волокон в LCL RJALS (B-II: 1) и контрольных LCL после обработки FA или CPT, выполняемой, как в (D).

(F) Количественная оценка фокусов 53BP1 в положительных по циклину А клетках HeLa WT или Δ-SPRTN после обработки FA (50 мкМ). Данные представляют кратное изменение в фокусах 53BP1 по сравнению с необработанными клетками (момент времени 0) (верхнее изображение).Показаны репрезентативные микрофотографии фокусов 53BP1 в положительных по циклину клетках через 6 часов после обработки FA (нижнее изображение). Среднее ± SEM, n = 3.

См. Также рисунок S6.

SPRTN управляет прогрессией вилки репликации ДНК путем удаления DPC

Мы также спросили, влияет ли инактивация SPRTN на развитие механизма репликации ДНК. Мы изолировали вилки репликации ДНК с помощью iPOND и наблюдали за их развитием в контрольных и Δ-SPRTN клетках HeLa (C). Нокаут SPRTN серьезно повлиял на прогрессию репликации ДНК, как показано удержанием PCNA и MCM3 на зрелой ДНК (тимидиновая погоня, C, сравните дорожки 3 и 4 с дорожками 6 и 7).Дефекты в развитии вилки репликации ДНК в клетках Δ-SPRTN были продемонстрированы с помощью анализа волокон ДНК (рис. S6D). Замедленные вилки репликации ДНК в Δ-SPRTN-клетках накапливали Topo1 (рис. S6E), один из субстратов протеазы SPRTN in vitro и in vivo. Эти результаты показывают, что SPRTN регулирует прогрессию реплисом и предотвращает накопление Topo1 в сайтах вилок репликации ДНК. Мы также спросили, взаимодействует ли SPRTN физически с Topos. С этой целью мы совместно осаждали SPRTN, как описано ранее, и анализировали присутствие Topo1 и Topo2α в комплексе SPRTN.Эксперименты по совместной иммунопреципитации показали, что SPRTN действительно образует комплекс как с Topo1, так и с Topo2α in vivo (рисунок S6F).

Чтобы исследовать, как DPC влияют на прогресс репликации ДНК, мы использовали анализ волокон ДНК (D). Обработка контрольных клеток низкой дозой FA или CPT вызвала сильное снижение синтеза ДНК, обнаруживаемое как снижение скорости вилки репликации ДНК, когда второй нуклеотид (IdU) инкубировали вместе с FA или CPT. Эктопическая экспрессия SPRTN ^WT спасала DPC-индуцированный дефект прогрессии репликационной вилки ДНК как в контрольных, так и в Δ-SPRTN клетках (D и S6D).Измеряя скорость вилки репликации ДНК в LCL RJALS, мы обнаружили, что клетки RJALS показали более сильное снижение (~ 2,5 раза) прогрессии вилки репликации ДНК, чем контрольные клетки при заражении FA или CPT (E). В целом, эти результаты предполагают, что SPRTN важен для развития вилок репликации ДНК, зараженных DPC-индуцирующими агентами, и является ограничивающим фактором в этом процессе, поскольку снижение скорости вилки в контрольных клетках, обработанных FA / CPT, или клетках Δ-SPRTN может быть восстановлено за счет Сверхэкспрессия SPRTN ^WT .

SPRTN предотвращает DPC-индуцированные DSB в S-фазе

Мы предположили, что снижение скорости вилок репликации ДНК в SPRTN-истощенных клетках или клетках RJALS в присутствии агентов, индуцирующих DPC, приводит к длительной остановке реплисом и, как следствие, к ДНК. коллапс репликационной вилки, визуализируемый как ds-разрывы ДНК (DSB), фенотип, наблюдаемый у пациентов с RJALS (Lessel et al., 2014). Мы непрерывно подвергали контрольные или Δ-SPRTN клетки мягким дозам FA или CPT и контролировали образование фокусов 53BP1, признанного маркера DSB, в течение 6 часов с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии в фиксированных клетках.Окрашивание циклином А использовали в качестве маркера для клеток, положительных по S- / G2-фазе. Образование фокусов 53BP1 индуцировалось как в позитивных, так и в негативных клетках по циклину А после обработки FA или CPT, что дополнительно подтверждает генотоксичность, индуцированную DPC (F и S6G – S6I). Однако среднее количество фокусов 53BP1 на клетку увеличивалось в 2–3 раза после обработки FA или CPT в положительных по циклину A Δ-SPRTN клетках HeLa по сравнению с контрольными клетками HeLa (F и S6G). Напротив, количество фокусов 53BP1 в циклин A-отрицательных клетках было одинаковым как в Δ-SPRTN, так и в контрольных клетках (Фигуры S6H и S6I).Эти результаты предполагают, что SPRTN предотвращает DPC-индуцированные DSB во время синтеза ДНК.

Обсуждение

Мы раскрыли механизмы понимания активности протеазы SPRTN для репарации DPC и установили SPRTN как протеазу, связанную с репликацией ДНК (). Наша работа определяет отсутствующую протеазу, участвующую в репликации ДНК и процессинге сшивок топоизомеразы 1 и 2 (Ashour et al., 2015, Duxin et al., 2014, Gao et al., 2014, Interthal and Champoux, 2011). Биохимическая характеристика мутаций SPRTN у пациентов с RJALS показывает, что RJALS вызывается дефектом активности протеазы SPRTN, что делает его неспособным обрабатывать DPC во время репликации ДНК и, следовательно, приводит к стрессу репликации ДНК, одной из основных причин нестабильности генома и рака.

Модель восстановления DPC, связанного с репликацией ДНК

SPRTN является составной частью реплисомы и расщепляет DPC во время развития репликационной вилки. Протеаза SPRTN защищает пролиферативные клетки от цитотоксичности, вызванной DPC (слева). Дефицит SPRTN (мутации SPRTN у RJALS, SPRTN гаплонедостаточные мыши) вызывает остановку вилки репликации ДНК из-за патологического накопления DPC, что, в свою очередь, приводит к DSB и геномной нестабильности (справа).

Протеолиз SPRTN, связанный с репликацией ДНК

Наши результаты согласуются с недавними биохимическими данными в экстракте яиц Xenopus , показывающими, что протеолиз, связанный с репликацией ДНК, необходим для удаления DPC (Duxin et al., 2014), модель, предложенная лабораторией Санкара (Reardon et al., 2006). Однако фермент этого пути оставался неизвестным до сих пор, когда мы показали, что SPRTN является активной протеазой и составной частью реплисомы. Принимая во внимание, что DPC распространены повсеместно и что практически любой белок, присутствующий в непосредственной близости от ДНК, может быть сшит, протеолитическая активность SPRTN в репликации ДНК имеет важное значение. Динамика клеточного цикла экспрессии SPRTN подтверждает нашу гипотезу, при этом SPRTN отсутствует в G0 T24-клеток и появляется при входе в S-фазу.Это согласуется с опубликованными данными, показывающими, что уровень SPRTN подавляется в клетках в фазе G1 с помощью E3-ubiquitin ligase APC-комплекса и усиливается, когда клетки входят в S-фазу (Mosbech et al., 2012). Поэтому мы предполагаем, что это путь репарации ДНК для удаления DPC в пролиферативных клетках. Мы не можем исключить потенциальную роль SPRTN в непролиферативных клетках, но если она существует, эта функция не связана с репарацией DPC, связанной с репликацией ДНК.

Восстановление перекрестных связей ДНК-белок

Наша работа посвящена новому вопросу в области репарации ДНК: как DPC удаляются из хроматина? Несмотря на частое появление DPC, мы плохо понимаем процесс восстановления DPC (Ide et al., 2015). Считается, что репарация DPC частично зависит от двух канонических путей репарации ДНК, NER и HR (Barker et al., 2005, Nakano et al., 2007). Однако оба пути репарации ограничены тем фактом, что NER может действовать только на более мелкие сшивки белков, не превышающие 11 кДа, а HR полагается на образование DSB, которое приводит к рекомбиногенным событиям и связанной с ними геномной нестабильности. Как следствие, в процессинг DPC и поддержание стабильности генома должны быть вовлечены другие механизмы репарации.Действительно, накопление DPC не наблюдается ни при инактивации ключевых игроков NER и HR, ни при пути анемии Фанкони (рисунок S2A), что позволяет предположить, что SPRTN-зависимый путь репарации DPC является основным специализированным путем репарации DPC в клетках человека. Ранняя эмбриональная летальность мышей с нокаутом SPRTN (Maskey et al., 2014) и идентификация SPRTN как одного из основных генов в геноме человека (Hart et al., 2015, Wang et al., 2015) еще раз подтверждают вывод, что SPRTN является критическим компонентом уникальной системы репарации ДНК, а именно пути репарации DPC.

Характеристика мутаций пациентов с RJALS

Мы продемонстрировали, что протеазная активность мутации пациента SPRTN ^Y117C сильно влияет на все тестируемые субстраты. Причина, по которой мутация Y117C влияет на ферментативную активность SPRTN, не ясна. Сравнение последовательностей показывает, что этот остаток не является строго консервативным среди гомологов SPRTN (фигура S7A), хотя он обычно является гидрофобным даже среди более широкого семейства цинцина. Непосредственная близость Y117 к каталитическому центру, расположенному всего на два остатка ниже второго потенциального Zn-связывающего гистидина (h215), и неконсервативный характер замены указывают на то, что вариант может быть неспособен образовывать активный сайт с правильная геометрия.Возможно, это результат стерических эффектов, включающих расположение конца HEXXH-содержащей спирали и последующей петли, содержащей третий потенциальный лиганд Zn ²⁺ .

Другая патогенная мутация, SPRTN-ΔC, протеолитически активна по отношению к себе (авторасщепление) и гистонам (H и D), но серьезно нарушена в процессинге Topo1 и Topo2α (G). Чувствительность истощенных SPRTN клеток к CPT не может быть полностью восстановлена ​​с помощью SPRTN-ΔC, предполагая, что эта мутация пациента, хотя и протеолитически активна, не может должным образом обрабатывать определенные субстраты, такие как Topo1 и Topo2.Одна из причин может заключаться в том, что С-концевая часть важна для связывания определенных субстратов и участвует в специфичности субстрата SPRTN. Повышенные уровни DPC в клетках пациентов с RJALS и неспособность репликации ДНК в клетках RJALS справиться с индукцией неферментативных (FA) или ферментативных (CPT) DPC, демонстрируют, что DPC, такие как Topo1 и Topo2α, и наиболее вероятно многие другие являются основной причиной синдрома RJALS. Мы предполагаем, что RJALS — это заболевание человека, связанное с дефектным путем репарации DPC.

Сравнение SPRTN и Wss1

Биоинформатический анализ предполагает, что SPRTN и Wss1 имеют общего предка (Stingele et al., 2015). Хотя верно, что оба фермента отдаленно родственны суперсемейству металлопротеиназы цинка, две последовательности можно выровнять только по относительно короткой области 95 аминокислотных (аа) остатков с 24% идентичностью последовательностей (сравнивая человеческий и S. cerevisiae ) ферменты) (Рисунок S7B). Эта общая область включает консервативный мотив HEXXH, общий для более широкого набора ферментов с различными функциями, который обеспечивает платформу для связывания Zn ²⁺ через два гистидина, причем соседний остаток глутамата, как полагают, играет роль в катализе (Hooper, 1994).Кроме этого общего ядра, не удалось найти никаких других областей сходства последовательностей. Wss1 и SPRTN проявляют сходные ферментативные свойства, но их клеточная функция частично не связана. SPRTN взаимодействует с аппаратом репликации ДНК и связывает убиквитинированные субстраты посредством своих Ub-связывающих доменов, тогда как Wss1 связывает и обрабатывает SUMOylated субстраты посредством своих взаимодействующих с SUMO мотивов (Balakirev et al., 2015). Инактивация SPRTN вызывает массовое накопление общих DPC в пролиферативных клетках человека, включая Topo1, Topo2α и гистоны.Напротив, дрожжевые клетки, лишенные Wss1, не накапливают общие DPCs и не обнаруживают гиперчувствительности к CPT (Stingele et al., 2014).

Что нужно знать при рассмотрении вопроса о восстановлении трансмиссии

Часто задаваемые вопросы о восстановлении трансмиссии

У вас есть вопросы, У Drive есть ответы!

В. Лучше ли купить восстановленную трансмиссию, чем отремонтировать старую?

A. Это будет зависеть от нескольких факторов. Если затраты на восстановление трансмиссии превышают затраты на покупку и установку восстановленной детали, это немного упрощает решение.Но если есть неясность в том, что на самом деле повреждено и нуждается в ремонте, лучше всего будет демонтировать трансмиссию для проверки. Это, конечно, стоит денег, но дешевле, чем покупать другую коробку передач.

В. Хорошо, сколько это мне вообще будет стоить?

A. Опять же, это зависит от обстоятельств. Еще в 2014 году Angie’s List обнаружил, что средняя стоимость восстановления трансмиссии составляет от 2800 до 3800 долларов. Сайт также обнаружил, что стоимость покупки замены может стоить от 4000 до 8000 долларов.Это не дешевый ремонт, но легко понять, что восстановление может быть лучшим финансовым решением.

В. Могу ли я сэкономить при этом?

A. Лучший способ «сэкономить» при восстановлении трансмиссии — это в первую очередь предотвратить необходимость восстановления. Регулярное обслуживание и осмотры трансмиссии и связанных с ней компонентов избавят вас от головной боли в будущем. Если вы думаете о удешевлении самого ремонта, подумайте еще раз. Ты получаешь то, за что платишь.

Давайте поговорим, прокомментируем ниже, чтобы поговорить с