Lada (ВАЗ) XRAY 1.8

1. Фотографии Lada (ВАЗ) XRAY 1.8 из каталога AutoNet.ru. Фото 1 из 11

2. Фотографии Lada (ВАЗ) XRAY 1.8 из каталога AutoNet.ru. Фото 2 из 11

3. Фотографии Lada (ВАЗ) XRAY 1.

   8 из каталога AutoNet.ru. Фото 3 из 11

4. Фотографии Lada (ВАЗ) XRAY 1.8 из каталога AutoNet.ru. Фото 4 из 11

5. Фотографии Lada (ВАЗ) XRAY 1.8 из каталога AutoNet.ru. Фото 5 из 11

6. Фотографии Lada (ВАЗ) XRAY 1.8 из каталога AutoNet.ru. Фото 6 из 11

7. Фотографии Lada (ВАЗ) XRAY 1.8 из каталога AutoNet.ru. Фото 7 из 11

8. Фотографии Lada (ВАЗ) XRAY 1.

   8 из каталога AutoNet.ru. Фото 8 из 11

9. Фотографии Lada (ВАЗ) XRAY 1.8 из каталога AutoNet.ru. Фото 9 из 11

10. Фотографии Lada (ВАЗ) XRAY 1.8 из каталога AutoNet.ru. Фото 10 из 11

11. Фотографии Lada (ВАЗ) XRAY 1.8 из каталога AutoNet.ru. Фото 11 из 11

Производство LADA XRAY стартовало 15 декабря 2015 года на сборочной площадке в Тольятти, на линии по выпуску автомобилей на платформе В0. XRAY стал второй новой моделью LADA за последние 3 месяца. LADA XRAY – это комфортная и высокая посадка, особенно удобная в городе и на легком бездорожье, динамичный мотор, острая управляемость, хорошая шумоизоляция. Подвеска автомобиля настроена на активное маневрирование: газонаполненные амортизаторы и передний подрамник обеспечивают отличный контроль над дорогой. Высокий внедорожный клиренс вместе с энергоемким, беспробойным шасси гарантируют отличную проходимость. Интерьер машины комфортен и рационален.

Автомобильный каталог содержит описание, технические характеристики и фотографии автомобиля Lada (ВАЗ) XRAY 1.8.

Продажа подержанных автомобилей Lada (ВАЗ)

Отзывы владельцев автомобиля Lada (ВАЗ)

• 28.09.2007

  Мациевский Денис Сергеевич

  Оценка автора

  Объективность

  Ваз 11183 (Клина). Пробег на сегодняшний день 4050 км, машина у меня с 7 августа 2007 г. Брал в автосалоне «Курск-Лада». *** Начну с салона. Пришел в салон 4 августа за 30 минут до закрытия, менеджер сразу повел меня на площадку выбирать машину, изночально хотелось хэтчбэк аспарагус (салатовый) или рислинг (серебристый). Аспаругуса не было совсем, а рислинг было всего две машины — седан и хэтчбэк. Этим мой выбор закончился. Касса была уже закрыта, предоплату оставить нельзя. В машину положили записку, что типа машина зарезервирована. С утра 5 августа принес 20 000 тыс…

  подробнее

• 21.09.2007

  Nefr_05092007

  Оценка автора

  Объективность

  Хорошее соотношение цены и качества!!!!!!!!!!!!!!! Дешевое ТО, обслуга!!!!!!!!!!! И без пантов!!!!!!!!!!! Русский должен ездить на русской машине!!!!!!!!!!!!!

  подробнее

• 27. 07.2007

  Юшин Дмитрий Николаевич

  Оценка автора

  Объективность

  подробнее

Двигатели Лада Х-рей — подробные характеристики

На модель Лада Х-рей устанавливают сразу два отечественных бензиновых силовых агрегата: ВАЗ 21129 объемом 1.6 литров 106 л.с. 148 Нм и ВАЗ 21179 объемом 1.8 литров 122 л.с. 170 Нм. Также тут встречается мотор Рено Н4М объемом 1.6 литра мощностью 110-113 л.с. 150-152 Нм.

Двигатель Лада Х-рей 1.6 литра

Этот силовой агрегат является адаптацией известного по Приоре мотора ВАЗ 21127 к ЕВРО 5, то есть дальним родственником агрегата 21083. Здесь конечно увеличенный рабочий объем, новая ГБЦ с парой распредвалов и гидрокомпенсаторами, впускной тракт переменной длины, а также датчик абсолютного давления и температуры воздуха вместо уже устаревшего ДМРВ.

Основными проблемами данного двигателя являются небольшой ресурс помпы, жор масла, троение на холодную и нередко лопающиеся расширительные бачки охлаждающей жидкости.

Первое время Lada Xray оснащалась силовым агрегатом от Renault-Nissan с индексом h5Mk, хорошо известным по ряду моделей франко-японского концерна. Этот алюминиевый мотор с цепным приводом ГРМ и фазорегулятором на впускном валу не имеет гидрокомпенсаторов, поэтому здесь требуется периодически производить регулировку тепловых зазоров клапанов.

Летом 2019 года франко-японский двс с индексом Н4М вернулся в модельную гамму в связи с установкой на X-RAY вариатора Jatco JF015E. Его мощность повысили до 113 л.с. и 152 Нм.

Список типичных неисправностей этого силового агрегата нельзя назвать слишком большим. Можно припомнить разве что проблемы с заводкой в сильный мороз, небольшой жор масла и нежное реле блока зажигания, а еще быстрый износ подушек двигателя и ремня генератора.

Технические характеристики Автопроигрыватель Яндекс.Авто YA-LD03-1A для Lada X-Ray

Renault Sandero Stepway против Lada XRAY

Не секрет, что французский концерн активно участвует в разработках и развитии АвтоВАЗа. Модель «Икс-Рэй» — это уже новый, совместный продукт, отличающийся не только неплохой проходимостью, но и достойным качеством и оснащением. За основу данного автомобиля был взят Renault Sandero Stepway. Поэтому многие отечественные водители хотят определиться, какой из двух хетчбэков лучше.

Сравнение экстерьера Renault Sandero Stepway и Lada XRAY

Дизайн «Икс-Рэй» многие автовладельцы и блогеры отмечают в числе главных плюсов модели. С другой стороны, броские Х-образные выштамповки далеко не всем водителям кажутся удачным решением.

При сравнении экстерьера Renault Sandero Stepway и Lada XRAY сразу заметно различие в позиционировании. Российский хетчбэк изначально создавался как более доступная альтернатива французскому. Среди наиболее очевидных отличий — отсутствие пластикового обвеса и рейлингов, а также меньший диаметр колесных дисков в базе.

Не так давно в модельном ряду «Лады» появилась улучшенная кросс-версия «Икс-Рэй». В ней пластиковый обвес и рейлинги уже появляются, но и стоить данная версия будет уже ощутимо дороже «Сандеро Степвэй».

Французская модель очертаниями кузова больше похожа на SUV. Можно согласиться с тем, что в версии АвтоВАЗа автомобиль выглядит более внушительно, зато хетчбэк от «Рено» выигрывает по элегантности, собранности и динамичности облика. Общими преимуществами для обеих моделей являются внушительный клиренс в 195 миллиметров и защита картера, устанавливаемая по умолчанию.

Сравнение интерьера

«Степвэй» оказывается более выгодным вариантом и при сравнении интерьера. Он превосходит оппонента в плане качества материалов и эргономики салона. Цветовая гамма исполнения внутреннего пространства у «Рено» более строгая, а потому ощущается дороже. Аналогичное ощущение возникает при сопоставлении приборной панели и самих датчиков.

Оснащение начальных комплектаций «Лады» беднее. В первых двух исполнениях отсутствует даже кондиционер. «Икс-Рэй» догоняет «Сандеро» по функциональности только в топовой версии, а цена на нее уже чуть выше.

Но самым главным преимуществом «Рено» является включение в комплектацию не только фронтальных, но и боковых эйрбэгов. У «Лады» они недоступны даже в списке опций заметно более дорогой кросс-версии.

Сравнение ходовых характеристик

По мощности моторов есть небольшая разница в пользу «Лады». Для модели предлагаются 106- и 122-сильные двигатели объемом 1.6 и 1.8. У «Рено» сама линейка силовых агрегатов обширнее. Для «Сандеро Степвэй» доступны 82-, 102- и 113-сильные 1,6-литровые двигатели.

Соответственно, за российским хетчбэком сохраняется преимущество и при сравнении ходовых характеристик. Однако разница здесь чисто номинальная и в реальной жизни не ощущается. «Икс-Рэй» потратит 11,1, а «Сандеро» — 10,4 секунды для разгона до 100 км/ч. Логичным следствием этого является чуть меньший расход топлива у французской модели, экономия также небольшая – 0,3 литра (6,9 в смешанном цикле).

Вместе с тем у «Рено» есть одно важное преимущество перед машиной от АвтоВАЗа — это наличие среди перечня предлагаемых КПП не только механики и вариатора (в исполнении City), но и классического автомата. Применяемая в машине японская АКПП заслужила репутацию безукоризненно надежной и ресурсной.

Итог сравнения

Подводя итог сравнения, можно заключить что «Сандеро» во многих отношениях является более выгодным вариантом. Французский автомобиль выигрывает по безопасности, эргономике, уровню оснащения, а также стоимости. Что касается дизайна салона и экстерьера, то у модели «Степвэй» они производят впечатление более дорогих, чем у отечественного конкурента.

Провести собственное сопоставление Renault Sandero Stepway против Lada XRAY и сделать выводы самостоятельно вы сможете после прохождения тест-драйва. В Красноярске расположены сразу два автосалона «СИАЛАВТО» — официального дилера «Рено». Вас ждут на проспекте Котельникова, 20, и улице Пограничников, 101а. Для записи на тест-драйв просто воспользуйтесь онлайн-формой на сайте.

Page not found — автомануал заказ автокниг с доставкой в любую точку мира

НАШИ ПАРТНЕРЫ:

Любой современный легковой или грузовой автомобиль можно обслуживать и ремонтировать самостоятельно, в обычном гараже. Все что для этого потребуется – набор инструмента и заводское руководство по ремонту с подробным (пошаговым) описанием выполнения операций. Такое руководство должно содержать типы применяемых эксплуатационных жидкостей, масел и смазок, а самое главное – моменты затяжки всех резьбовых соединений деталей узлов и агрегатов автомобиля. Итальянские автомобили – Fiat (Фиат) Alfa Romeo (Альфа Ромео) Lancia (Лянча) Ferrari (Феррари) Mazerati (Мазерати) имеют свои конструктивные особенности. Также в особую группу можно выделить все французские машины – Peugout (Пежо), Renault (Рено) и Citroen (Ситроен). Немецкие машины сложные. Особенно это относится к Mercedes Benz (Мерседес Бенц), BMW (БМВ), Audi (Ауди) и Porsche (Порш), в чуть меньшей — к Volkswagen (Фольксваген) и Opel (Опель). Следующую большую группу, обособленную по конструктивным признакам составляют американские производители- Chrysler, Jeep, Plymouth, Dodge, Eagle, Chevrolet, GMC, Cadillac, Pontiac, Oldsmobile, Ford, Mercury, Lincoln. Из Корейских фирм следует отметить Hyundai/Kia, GM-DAT (Daewoo), SsangYong.

Совсем недавно японские машины отличались относительно низкой первоначальной стоимостью и доступными ценами на запасные части, но в последнее время они догнали по этим показателям престижные европейские марки. Причем это относится практически в одинаковой степени ко всем маркам автомобилей из страны восходящего солнца – Toyota (Тойота), Mitsubishi (Мицубиси), Subaru (Субару), Isuzu (Исудзу), Honda (Хонда), Mazda (Мазда или как говорили раньше Мацуда), Suzuki (Сузуки), Daihatsu (Дайхатсу), Nissan (Ниссан). Ну, а машины, выпущенные под японо-американскими брендами Lexus (Лексус), Scion (Сцион), Infinity (Инфинити), Acura (Акура) с самого начала были недешевыми.

Отечественные автомобили также сильно изменились с введением норм евро-3. лада калина, лада приора и даже лада нива 4х4 теперь значительно сложнее в обслуживании и ремонте.

что делать если машина не заводится, как зарядить аккумулятор, как завести машину в мороз. ответы на эти вопросы можно найти на страницах сайта и книг. представленных здесь же

Автомануал — от англ. manual — руководство. Пособие по ремонту автомобиля или мотоцикла. различают заводские руководства и книги , выпущенные специализированными автомобильными издательствами.

Cайт Автомануал не несет никакой ответственности за возможные повреждения техники или несчастные случаи, связанные с использованием размещенной информации.

Флуоресцентный резонансный перенос энергии — обзор

3.1.3.1.2 Флуоресцентная спектроскопия

Общие принципы флуоресцентной спектроскопии здесь не объясняются. Его можно найти в специальных учебниках [48], и его краткое изложение представлено на рис. 3.17.

Рисунок 3.17. Общий принцип флуоресцентной спектроскопии. (A) Представление основных переходов между двумя синглетными состояниями молекулы. На остальной части этого рисунка синие и зеленые стрелки (темно-серая и серая стрелка в печатных версиях) представляют собой поглощение света и его излучение флуоресценцией, соответственно.Оранжевая стрелка (светло-серая стрелка в версиях для печати) представляет релаксацию энергии за счет безызлучательных процессов. Для простоты теоретически запрещенный переход в более низкоэнергетическое триплетное состояние «T» не был представлен, но он лежит в основе излучения фосфоресценции. (B) Схематическое изображение флуоресцентного спектрофотометра. (C) Химическая структура и абсорбция (синяя кривая (темно-серая в печатных версиях)) — эмиссионные (зеленая кривая (серая в печатных версиях)) спектры флуоресцеина.

Наиболее распространенными флуоресцентными фрагментами являются органические флуорофоры (кумарины, флуоресцеины, родамины, оксазины и цианины в порядке увеличения длины волны флуоресцентного излучения), хелаты лантаноидов или флуоресцентные наночастицы (см. Главу 6.9).

Двумя наиболее интересными аспектами для целей этой книги являются измерение динамической релаксации светового излучения, позволяющее определить характерные времена жизни флуоресценции, и определение расстояния между двумя флуорофорами (наложенными на одном или двух различных молекул), используя эффект резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET).

FRET обычно предназначен для определения расстояния (а также ориентации) между флуоресцентным донором ( D ) и акцептором ( A ). Эффективность безызлучательной передачи энергии между D и A зависит от следующего:

1.

Относительная ориентация D и A , которые рассматриваются как диполи

2.

Степень перекрытия спектров между спектром излучения флуоресценции D и спектром поглощения A

3.

Расстояние r между D и A

Если спектральное перекрытие между флуоресценцией D и поглощением A равно нулю, передачи энергии не будет, даже если D и A очень близки. Если есть спектральное перекрытие, то передача энергии масштабируется как величина, обратная шестой степени r , что типично для диполь-дипольных взаимодействий между небольшими молекулами (см. Главу 2.1). Эффективность передачи энергии тогда определяется как

(3,34) E = R06R06 + r6

В этом уравнении R ₀ является критическим расстоянием, для которого эффективность передачи энергии снижается до 50% от максимальное значение при r = 0.

В теории Ферстера R ₀ пропорционально квантовому выходу донора ( ϕ ) и интегралу спектрального перекрытия Дж между излучением спектр D и спектр поглощения A :

(3.35) R0 = (8,8 × 10-25) · K2 · ϕ · Jn4

, где K учитывает взаимную ориентацию D и A . n — показатель преломления используемого растворителя.

Перед проведением экспериментов FRET с определенной молекулярной системой необходимы следующие предварительные эксперименты:

1.

Квантовый выход донора должен быть измерен в растворителе, используемом для экспериментов FRET.

2.

Спектры флуоресценции D и спектры поглощения A необходимо измерить при концентрациях, используемых в эксперименте FRET для вычисления интеграла перекрытия J .

Эффективность FRET показана на рис. 3.18 для различных значений R ₀ .

Рисунок 3.18. Эффективность передачи энергии резонанса флуоресценции в зависимости от расстояния между D и A для R ₀ = 1 (), 2 ((серый в печатных версиях)) и 5 ​​((темно-серый в версии для печати)) нм.

На схемах в верхней части представлены изменения расстояния между D (обозначено звездочкой) и A (обозначено диском) по отношению к конформационному изменению.

Справедливость уравнения. (3.35) был критически протестирован для дансил- (Pro) _n -нафтилпептидов, проявляющих конформацию спирали полипролина типа II. Вдоль этой спирали расстояние между донором нафтила и акцептором дансила можно точно регулировать числом пролинов в аминокислотной последовательности [49].

FRET использовался для исследования многих механизмов реакции. Типичным примером является выяснение индуцированного вирусами слияния липидов, межфазного явления, имеющего фундаментальное значение в медицинских науках [50].

Флуоресцентная спектроскопия особенно полезна для исследования взаимодействий между биомакромолекулами, такими как белки, и их партнерами по связыванию. Действительно, взаимодействие может изменить локальную полярность вокруг флуорофора и, следовательно, локальные дипольные моменты. Это вызывает изменение положения либо самого низкого энергетического уровня (самая высокая занятая молекулярная орбиталь), либо / или энергетического уровня молекулярной орбитали возбужденного состояния (например, самая низкая незанятая молекулярная орбиталь) и, следовательно, изменение поглощения спектра, но еще более заметное изменение спектра излучения.

В качестве примера рассмотрим собственные флуоресцентные аминокислоты в белках. Соответствующие флуоресцентные группы представляют собой боковые цепи триптофана (Trp в трехбуквенном коде аминокислот), тирозина (Tyr) и фенилаланина (phe). Среди этих боковых цепей Trp имеет самый высокий квантовый выход эмиссии. Максимум спектра поглощения расположен при 280 нм, а максимум излучения — при 340 нм в воде. Но этот максимум излучения смещается в сторону более коротких длин волн (синее смещение), если Trp находится в гидрофобной внутренней части белка, и смещается в сторону более высоких длин волн, когда белок разворачивается (см. Главу 2.9).

Интенсивность флуоресценции также можно изменить с помощью процессов гашения. График отношения интенсивности флуоресценции в отсутствие гасителя, F ₀ , к интенсивности флуоресценции F в присутствии концентрации гасителя [ Q ] обычно дает прямую линию:

(3,36 ) F0F = 1 + KS · [Q]

Наклон этого так называемого уравнения Штерна – Фольмера дает константу тушения K _S , которая напрямую связана со временем жизни флуоресцентной группы в отсутствие тушителя, τ , и бимолекулярной константе скорости процесса тушения, k _q , согласно

(3.37) Ks = kq · τ

Экспериментально полученное значение k _q часто сравнивают с константой скорости диффузии для бимолекулярного процесса k _d = 2,0 × 10 ¹⁰ л моль ⁻¹ с ⁻¹ . Когда k _q > k _d , процесс закалки ограничен диффузией, и процесс закалки является «статическим». Это означает, что существует комплексное образование между флуоресцентной молекулой в основном состоянии и гасителем.Процесс гашения также может быть «динамическим», подразумевая образование комплекса между флуоресцентной молекулой в возбужденном состоянии и гасителем.

Наконец, еще одно интересное применение флуоресцентной спектроскопии состоит в проведении анализов конкурентного связывания. Флуоресцентной молекуле (теперь называемой «рецептором» R ) сначала разрешается взаимодействовать с известной молекулой C ( C для «конкурента»), которая действует как гаситель и, как известно, связывается с известным область рецептора.Затем интересующий лиганд, L , титруют в рецепторном растворе; если интенсивность флуоресценции изменяется, C замещается L , что означает, что L связывается с рецептором в месте, близком к C . Хорошо известными примерами конкурентов флуоресценции альбуминов являются варфарин и ибупрофен, которые действуют как маркеры сайтов для сайта I (расположенного в субдомене IIA альбуминов) и сайта II (расположенного в субдомене IIIA альбуминов), соответственно [51].

Теперь мы сосредоточимся на реализации флуоресцентной спектроскопии на поверхностях.

Передача энергии резонанса флуоресценции — обзор

2.1 Разработка зонда FRET для мониторинга активации каспаз

Технология FRET может предоставить ценную информацию о динамике и характере активности ферментов. Ранние зонды FRET для активации каспазы использовали гибридный белок, то есть белок с повышенной голубой флуоресценцией (ECFP) в качестве донора FRET, и белок с повышенной желтой флуоресценцией (EYFP) в качестве акцептора FRET, связанный пептидами, содержащими расщепление каспазы-3. последовательность, DEVD (Luo, Yu, Pu, & Chang, 2001; Rehm et al., 2002; Тяс и др., 2000). Наиболее важной особенностью зонда FRET является специфичность к молекуле-мишени. Коэффициент молярной экстинкции акцепторного белка является важным фактором для определения эффективности FRET; однако молярный коэффициент экстинкции EYFP, обычного флуоресцентного белка в акцепторах FRET, демонстрирует высокую чувствительность к протонам и ионам хлора, особенно в физиологических условиях (Jayaraman, Haggie, Wachter, Remington, & Verkman, 2000; Llopis, McCaffery, Miyawaki, Farquhar, & Tsien, 1998).В нескольких сообщениях предполагалось, что закисление происходит во время апоптоза (Matsuyama, Llopis, Deveraux, Tsien, & Reed, 2000; Perez-Sala, Collado-Escobar, & Mollinedo, 1995; Vincent, TenBroeke, & Maiese, 1999) и что хлорид / бикарбонатный обменник участвует в апоптотических событиях (Araki et al., 2002; Maeno, Ishizaki, Kanaseki, Hazama, & Okada, 2000). Поскольку изменение концентрации хлоридов также происходит в нейронах, крайне важно использовать нечувствительный к хлоридам индикатор для мониторинга активации каспаз в нейронах.Из-за этих особенностей исследователи должны быть осторожны в использовании EYFP в качестве акцептора FRET, особенно для визуализации апоптоза in vivo .

Чтобы преодолеть эти ограничения, Венера использовалась в качестве акцептора FRET в зонде SCAT3 (рис. 12.1; Takemoto et al., 2003), потому что он показывает низкую чувствительность к протонам и ионам хлора (Nagai et al., 2002). Действительно, SCAT3 показал высокую стабильность in vitro и в живых клетках по сравнению с ранее описанным зондом ECFP-EYFP (Takemoto et al., 2003). Разработка индикаторов SCAT3 позволила исследователям отслеживать активацию каспаз в живых клетках и in vivo в режиме реального времени (Campbell & Okamoto, 2013; Koto, Kuranaga, & Miura, 2009; Kuranaga et al., 2011; Nakajima, Kuranaga, Сугимура, Мияваки и Миура, 2011; Огуши и др., 2010; Такемото и др., 2007; Ямагути и др., 2011).

Обычно используемые флуорофоры FRET способствуют коллапсу неупорядоченного белка.

Значимость

Белки принимают неупорядоченные ансамбли до сворачивания, а иногда и как часть своей функции.Моделирование и исследования FRET часто описывают неупорядоченные конформации как более компактные, чем состояния случайных клубков, наблюдаемые при высоком денатуранте, тогда как малоугловое рассеяние рентгеновских лучей (SAXS) указывает, что эти конформации остаются расширенными. Устранение этого несоответствия улучшает наше понимание свойств белков, например, является ли вода достаточно плохим растворителем, чтобы вызвать неспецифический коллапс. Мы достигаем согласования, показывая, что добавление флуорофоров FRET уменьшает размеры неупорядоченного белка.Детальный анализ FRET и SAXS, наряду с учетом сокращения, индуцированного флуорофором, демонстрирует, что неупорядоченные и развернутые белки часто остаются сольватированными и расширенными без денатуранта, свойства, которые минимизируют неправильную укладку и агрегацию.

Abstract

Размеры, которые развернутые белки, включая внутренне неупорядоченные белки (IDP), принимают в отсутствие денатуранта, остаются спорными. Мы разработали процедуру анализа профилей малоуглового рассеяния рентгеновских лучей (SAXS) и использовали ее, чтобы продемонстрировать, что даже относительно гидрофобные IDP остаются почти такими же расширенными в воде, как и при высоких концентрациях денатуранта.Напротив, как показано здесь, большинство измерений резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET) показали, что относительно гидрофобные IDP значительно сокращаются в отсутствие денатуранта. Мы используем два независимых подхода для дальнейшего изучения этого противоречия. Во-первых, с помощью SAXS мы показываем, что флуорофоры, используемые в FRET, могут вносить вклад в наблюдаемое несоответствие. В частности, мы обнаружили, что добавление Alexa-488 к нормально расширенному IDP вызывает сокращение еще на 15%, что вполне соответствует сокращению, о котором сообщалось в исследованиях на основе FRET.Во-вторых, используя нашу процедуру моделирования и анализа для точного извлечения радиуса инерции (R _g ) и расстояния от конца до конца (R _ee ) из профилей SAXS, мы проверили недавнее предположение, что результаты FRET и SAXS могут можно согласовать, если R _g и R _ee являются «несвязанными» (т. е. больше не просто пропорциональными), в отличие от случая для гомополимеров случайного блуждания. Однако мы обнаружили, что даже для развернутых белков эти две меры измерений развернутого состояния остаются пропорциональными.Вместе эти результаты предполагают, что улучшенные процедуры анализа и коррекция значительных взаимодействий, управляемых флуорофором, достаточны для согласования предыдущих исследований SAXS и FRET, обеспечивая тем самым единую картину природы развернутых полипептидных цепей в отсутствие денатурирующего агента.

Белковые нарушения являются важным компонентом разнообразных клеточных процессов (1-4). В отличие от хорошо свернутых белков, которые населяют четко определенное функциональное состояние, развернутые и внутренне неупорядоченные белки (IDP) образуют широкий набор быстро взаимопревращающихся конформаций (3⇓⇓⇓⇓ – 8) с ошибками, которые плохо изучены и трудно измерить. .Особый интерес представляет степень, в которой ВПЛ заключают контракты в физиологических условиях (т. Е. В отсутствие денатурирующих агентов). Такое сокращение может иметь широкие последствия для нашего понимания сворачивания белков, взаимодействий и стабильности, а также действия денатурирующих веществ. Более того, понимание степени сжатия неупорядоченных ансамблей имеет глубокие последствия для разработки реалистичных симуляций складчатости и интерпретации малоуглового рассеяния рентгеновских лучей (SAXS) и измерений FRET (9, 10).

Наше понимание физико-химических принципов, лежащих в основе того, будет ли полипептидная цепь складываться, принимать неупорядоченный, но, тем не менее, относительно компактный ансамбль или вести себя как расширенное, полностью сольватированное, самоизбегающее случайное блуждание (SARW), недостаточно для объяснения существующих данных. Большая часть этого понимания получена из исследований белков, разворачиваемых высокими концентрациями денатурирующих веществ, таких как мочевина и гидрохлорид гуанидина (Gdn). В этих условиях все согласны с тем, что белки ведут себя как SARW с показателем Флори (ν), равным 0.60 в соотношении R _г ∝ N ^ν (N = длина цепи). Напротив, нет единого мнения относительно поведения ВПЛ при более низком уровне денатуранта или его отсутствии. В частности, в то время как многочисленные FRET (11⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓ – 25) и вычислительные исследования (11, 14, 18, 23, 26⇓⇓ – 29) утверждали, что расширенный неупорядоченный ансамбль обнаруживает при высоком уровне денатуранта значительно сокращается [обычно 25–50% при переходе на низкий денатурант или без него (ν <0,5)] (11, 14, 18, 23, 26 23 – 28, 30⇓⇓⇓⇓ – 35), аналогичное число исследований SAXS сообщают о незначительном сокращении или его отсутствии при тех же условиях (10, 36–41).

Разнообразные недавние исследования пытались примирить это несоответствие (Fig. 1 A ), которое имеет глубокие последствия для физики сворачивания белков. Применение более реалистичных симуляций и аналитических моделей привело к тому, что расстояния, полученные с помощью FRET, имеют меньшую денатурантную зависимость (Рис. 1 A , Bottom ) (40, 42⇓ – 44). Параллельно улучшены данные и анализ SAXS, включая использование безразмерного графика Кратки, чтобы подчеркнуть изменения ν, а не R _г (что важно, поскольку добавление флуорофоров на концах цепи увеличит R _г из-за их массы), также свидетельствовали о незначительном сокращении ниже 2 M Gdn (рис.1 A , Нижний ) (45, 46). Тем не менее, значительные расхождения сохраняются в отсутствие денатуранта, даже когда те же подходы используются для анализа одного и того же белка в идентичных условиях (рис. 1, SI, приложение , рис. S1 и S2, и Movie S1). Недавние исследования предложили, что это несоответствие может быть устранено с помощью целостного анализа (42, 43), подчеркивая разделение между обычно фиксированной пропорциональной зависимостью между R _g (определено из измерений SAXS) и R _ee (определено из Измерения FRET) без необходимости вызывать возмущение из-за присутствия флуорофоров (42).

Улучшенные процедуры анализа не устраняют расхождения между измерениями IDP, полученными с помощью SAXS и FRET. ( A ) Данные R17 SAXS и FRET (из ссылки 43). ( A , Top ) Сравнение результатов, полученных при подборе данных FRET в предположении гауссовой цепи и данных SAXS с использованием приближения Гинье. ( A , Bottom ) Данные SAXS и FRET подходят с использованием нашего метода анализа MFF и аналогичного подхода (45). Черная линия лучше всего подходит гиперболической линии тренда; серые линии — 95% доверительные интервалы.( B ) Профили SAXS для R17 ( слева, , данные из ссылки 43) и N98 ( справа, , данные из ссылки 42), согласованные с MFF, значительно отличаются от ожидаемого поведения с использованием значений ν, взятых из аналогичный анализ данных FRET. Сплошные линии обозначают область, используемую в процедуре подгонки; пунктирные линии представляют экстраполяцию к более высоким значениям q. Хотя подходило ~ 500 точек на кривую рассеяния (серый цвет), большинство показанных данных были объединены только для целей презентации (черные точки).Повороты или изгибы данных при более высоких значениях qR _g , скорее всего, связаны с ошибками при вычитании буфера, что является более сложным при высоком q, низкой концентрации образца и / или пониженном контрасте рассеяния (например, при высоком денатуранте, см. Материалы и методы ). ( C ) Тенденции гидрофобности (Кайт-Дулиттл) в зависимости от ν в отсутствие денатуранта, полученного из SAXS, путем применения MFF к опубликованным данным, собранным из последовательностей складываемых белков (42, 45, 67⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓). № – 82).Также показаны результаты исследований FRET, рассчитанные как в исх. 20 для опубликованных данных (20, 42). Красная линия тренда для данных FRET из исх. 20. Черная линия тренда лучше всего соответствует показанным результатам SAXS. ( C , Top ) Гистограмма гидрофобности репрезентативных белков в PDB (набор данных из ссылки 45). ( D ) Кумулятивные распределения ν для репрезентативных белков из PDB, выведенные из линий тренда, показанных в C .

Чтобы всесторонне сравнить результаты исследований SAXS и FRET, мы собрали опубликованные наборы данных для различных ВПЛ (рис.1 C и D и SI Приложение , таблица S3). При анализе с использованием нашего моделирования и молекулярного форм-фактора (MFF) исследования SAXS неизменно находят ν> 0,53 (среднее значение = 0,55), тогда как ν, полученное из исследований FRET, обычно падает ниже 0,50 (среднее значение = 0,46). Это расхождение 0,09 является существенным по отношению ко всему диапазону ν, который варьируется только от 0,6 (для SARW) до 0,5 (где внутрицепочечные взаимодействия одинаково благоприятны для взаимодействий растворитель-цепь) до 0,33 (для уплотнения в сферу; это несколько выше для несферических компактных состояний).В целом результаты SAXS предполагают, что конформационные ансамбли большинства развернутых белков и IDP с белковоподобным составом последовательностей сильно расширены (ν> 0,5) и вода является хорошим растворителем, тогда как FRET предполагает иное (рис. 1 D ). ).

Приведенные выше и другие результаты привели нас и других к поиску факторов, которые могут способствовать стойкому несоответствию между представлениями измерений IDP на основе SAXS и FRET (9, 29, 39, 42, 43, 47⇓⇓ – 50 ). Одна альтернатива, обозначенная в данном документе как «гипотеза разделения гетерополимера», утверждает, что гетерополимерная природа белков приводит к изменению взаимосвязи между R _g и R _ee , взаимосвязь, которая является фиксированной (т.е.е., независимо от длины цепи) в соотношении 6,3 для гомополимера SARW. Недавнее моделирование показывает, что это соотношение не может быть зафиксировано для развернутых белков, которые более сложны, чем гомополимеры (29, 39, 42, 43). Эта «развязка» предлагает возможное объяснение несоответствия между SAXS (который чувствителен к R _g ) и FRET (который чувствителен к R _ee ). Напротив, вторая гипотеза, обозначенная здесь «гипотеза взаимодействия флуорофора», предполагает, что в отсутствие денатуранта флуорофоры FRET взаимодействуют друг с другом и / или с полипептидной цепью, вызывая конформационный ансамбль конструкций, модифицированных флуорофором, к сокращаются больше, чем в отсутствие этих флуорофоров (9, 45, 47, 50, 51).

Здесь мы обращаемся как к гипотезе разделения, так и к гипотезе взаимодействия флуорофоров. Мы использовали SAXS, чтобы охарактеризовать радиус вращения IDP до и после добавления обычно используемого флуорофора. Мы обнаружили, что такая модификация флуорофора изменяет конформационный ансамбль в отсутствие денатуранта, уменьшая его размеры, измеренные методом SAXS, на 10–20%. В сочетании с улучшенными процедурами анализа с использованием реалистичных смоделированных ансамблей как для SAXS, так и для FRET, этого индуцированного флуорофором коллапса достаточно для согласования результатов исследований SAXS и FRET.Параллельно с этим мы представляем измерения SAXS на полиэтиленгликоле (PEG), подтверждающие предыдущие сообщения о том, что добавление флуорофоров также вызывает сокращение этого, в противном случае, полимера SARW (9), открытие, которое недавно было подвергнуто сомнению (42). Кроме того, мы показываем, что SAXS может извлекать R _g , ν и R _ee с точностью выше 97% при анализе с использованием нового MFF, разработанного для гетерополимеров. Эти симуляции достаточно точны для воспроизведения данных рассеяния без необходимости выбора только подансамбля конформаций, как это обычно используется в других процедурах подбора данных.Наконец, мы демонстрируем степень, в которой можно использовать небольшие отклонения от идеальности в данных SAXS, чтобы сделать вывод о смещениях внутри гетерополимерного конформационного ансамбля.

Результаты

Флуорофорная маркировка вызывает коллапс.

Чтобы напрямую проверить гипотезу взаимодействия флуорофора, мы измерили профили SAXS немодифицированного IDP и того же самого IDP, специфично модифицированного с помощью одной или двух копий широко используемого флуорофора FRET Alexa-488. Мы выбрали этот флуорофор, потому что он относительно небольшой и гидрофильный, что снижает вероятность образования взаимодействий, которые могут изменить развернутый ансамбль, по сравнению с большинством других флуорофоров FRET (43).В качестве тестового белка мы использовали PNt, IDP с хорошим поведением, содержащий 334 аминоконцевых остатка пертактина (52). Для получения PNt, модифицированного моно- и двойным флуорофором, мы использовали тиол-реактивный Alexa-488 для модификации остатков цистеина либо в положении 117 (PNtC-Alexa488), либо в положениях 29 и 117 (PNtCC-Alexa488). В качестве контроля мы использовали немодифицированный родительский белок (PNt) и алкилирование для получения конструкций без флуорофоров (PNtC-Alkd и PNtCC-Alkd).

Добавление Alexa-488 снижает размеры PNt, измеренные методом SAXS, как в отсутствие Gdm, так и при промежуточных концентрациях (рис.2 A и SI Приложение , таблица S1). В частности, при переходе от 4 к 0 M Gdn, R _g и ν уменьшаются почти вдвое больше для модифицированного флуорофором PNtCC-Alexa488, чем для PNtCC-Alkd или PNt (рис.2 B и SI Приложение ). , Таблица S1). Эти данные указывают на то, что присутствие Alexa-488 приводит к сокращению конформационного ансамбля PNt. Следует отметить, что в то время как 2 M Gdn является хорошим растворителем (ν> 0,50) для немеченого белка, мечение флуорофором приводит к измеримым внутримолекулярным взаимодействиям даже при этой относительно высокой концентрации денатуранта (рис.2 B , Правый ). В соответствии с общим происхождением эффекта, величина этого зависящего от денатуранта расширения качественно аналогична наблюдаемой FRET для множества других белков (Fig. 1 B ) (42, 43). Мы также наблюдали зависимое от флуорофора снижение среднего R _g и ν для конструкции с одной меткой PNtC-Alexa488 (рис. 2), что указывает на то, что, помимо предполагаемых взаимодействий флуорофор-флуорофор, взаимодействия флуорофор-белок также вносят вклад в наблюдаемое сокращение.

Добавление Alexa-488 изменяет разброс PNt. ( A ) Безразмерные графики Кратки для PNt дикого типа (серый), PNtCC-алкилированного (черный), PNtC-Alexa488 (одиночная метка, синий) и PNtCC-Alexa488 (двойная метка, красный) в 0,15 M KCl, 2 M Gdn и 4 M Gdn. Планки погрешностей представляют собой распространенную ошибку из SD, рассчитанного с учетом статистики подсчета (Пуассона), где σ = √counts. Данные были подогнаны и отображены в соответствии с процедурой, описанной на рис. 1 (см. Также Материалы и методы ).Результаты для алкилированного PNt неотличимы от PNt дикого типа, но есть значительные различия для PNt, меченного флуорофором Alexa-488. ( B ) R _g и ν как функция концентрации Gdn. Данные серых кривых из исх. 45.

Следует отметить, что это сокращение происходит, несмотря на установившиеся значения анизотропии флуоресценции для PNtCC-Alexa488, равные 0,11 и 0,08 в 0 и 2 M денатуранте, соответственно ( SI, приложение , таблица S2), ниже порогового значения, обычно рассматриваемого в качестве доказательства. свободного вращения прикрепленных к белкам флуорофоров (42, 53).Из этих результатов мы заключаем, что добавление даже одного из более мелких, более гидрофильных флуорофоров, обычно используемых для измерений FRET, может значительно уменьшить размеры неупорядоченной полипептидной цепи (42, 43, 53), наблюдение, которое помогает согласовать SAXS – FRET несоответствие.

Размеры ПЭГ, полученные методом SAXS, не зависят от концентрации полимера.

В более раннем исследовании мы сообщили, что добавление Alexa-488/594 к PEG приводило к денатурант-зависимому изменению FRET (9), аналогичному тому, которое наблюдается в развернутых белках.Однако сжатия не наблюдалось, когда эквивалентный немеченый полимер исследовали с помощью малоуглового рассеяния нейтронов. Было высказано предположение, что высокие (3 мМ) концентрации ПЭГ, использованные в этом исследовании рассеяния, маскируют то, что в противном случае было бы зависимым от денатуранта изменением в R _g (42). Чтобы проверить это, мы измерили профили SAXS в диапазоне концентраций ПЭГ и денатуранта и не обнаружили никаких доказательств значительного изменения размеров этого высокогидрофильного полимера (рис.3). Аналогичным образом, во всех условиях мы наблюдали показатель Флори, равный 0,60, что дополнительно подтверждает, что ПЭГ ведет себя как SARW независимо от концентрации денатуранта. Эффекты флуорофора, а не сокращение цепи, таким образом, остаются простейшей интерпретацией денатурант-зависимых изменений FRET, ранее наблюдавшихся для меченных флуорофором вариантов этого полимера (9).

SAXS ПЭГ не зависят от денатуранта. ( A ) Безразмерные графики Кратки для ПЭГ 24 кДа при 0.5 мМ и 0,05 мМ в 0,15 M KCl, 2 M Gdn и 4 M Gdn. Нормализованный профиль рассеяния PEG 24 кДа не изменяется от 0 до 4 M Gdn в широком диапазоне концентраций PEG. Для ясности профили рассеяния смещены по вертикали. Данные были подогнаны и отображены с использованием процедуры, описанной на фиг. 1. ( B ) R _g и ν как функции концентрации Gdn для 0,5 мМ и 0,05 мМ PEG. Открытые и закрытые точки смещены по горизонтали для ясности.

Проверка гипотезы о разделении гетерополимеров.

Взятые вместе, вышеупомянутые наблюдения показывают, что флуорофоры, добавленные к IDP, приводят к значительному сокращению, что способствует различным выводам, сделанным из предыдущих исследований SAXS и FRET. Эти наблюдения, однако, не исключают возможность того, что, как утверждалось ранее (42), разделение гетерополимера (то есть соотношение между R _ee и R _g , отклоняющееся от фиксированной пропорциональности, наблюдаемой для гомополимеров) также может вносить свой вклад. к расхождению SAXS – FRET.

Чтобы исследовать, приводит ли конформационный ансамбль реалистичного гетерополимера к значительной непропорциональности между R _ee и R _g , мы использовали Upside, наши модели Cβ-уровня (54, 55), чтобы смоделировать рассеяние для развернутых ансамблей. 50 белков из 250–650 остатков, случайно выбранных из банка данных по белкам (PDB). В своей простейшей версии Upside представляет собой каркас полипептида с шестью атомами на остаток (N, Cα, C, H, O и Cβ) и использует зависимые от соседей карты Рамачандрана, полученные из библиотеки катушек (56).Такие модели способны воспроизводить R _g и NH остаточные диполярные связи (RDC), наблюдаемые в развернутых белках; эти два параметра чувствительны к глобальным и локальным свойствам магистрали соответственно (57, 58). Для создания ансамблей гетерополимеров мы отнесли каждый Cβ как гидрофобный, так и полярный (H / P). Благоприятные профили взаимодействия (форма, показанная в ссылке 45, SI, приложение , рис. S3 A ) вводятся только между атомами Cβ гидрофобных остатков, а самоуничтожение накладывается на все атомы.Для каждой из 50 последовательностей мы использовали 30 различных сил взаимодействия Cβ. После создания этих 1500 ансамблей H / P конформаций скелета мы добавили явные боковые цепи (59), а затем рассчитали профили рассеяния гидратированных версий белков (60).

Для этих 1500 ансамблей мы сравнили истинные значения R _g , ν и R _ee , рассчитанные непосредственно из атомных координат, со значениями, полученными путем аппроксимации моделированного рассеяния (с добавлением реалистичных случайных ошибок) с использованием нашей оригинальной MFF, разработанной для гомополимеров (45).Как и в случае гомополимеров, мы находим, что значения R _ee и R _g , наблюдаемые в этих симуляциях, пропорциональны (т. Е. Остаются связанными) с коэффициентом корреляции R ² = 0,99 (рис. 4 А ). Затем мы аппроксимируем смоделированные профили рассеяния для определения R _g ^для , ν ^для и R _ee ^для , причем последнее получено с использованием соотношения (R _ee / R _g ) ² = G (ν), где G (ν) была откалибрована с использованием нашего исходного моделирования гомополимеров ( SI Приложение , рис.S1 D ). Мы обнаружили среднее абсолютное отклонение всего 1,3 Å, 0,011 и 4,2 Å соответственно, что представляет собой среднюю абсолютную ошибку 3%, 2% и 4% в R _g , ν и R _ee ( SI Приложение , рис. S3). Наибольшие отклонения наблюдаются для более компактных конструкций; для более протяженных конформаций (ν> 0,54) ошибка составляет ∼2%. Корреляция R _g ^{соответствует} и R _ee ^{соответствует} осталась высокой, R ² > 0.99.

Моделирование обнаруживает сильную связь между R _g и R _ee , а профили SAXS являются надежным показателем R _g , ν и R _ee , а также дают информацию о степени неоднородности. ( A ) Связывание между R _g и R _ee , полученное из смоделированных ансамблей с использованием модели H / P (черный) или нашего потенциала, используемого для сворачивания белков (красный). ( B — D ) Сравнение R _g , ν и R _ee , рассчитанных на основе координат смоделированных ансамблей, со значениями, полученными при подгонке с нашим MFF _het (R _g , ν) с SAXS профили ансамблей со случайно добавленными экспериментальными ошибками.( E ) Отклонения в ν _концов наблюдаются для гетерополимеров с менее хорошо смешанными H / P-образцами (полученными путем аппроксимации наклона зависимости внутрицепочечного расстояния R _{| i — j |} от разделение последовательностей, | i — j |, где | i — j |> N / 2). ( F ) Эффекты Δν _end при различных значениях ν. ( G ) Экспериментальные данные, соответствующие MFF (R _g , ν, Δν _конец ), демонстрируют, что мечение флуорофора и образование петли через дисульфидные связи в PNt вызывает значительные и измеримые отклонения.

Чтобы еще больше уменьшить небольшую ошибку, связанную с применением нашего MFF, полученного из гомополимеров, к рассеянию гетерополимеров, мы создали новый молекулярный форм-фактор, MFF _het , используя моделирование H / P, описанное выше, и ту же общую процедуру. как описано в исх. 45. Применение этого слегка модифицированного MFF _het снижает ошибки в подогнанных R _g , ν и R _ee до 0,5, 0,005 и 2,7 Å, соответственно, что составляет 1%, 1% и 2% среднего значения. абсолютная погрешность (рис.4 B — D ). Эти результаты демонстрируют, что наша процедура анализа на основе MFF возвращает точные значения для R _g и R _ee , которые остаются пропорциональными (т. Е. Связанными) даже для гетерополимеров.

Далее мы рассмотрели, насколько наши выводы чувствительны к деталям нашей модели или энергетической функции. Чтобы проверить это, мы провели дополнительное моделирование с использованием более подробной версии алгоритма Upside, который способен сворачивать de novo белки с <100 остатками (54, 55).В этой версии каждая из 20 боковых цепей представлена ​​многопозиционным эксцентриковым валиком, который позволяет детально упаковать сердечник. Энергетическая функция включает водородные связи, взаимодействия боковая цепь-боковая цепь и боковая цепь-основная цепь, аминокислотно-зависимые потенциалы двугранного угла и член десольватации. Используя эту модель, мы сгенерировали 30 ансамблей для каждого из шести белков (PNt и пять других белков, случайно выбранных из 50, описанных выше), используя короткие симуляции, которые выбирают только развернутое состояние.Мы получили ансамбли, выполнив моделирование обмена репликами в диапазоне температур от 280 до 320 К, как описано ранее (54, 55). Значения ν, полученные из этих ансамблей, находились в диапазоне от 0,4 до 0,6 в зависимости от температуры моделирования. Примечательно, что значения R _ee , R _g и ν, полученные непосредственно из этих более реалистичных ансамблей, находятся в хорошем согласии со значениями, определенными после подгонки с нашим MFF _het , с почти такой же точностью, что и для более простого H / P-ансамбли (рис.4 A — C , красные точки). Кроме того, непосредственно вычисленные значения для R _g и R _ee для ансамблей остаются пропорциональными с коэффициентом корреляции R ² = 0,99. Следовательно, наш вывод, что R _g и R _ee остаются связанными даже для гетерополимеров, устойчив к деталям нашего моделирования.

Измерение отклонений от идеальности в гетерополимерах.

MFF _het точно отражает общие размеры неупорядоченных гетерополимеров для белковоподобных последовательностей H / P и может использоваться в большинстве случаев.Тем не менее, небольшие, но измеримые отклонения наблюдаются для белков в нашем тестовом наборе с менее хорошо смешанными паттернами H / P ( SI, приложение , рис. S4). Эти различия можно увидеть на графике распределения внутримолекулярных расстояний, где наклон на расстояниях разделения | i — j | > N / 2 может отличаться от среднего наклона, который определяет глобальное значение ν (рис. 4 D ). Мы определяем изменение наклона как Δν _конец (рис. 4 D ). Отрицательные значения Δν _end коррелируют с преобладанием гидрофобных остатков на концах полипептидной последовательности (рис.4 D и SI Приложение , рис. S4 C ) и с отклонениями в G (ν) ( SI Приложение , рис. S4 A ) ( R ² ∼ 0,84). Профиль МУРР наиболее чувствителен к Δν _end при низком qR _g (рис. 4 E ).

Для количественной оценки неидеальности гетерополимеров на основе данных SAXS мы создали более общий трехпараметрический форм-фактор, MFF _general (R _g , ν, Δν _end ) (рис.4 E и F и Movie S2). Чтобы продемонстрировать его способность давать полезную информацию, мы подобрали данные из PNt, PNtCC-Alexa488 и циркулярного (с дисульфидными связями) PNtCC при 2 M Gdn (рис. 4 F ). Δν _конец уменьшается с ∼0 для PNt до приблизительно -0,1 для PNtCC-Alexa488 и примерно до -0,2 для кольцевых PNtCC, что согласуется с увеличением взаимодействий на аминоконце цепи. Менее резкие возмущения, такие как менее хорошо смешанные паттерны H / P и более короткие аминокислотные последовательности с более низким полезным диапазоном qR _g , могут потребовать более высокого отношения сигнал / шум для измерения Δν _end .Тем не менее, эти данные демонстрируют потенциал SAXS для выявления для неупорядоченных полимеров зависимых от последовательности отклонений от поведения гомополимера (рис. 4 E и F ), при этом все еще точно измеряя R _g и ν (рис. 4 ). А — С ).

В пределе бесконечной длины цепи масштабный показатель Флори ν имеет значения 0,33, 0,50 и 0,60, соответствующие глобулам, случайным блужданиям и SARW, соответственно. Тем не менее, мы и другие придерживаемся прагматического подхода и позволяем ν принимать промежуточные значения; е.g., как получено из наклона графиков масштабирования R _g в зависимости от длины цепи или R _ij в зависимости от | i — j | ( SI Приложение , рис. S6). В поддержку этого подхода можно наблюдать при увеличении силы внутрицепочечного взаимодействия уменьшение как I (q) при высоком q, так и наклона графиков масштабирования для белков из 100-1000 остатков (Fig. 4). Соответственно, мы считаем, что использование значений ν за пределами трех канонических значений обеспечивает законный и практический подход для сравнения качества растворителей для систем разного размера и классификации, является ли вода хорошим или плохим растворителем для полимеров конечной длины.

Обсуждение

В то время как измерения SAXS указывают на то, что вода является хорошим растворителем (ν> 0,5) для развернутых полипептидов, исследования на основе FRET обычно сообщают об обратном (ν <0,5). Однако мы обнаруживаем, что сочетание улучшенных процедур анализа и более тщательного рассмотрения взаимодействий флуорофор-флуорофор и / или флуорофор-цепь достаточно для объяснения этого несоответствия. Эти находки приводят к единой картине, в которой развернутое состояние белков представляет собой SARW при высоком денатуранте и сжимается лишь незначительно (намного меньше, чем ранее сообщалось в литературе FRET) в отсутствие денатуранта.В частности, мы обнаружили, что мечение с помощью Alexa-488, обычно используемого флуорофора FRET, может изменить конформационный ансамбль IDP, уменьшая R _g и ν, даже когда анизотропия флуоресценции низка по сравнению с принятыми пределами для свободного вращения флуорофора ( 42, 53). В сочетании с предыдущими исследованиями (9) аналогичные выводы можно сделать для PEG, известного SARW. Эти результаты, наряду с нашим предыдущим результатом о том, что неупорядоченные цепи претерпевают умеренное расширение денатуранта (45), и улучшенными методами извлечения значений R _g из данных FRET (40, 42–44), теперь обеспечивают достаточную основу для устранения несоответствий. между SAXS и FRET по размерам неупорядоченных белков.Фундаментальный и важный вывод полученной единой картины состоит в том, что даже в отсутствие денатурирующего агента вода остается хорошим растворителем для большинства развернутых белков.

Наши данные об эффектах, индуцированных флуорофором, согласуются с предыдущими выводами о том, что молекулярные размеры, выведенные из FRET, могут зависеть от используемой пары флуорофоров, при этом более гидрофобные флуорофоры приводят к большему сокращению (43). МД-моделирование с парой флуорофоров Alexa-488/594, например, привело к 10% сокращению IDP даже в 1 М мочевины (61).Аналогичным образом недавнее исследование показало, что сигналы одномолекулярных FRET (smFRET) как от ДНК, так и от PEG зависят от условий растворителя, при которых размеры цепей, как ожидается, будут инвариантными (51). Однако, явно не согласившись с нашими данными, Fuertes et al. (42) провели измерения SAXS на пяти IDP с и без Alexa-488/594 и пришли к выводу, что в среднем изменения, наблюдаемые при добавлении флуорофоров, были минимальными. Однако при рассмотрении каждого белка в отдельности различия кажутся значительными по сравнению с узким диапазоном возможных значений.В частности, для пяти белков, охарактеризованных в этом исследовании, ν _{без метки} — ν _метка = 0,08, 0,03, 0,03, -0,02 и -0,04 (или 0,09, 0,06, 0,03, -0,02 и -0,08 при анализе с использованием наши процедуры; SI Приложение , рис. S5). Хотя Fuertes et al. (49) утверждают, что только один белок (NLS) демонстрирует сокращение, индуцированное флуорофором, на самом деле четыре из пяти протестированных белков имели статистически значимые индуцированные флуорофором изменения в ν, причем более половины из них демонстрировали сокращение, индуцированное флуорофором (42). по величине, аналогичной сокращению, которое мы наблюдали для меченного флуорофором PNt в воде (45) ( SI Приложение , рис.S5). Вместе эти данные подтверждают согласованную картину возмущений, вызванных флуорофором, которые вносят свой вклад в различия в величине и денатурирующей зависимости R _g , полученные с помощью SAXS и FRET.

Другой фактор, который, как предполагалось, способствовал расхождению между результатами SAXS и FRET, — это отклонения от пропорциональной зависимости между R _g и R _ee , которые могут возникнуть при анализе гетерополимеров по сравнению с гомополимерами (42). В основе этой точки зрения лежит наблюдение, что если переоценить ансамбль (т.е., вычисляет R _g с использованием только подмножества конформаций), многие возможные значения R _ee согласуются с любым заданным R _g (и наоборот). Вместо того, чтобы выбирать подансамбль конформаций для соответствия паре параметров, мы выбрали альтернативный подход (45). С самого начала мы создаем физически правдоподобные ансамбли, создаем MFF, используя все эти ансамбли, и проверяем, соответствует ли он данным в целом. Мы обнаружили, что наша MFF точно соответствует всему профилю рассеяния (а не только R _g ), что обеспечивает надежную поддержку нашей процедуры.Поскольку мы можем вычислить значения R _g и R _ee непосредственно из базовых ансамблей, у нас есть процедура для получения этих двух параметров путем подгонки данных SAXS с нашим MFF. Мы обнаружили, что для реалистичных денатурированных ансамблей складываемых последовательностей смоделированные пары R _g и R _ee , а также их аналоги, определенные из профилей рассеяния, пропорциональны ( R ² > 0,99). Это оставляет красители как источник остающегося несоответствия между SAXS и FRET.

Используемый нами MFF несовершенен в том смысле, что несколько разные ансамбли могут быть подобраны с использованием одних и тех же параметров R _g и ν. Но для этих двух параметров ошибка очень мала по сравнению с их истинными значениями (Рис. 4 A — C ). Учет эффектов гетерополимера не меняет этого вывода. Из этих результатов мы пришли к выводу, что SAXS хорошо подходит для извлечения как R _g , так и R _ee для неупорядоченных гетерополимеров, избегая при этом потенциальных артефактов из-за взаимодействий флуорофора с полипептидными цепями.Этот вывод не отрицает возможности FRET для измерения динамики, связывания и конформационных изменений; Однако в нем подчеркивается, что следует проявлять осторожность при использовании FRET для определения количественных расстояний в исходной немеченой биомолекуле.

Почти дюжина наборов данных IDP SAXS, представленных здесь, и ранее (45), как было показано, хорошо подходят для нашего общего MFF ( SI Приложение , таблицы S1 и S3). Это открытие предполагает, что взаимодействия, приводящие к сокращению цепи, распространяются по белковым последовательностям.Водорастворимые, хорошо уложенные белковые последовательности обычно представляют собой хорошо перемешанные гетерополимеры с относительно небольшими участками последовательных гидрофобных остатков (62). Эти хорошо перемешанные последовательности имеют тенденцию вести себя как гомополимеры при измерении глобальными методами с низким разрешением, такими как SAXS. Действительно, мы продемонстрировали, что при достаточном качестве данных плохо смешанные последовательности можно идентифицировать по их отклонению от нашего MFF (Рис. 4 D — F ). Большие отклонения могут возникать у некоторых IDP, особенно с частичным сворачиванием, необычным формированием паттерна последовательности (например.g., блок-сополимеры) и / или в условиях тесноты, которые могут выполнять определенные функции (63, 64).

Представленная здесь унифицированная картина, касающаяся исследований SAXS и FRET развернутого состояния в отсутствие денатуранта, усиливает мнение о том, что вода является хорошим растворителем для большинства развернутых полипептидов, свойство, которое должно уменьшать неправильную укладку и агрегацию, одновременно облегчая синтез и транспорт. То, что большинство белков, тем не менее, легко сворачивается в воде, предполагает, что взаимодействия, управляющие сворачиванием, являются более стабилизирующими, т.е.е. преодолеть способность воды сольватировать развернутое состояние — чем те, которые способствуют неспецифическому коллапсу. Действительно, наблюдение, что, несмотря на минимальные доказательства значительного сокращения развернутого состояния даже при полном отсутствии денатуранта, некоторые белки остаются стабильно свернутыми до 6 M Gdn (41, 65), предполагает, что нативные взаимодействия гораздо более благоприятны, чем любые другие. неспецифические взаимодействия, связанные с коллапсом. Однако, учитывая высокоспецифический характер взаимодействий, образующихся в нативных белках, их способность преодолевать сольватацию развернутой цепи, возможно, не удивительна.

Материалы и методы

PNtCC и PNtC были экспрессированы в Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS и очищены от телец включения, как описано ранее (45, 52, 66), со следующими модификациями. После солюбилизации телец включения конструкции PNt повторно укладывали в 50 мМ Трис, pH 7,2, с 50 мМ β-меркаптоэтанола (βМЕ). Перед заключительной стадией эксклюзионной хроматографии к исходному белковому раствору добавляли 20 мМ βМЕ.

Дополнительную информацию об алкилировании белков и маркировке Alexa-488, а также об измерениях стационарной анизотропии, анализе данных SAXS и моделировании можно найти в приложении SI .

Примечание добавлено в доказательство.

Во время обзора было опубликовано исследование, в котором флуорофоры участвовали в усилении аффинности связывания между двумя IDP (83).

Благодарности

Мы благодарим Шриниваса Чакраварти и М. Чемпиона за их помощь в области SAXS и масс-спектрометрии соответственно; и О. Бильсель, Х. С. Чан, С. Такахаши, Р. Бест, Р. Паппу, Д. Тирумалай, Ю. Бай, А. Холхаус, Э. Мартин и Б. Шулер за полезные обсуждения. Работа поддержана грантом NIH Grants GM055694 (Т.R.S.) и GM130122 (для T.R.S. и P.L.C.), Фонд W. M. Keck Foundation (P.L.C.) и Национальный научный фонд гранты GRF DGE-1144082 (для J.A.R.) и MCB 1516959 (для C.R. Matthews, который финансировал периодические встречи между нашими лабораториями). Использование Усовершенствованного источника фотонов, пользовательского объекта Управления науки, находящегося в ведении Управления науки Министерства энергетики (DOE) Аргоннской национальной лабораторией, поддерживалось Министерством энергетики в рамках контракта DEAC02-06Ch21357. Этот проект поддержали NIH 2P41RR008630-18 и 9 P41 GM103622-18.

Сноски

• Вклад авторов: J.A.R., M.A.B., K.W.P., P.L.C. и T.R.S. спланированное исследование; J.A.R., M.A.B., A.M.Z., P.L.C. и T.R.S. проведенное исследование; J.A.R., M.A.B., P.L.C. и T.R.S. внесены новые реагенты / аналитические инструменты; J.A.R., M.A.B., P.L.C. и T.R.S. проанализированные данные; и J.A.R., M.A.B., K.W.P., P.L.C. и T.R.S. написал газету.

• Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

• Эта статья представляет собой прямое представление PNAS.

• Эта статья содержит вспомогательную информацию на сайте www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1813038116/-/DCSupplemental.

Что нужно знать о Jumbo Frets

Это должно быть очевидно, правда? Чем больше лады, тем больше тон, и это звучит так, как будто мы все хотим от наших гитар.

Однако, как и во многих других случаях с гитарой, правда не всегда так проста. Размер и форма ладов могут повлиять на многие аспекты звучания и ощущений вашей гитары, поэтому стоит взглянуть на картину в целом, прежде чем делать какие-либо быстрые выводы.

В уравнении «толще провода = толще тон» нет ничего нового. С тех пор, как стали доступны гигантские лады, многие великие музыканты — Рори Галлахер, Стиви Рэй Воган, Кенни Уэйн Шеперд — были известны тем, что повторно ладили в своих Fender Stratocasters, в частности, с помощью гигантской проволоки (винтажные Strats, возможно, давали более драматичный вид и раньше, и после изображения, чем некоторые другие гитары, так как они родились с узкими ладами).

Больше металла в любом фиксированном компоненте обычно означает большую вибрационную связь между струной и деревом, так что, по-видимому, в этой теории что-то есть.Но что еще меняется с размером лада?

Размер и форма ладов могут повлиять на многие аспекты звучания и ощущений вашей гитары, поэтому стоит взглянуть на картину в целом, прежде чем делать какие-либо быстрые выводы.

Хотя большие лады, похоже, дают более округлый тон, возможно с увеличенным сустейном они также дают несколько менее точную ноту, чем более узкие лады — по крайней мере, при рассмотрении «под микроскопом».

Если только он не имеет очень точной формы и часто одевается, широкая корона этого гигантского лада может хоть немного «размыть» вашу ноту, что может даже быть частью звуковой привлекательности для некоторых игроков — как, например, tweed Deluxe выглядит немного более размытым или более волосатым при большинстве настроек громкости, чем blackface Deluxe.Однако имейте в виду, что это явление может работать и против некоторых звуковых целей.

Поскольку они представляют собой более тонкую точку излома на конце шейки струнной длины выступающей длины, более узкие лады винтажного калибра, как правило, более точны в своей точности записи. Благодаря этому вы, как правило, получаете более резкий тон, возможно, с повышенной точностью интонации, плюс в некоторых случаях повышенную четкость обертонов, которые можно было бы услышать как немного больше «мерцания».

Если вы думаете, что это все характеристики классического звука Fender, вы были бы правы — по крайней мере, пока вы не измените эти винтажные лады на jumbo.

Узкие лады не должны быть слишком сложными для сгибания, если они не сильно изношены, и они также оставляют немного больше места для пальцев на грифе

Но более узкие лады также использовались на Gibson Les Paul до 1959 года. , поэтому их характеристики применимы и к этим гитарам. Голдтоп ’57 с PAF звучит тонким или слабым из-за узкой лада?

Маловероятно, в основном потому, что на его тон влияет множество других факторов — древесина корпуса, конструкция грифа, длина звукоряда, звукосниматели — а влияние узких ладов не перевешивает ни один из них.Однако это влияет на общее звучание гитар той эпохи, которое всегда является продуктом множества различных ингредиентов.

Калибр лада может иметь большее влияние на ощущение игры, чем на тон для многих гитаристов. Более широким ладам часто приписывают более плавное и маслянистое ощущение игры, что также облегчает сгибание струн.

Легкость изгиба также повышается за счет более высоких ладов, широких или узких. На узких ладах не должно быть слишком сложно гнуть, если только они не сильно изношены, и они также оставляют немного больше места для пальцев на грифе — особенно на высоких позициях — что может больше подойти некоторым музыкантам.

В конечном счете, если вы в основном играете рок, более тяжелый блюз или любой клочок или металл, вы можете предпочесть лады jumbo или medium-jumbo. Однако для кантри, рокабилли, серфинга или олдскульного рок-н-ролла 50-х узкие лады могут быть лучшим выбором.

В любом случае, однако, если ваши лады в хорошем состоянии и ваша гитара настроена правильно, размер этой проволоки сам по себе не должен мешать вам отлично звучать на любой игре.

Engineering Dark Chromoprotein Reporter for Photoacoustic Microscopy and FRET Imaging

Общие методы

Все синтетические ДНК-олигонуклеотиды, используемые для клонирования, и библиотеки были приобретены у Integrated DNA Technologies (Coralville, IA).Плазмидная ДНК Miniprep, полимеразные цепные реакции (ПЦР), расщепление рестрикционными ферментами, лигирование и электрофорез в агарозном геле проводили согласно Sambrook et al. ⁴¹ ДНК-полимераза Pfu была получена из Fermentas, используемого для регулярной ПЦР, а набор QuikChange Multi был приобретен у Agilent Technologies и использовался для сайт-направленного мутагенеза. Все рестрикционные ферменты были получены от Fermentas или New England Biolabs. ДНК-лигаза Т4 была получена от Life Technologies.Продукты ПЦР и расщепления очищали с помощью набора для быстрой экстракции из геля QIA (QIAGEN, Валенсия, Калифорния) или набора для экстракции из геля GeneJET (Fermentas) в соответствии с инструкциями производителя. Все секвенирование проводилось в отделе молекулярной биологии Университета Альберты или в основных службах ДНК Университета Калгари. Все фильтры для флуоресцентной визуализации были приобретены у Chroma Technology (Рокингем, Вирджиния), Omega Filters (Браттлборо, Вирджиния) или Semrock (Рочестер, штат Нью-Йорк).

Очищенный белок и препарат

Случайный мутагенез выполняли с помощью подверженной ошибкам полимеразной цепной реакции (ПЦР), как описано в Fromant et al. ⁴² . Вкратце, Ultramarine в pQE9N (Qiagen) и cjBlue в pRSET-B (Life Technologies) были амплифицированы с 5′-прямым праймером XhoI и 3′-обратным праймером HindIII с использованием полимеразы Taq (New England Biolabs) в присутствии MnCl. ₂ . Библиотеки полноразмерных генов переваривали с помощью XhoI / HindIII (Fermentas) и лигировали в плазмиду pBAD / His B, расщепленную аналогичным образом, с ДНК-лигазой Т4 (Life Technologies).Плазмидные библиотеки экспрессировали в штамме E.coli Dh20B (Life Technologies) на чашках с агаром LB (Luria-Bertani) с добавлением 0,1 мг / мл ампициллина и 0,02% L-арабинозы при 37 ° C в течение ночи. Свежий 0,2% агар накладывали на верхнюю часть колоний перед скринингом PA для уменьшения загрязнения.

Скрининг на основе поглощения

Колонии E. coli , экспрессирующие библиотеки Ultramarine или cjBlue, выращивали на 10-сантиметровых чашках Петри. Верхние 20-30 колоний с наиболее темным цветом были вручную собраны в 4 мл среды LB с добавлением 0.1 мг / мл ампициллина и 0,02% L-арабинозы и инкубировали в течение ночи. Экстракты сырого протеина получали с использованием B-PER Protein Extraction Reagen’t (Pierce / Thermo Scientific). 100 мкл сырых белковых экстрактов подвергали тесту на абсорбцию, и спектры (сканирование с длиной волны 400-800 нм) регистрировали с помощью спектрофотометра УФ-видимого излучения DU-800 (Beckman). После сравнения максимального поглощения были выбраны 5–10 победителей, которые использовались в качестве матрицы для следующего раунда мутагенеза.

Строительство тандема Ультрамарин 7.2 димер

Для создания тандемного димера димер Ultramarine 7.2 в pBAD / His B амплифицировали в двух отдельных реакциях ПЦР. В первой реакции были введены сайты рестрикции 5 ‘XhoI и 3’ PstI. Во второй реакции вводили 5’PstI с линкером и 3’HindIII. Стратегия трехстороннего лигирования обеспечивала тандемный ген формы A-линкер-A в сайтах XhoI / HindIII pBAD / His B, где линкер представлял собой последовательность из 13 остатков (SCSGTGSTGSGSS), которая включала сайт рестрикции PstI.

Характеристика белка

Спектры поглощения исходной и вариантной белковых структур измеряли путем помещения разбавленных образцов в кварцевые микрокюветы диаметром 1 см в спектрофотометр УФ-видимого диапазона DU-800 (Beckman).Коэффициенты молярной экстинкции определяли с использованием измерений абсорбции для серийных разведений белка, известной концентрации белков и уравнения Бера-Ламберта.

мЧерри использовали в качестве эталона для определения квантового выхода CP. Вкратце, были созданы серийные разведения стандарта и белков с оптической плотностью 0,01–0,1. Спектры флуоресценции образцов регистрировали с помощью спектрофлуориметра QuantMaster (Photon Technology International).Квантовый выход может быть определен с помощью уравнения Φ _{образец} = Φ _эталон × (S _{образец} / S _{стандарт} ), где Φ представляет квантовый выход, а S представляет наклон кривых, полученных путем построения общего интенсивность флуоресценции (интегрированная по длине волны) в зависимости от поглощения.

Фотоакустическая система

На рисунке 1b показана схема экспериментальной установки. Nd: YAG-лазер с модуляцией добротности 10 Гц (SLIII-10, Continuum) и оптический параметрический генератор (SL OPO Plus, Continuum) использовались для генерации длин волн от 450 до 700 нм.Свет вводился в световод (CeramOptec Industries, 900 волокон [диаметр сердцевины 185 мкм, диаметр оболочки 200 мкм, диаметр оболочки 250 мкм], NA = 0,26 / 0,37 ± 0,02) с одним входом и десятью выходами для направления света на образец, гомогенизируйте форму луча и равномерно освещайте образец. Выходы световода были расположены концентрически вокруг сфокусированного ультразвукового преобразователя 25 МГц и 12,7 мм (V324-SM, Olympus Panametrics-NDT) таким образом, чтобы центр светового пятна был совмещен с фокусом преобразователя.Держатель для преобразователя и световода был установлен на моторизованном столике для растрового сканирования и позиционирования преобразователя. Камеру использовали для визуализации образцов, проверки совмещения ультразвука и образца и обнаружения колоний E. coli на чашках с агаром. Для автоматического определения местоположения колоний использовалось преобразование Хафа на основе круга. Это позволяло сканирование от колонии к колонии, а не растровое сканирование, что сокращало время, необходимое для каждой чашки.

Акустические и PA-сигналы, обнаруженные преобразователем, были усилены на 39 дБ с помощью блока импульсного приемника (5073PR, Olympus Panametric NDT) и записаны с помощью карты сбора данных (CS8229, Gage Applied Technologies). Для чересстрочной PA и ультразвуковой визуализации использовалась карта цифрового ввода-вывода (NI CB-2162, National Instruments) для синхронизации ультразвуковой и лазерной систем, аналогично предыдущей работе ⁴³ . Сигнал фотодиода был записан и использовался для нормализации сигналов PA.

Для определения характеристик PA очищенные белки или ресуспендированные клеток E. coli (1–10 × 10 ⁹ клеток / мл) разводили в PBS и вводили в пробирку с внутренним диаметром 1,57 мм (PE-205, Intramedic ). Пробирки были запечатаны и помещены под преобразователем для сканирования в M-режиме (одномерное отображение во времени), B-сканирования (двухмерное изображение) и C-сканирования (трехмерное изображение). Для проверки планшетов E. coli было разработано специальное программное обеспечение для интеграции карты сбора данных, карты цифрового ввода-вывода, контроллера движения и камеры для автоматического обнаружения и позиционирования преобразователя над E.coli колоний.

Визуализацию животных проводили путем инъекции 10 мкл 10 ⁷ –10 ⁸ клеток / мл клеток E. coli , продуцирующих CP или их варианты, в заднюю конечность крысы, умерщвленной непосредственно перед визуализацией, или путем инъекции 10 мкл 10 ⁷ –10 ⁸ клеток / мл CP-продуцирующих клеток E. coli в ухо живых крыс. Крысу анестезировали изофлуораном. Визуализация PA началась в течение 30 минут после инъекции. Все эксперименты на животных проводились в соответствии с протоколами, установленными Комитетом по уходу и использованию животных Университета Альберты.

Обработка сигналов и изображений

Обнаруженные PA-сигналы сначала обрабатывались с использованием алгоритма обнаружения огибающей преобразования Гильберта. SNR рассчитывалось с использованием среднего максимального значения огибающего сигнала PA, деленного на стандартное отклонение шума. Для отображения изображений C-сканов использовались максимальные значения каждого огибающего сигнала и интерполировались с использованием линейной интерполяции. Для разделения различных оптически поглощающих молекул, таких как кровь и ультрамарин или cjBlue, был реализован алгоритм расслоения с использованием ограниченного неотрицательного алгоритма регрессии наименьших квадратов.Вся постобработка была сделана в MATLAB.

Конструирование протеазного биосенсора для

Для создания гибридных tdUltramarine2 с EGFP, mPapaya1 и mRuby2 для тестирования протеазной активности гены флуоресцентных доноров амплифицировали с 5′-прямым праймером XhoI и 3′-линкером KpnI. 1 обратный праймер в трех отдельных реакциях ПЦР. Этот линкер 1 представлял собой пептид из 10 остатков GSG DEVD GGT, где DEVD представляет собой последовательность субстрата для каспазы-3.С-конец N-концевого FP заканчивается остатком лизина, который служил сайтом узнавания субстрата для трипсина. Между тем, dUltramarine2 в pBAD / His B амплифицировали в двух отдельных реакциях ПЦР. В первой реакции были введены сайты рестрикции 5 ‘KpnI и 3’ PstI. Во второй реакции вводили 5 ‘PstI с линкером 2 и 3’ HindIII, где линкер 2 представлял собой SCSGTGSTGSGSS с 13 остатками, включая сайт рестрикции PstI, см. 2.4.5 (конструкция tdUltramarine2). Стратегия четырехстороннего лигирования предоставила форму A-линкер 1-B-линкер 2-B в сайтах XhoI / HindIII spBAD / His.spBAD / His B эквивалентен плазмиде pBAD / His B с мутацией A2056C в происхождении pBR322. Было обнаружено, что эта неожиданная мутация увеличивает репликацию плазмиды по крайней мере в 2 раза.

Чтобы сконструировать FP (, т.е. , EGFP, mPapaya1 и mRuby2) плюс конструкции Ultramarine FRET, ген, кодирующий Ultramarine, амплифицировали с 5′-прямым праймером KpnI и 3′-обратным праймером HindIII. Трехстороннее лигирование (A-линкер 1-B) было выполнено в сайтах XhoI / HindIII spBAD / His B. Для достижения полного расщепления трипсином FRET (mPapaya 1-CP и EGFP-CP) мы заменили аминогруппу DE. кислоты в линкере 1 с KK.

Конструирование биосенсора каспазы-3 для визуализации живых клеток

Для экспрессии конструкции FRET в клетках млекопитающих использовали модифицированный вектор pcDNA3.1 (+), разработанный доктором Иданом Дингом ⁴⁴ . После модификации вектор имеет сайты рестрикции XhoI и HindIII в той же рамке считывания, что и тот же сайт в векторе pBAD / His B. Все конструкции FRET, содержащие субстрат DEVD расщепления каспазой-3, обрабатывали XhoI и HindIII и лигировали аналогичным образом обработанной модифицированной pcDNA3.1 (+) вектор.

Общие методы визуализации живых клеток

Все плазмиды экспрессии клеток млекопитающих очищали с использованием набора Plasmid Miniprep (Qiagen). Клетки Hela (линия CCL2; АТСС) поддерживали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM) (Life Technologies) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) (Sigma), 2 мМ GlutaMax (Life Technologies) и пенициллин-стрептомицин при 37 °. C и 5% CO ₂ в соответствии со стандартными процедурами. Временную трансфекцию проводили с использованием Turbofect ^TM (Fermentas) в соответствии с инструкциями производителя.Обычно клетки в чашках для визуализации диаметром 35 мм трансфицировали 1 мкг плазмидной ДНК, смешанной с 2 ​​мкл реагента для трансфекции. Визуализацию проводили через 24–48 ч после трансфекции при комнатной температуре в HEPES-буферном солевом растворе Хэнка (HHBSS).

Визуализация апоптоза, индуцированного стауроспаурином

Для инициации апоптоза клетки обрабатывали 2 мкМ стауроспорином и инкубировали еще 60–90 минут перед визуализацией. Визуализацию проводили на микроскопе Axiovert 200 M (Zeiss), оснащенном ксеноновой лампой мощностью 75 Вт и линзой объектива 20x (NA = 0.75, воздух) и 14-битную охлаждаемую CCD-камеру CoolSnap HQ2 (Photometrics), управляемую программным обеспечением Micro-Manager с открытым исходным кодом. Для типичного эксперимента изображения записывались с интервалом в 1 минуту.

Interbase FRET в РНК: от А до Я | Исследование нуклеиновых кислот

Аннотация

Interbase FRET может предоставить очень подробную информацию о расстоянии, ориентации и динамике нуклеиновых кислот, дополняя существующие методы структуры и динамики. Здесь мы сообщаем о первой паре аналогов основания РНК FRET, состоящей из донора tC ^O и неэмиссионного акцептора tC _nitro .Акцепторный рибонуклеозид здесь синтезирован и впервые включен в РНК. Эта пара FRET точно сообщает среднюю структуру РНК A-формы, и ее полезность для исследования структурных изменений РНК демонстрируется путем мониторинга перехода от A- к Z-форме РНК. Наконец, измеренные данные FRET сравнивали с теоретическими паттернами FRET, полученными из двух ранее описанных структур Z-RNA PDB, чтобы пролить новый свет на эту неуловимую конформацию РНК.

ВВЕДЕНИЕ

Биологические роли различных РНК жизненно важны и разнообразны и включают кодирование, регуляцию и экспрессию генов, а также катализ.Это отражает важность вторичной и третичной структуры и динамики для их функции, что подчеркивает необходимость разработки инструментов, которые могут исследовать такие параметры (1). Фёрстеровский резонансный перенос энергии (FRET) — это процесс, в котором энергия передается без излучения между донорным и акцепторным хромофором. Эффективность этого процесса сильно зависит как от расстояния, так и от ориентации между хромофорами; следовательно, может быть получена информация о структуре и / или относительном положении различных меченных донорами и акцепторами биомолекул в физиологических условиях in vitro, или даже в живых клетках (2, 3).FRET особенно ценен для изучения больших и гибких структур, таких как РНК и комплексы РНК-белок, которые трудно поддаются традиционным методам высокого разрешения, таким как ЯМР и рентгеновская кристаллография (4). Этот метод также можно использовать для получения более подробной информации о структуре и динамике, например, путем объединения измерений FRET одиночных молекул с подробным анализом и моделированием (5).

На сегодняшний день внешние хромофоры с (предположительно) случайной ориентацией использовались в большинстве исследований FRET для определения совместной локализации и расстояний, что означает, что используется только зависимость от расстояния.Например, индуцированное ионами сворачивание изломов в РНК было исследовано с использованием мечения концов флуоресцеином и Cy3 (6). Одним из способов повышения уровня информации, получаемой от FRET в системах РНК, могло бы быть использование аналогов флуоресцентных оснований, которые прочно расположены внутри нуклеиновой кислоты и, следовательно, сообщают как о расстоянии, так и об относительной ориентации между донором и акцептором. Было показано, что это позволяет с высокой точностью исследовать структурные изменения в ДНК (7,8). До сих пор сообщалось об ограниченном количестве FBA для РНК, например.грамм. tC ^O (9), тиено [3,4- d ] пиримидины ( ^th A, ^th C, ^th G и ^th U) (10) и изотиазоло [4,3 — d ] пиримидинов ( ^tz A, ^tz C, ^tz G и ^tz U) (11), суррогат U, применяемый в исследованиях связывания малых молекул РНК (12), аналог пиримидина для Исследования G-квадруплекса (13) и нуклеозидов расширенной РНК (кРНК) (14). Однако межбазовый FRET был исследован только для ДНК с использованием либо неэмиссионного акцептора (FRET-пары tC ^O –tC _nitro (15), qAN1 – qA _nitro (8) и pA – qA _nitro ). (16)) или эмиссионного акцептора ( ^th dG – tC) (17).Использование эмиссионного акцептора теоретически может обеспечить простое колориметрическое считывание и простой и полезный внутренний контроль эффективности FRET при условии, что полосы эмиссии донора и акцептора существенно разделены. Однако большинство FBA с высокой эмиссией излучают в довольно узком диапазоне длин волн (400–500 нм), и результирующее перекрытие эмиссии может добавить дополнительный уровень сложности и неопределенности к анализу FRET. Напротив, неэмиссионный акцептор позволяет количественно оценить эффективность FRET просто как уменьшение флуоресценции (или времени жизни) донора по сравнению с флуоресценцией одного донора, что значительно упрощает анализ данных и повышает точность.

Здесь мы сообщаем о первых исследованиях межосновного FRET в РНК с использованием пары FRET tC ^O – tC _nitro (рис. 1). Неэмиссионная акцепторная молекула tC _nitro синтезирована и впервые охарактеризована для использования в контексте РНК. В сравнительном исследовании мы видим превосходное соответствие между наблюдаемыми и теоретически предсказанными значениями эффективности FRET для РНК А-формы без существенных признаков структурных нарушений по сравнению с дуплексом РНК естественной А-формы, что указывает на то, что эту пару FRET можно использовать для исследования структурные изменения внутри РНК с высокой точностью.Более того, общее использование межосновного FRET для исследования структурных изменений в РНК продемонстрировано здесь с использованием конформационного изменения от A- к Z-форме.

Рисунок 1.

Структура эмиссионного донора FRET tC ^O и неэмиссионного акцептора FRET tC _nitro .

Рисунок 1.

Структура эмиссионного донора FRET tC ^O и неэмиссионного акцептора FRET tC _nitro .

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Синтез и характеристика рибо-tC _нитро фосфорамидита представлены в дополнительных данных.Фосфорамидит рибо-tC ^O синтезирован согласно литературным данным (9). Твердофазный синтез олигорибонуклеотидов, модифицированных tC ^O / tC _нитро , и их характеристики описаны в дополнительных данных.

Все использованные образцы, если не указано иное, были приготовлены в 10 мМ натрий-фосфатном буфере, pH 7,4, с добавлением 100 мМ NaCl и 1 мМ EDTA. Все образцы были смешаны и обработаны в стерильной среде, свободной от РНКазы. Концентрацию олигонуклеотидов определяли путем измерения поглощения при 260 нм.Молярную поглощающую способность немодифицированных одиночных цепей олигонуклеотидов при 260 нм рассчитывали с использованием онлайн-анализатора олигонуклеотидов IDT (Integrated DNA Technologies; http://eu.idtdna.com/calc/analyzer). Молярная абсорбционная способность модифицированных цепей была рассчитана таким же образом с заменой модифицированного основания на цитозин и с поправкой на разницу молярной абсорбции между цитозином (ϵ = 7400 M ^-1 см ^-1 ) и tC ^O ( ϵ = 11000 M ⁻¹ см ⁻¹ ) или tC _nitro (ϵ = 9700 M ⁻¹ см ⁻¹ ) на длине волны 260 нм.

Гибридизация образцов РНК А-формы, используемых для УФ-плавления и кругового дихроизма, была достигнута путем смешивания каждой донорной цепи с равным количеством акцепторной цепи при 22 ° C с последующим быстрым нагреванием до 95 ° C и, через 10 мин, охлаждение до 5 ° C при 7,5 ° C h ^-1 . Концентрация донорных нитей при отжиге составляла 4 мкМ. Образцы РНК в форме A – Z, используемые для УФ-плавления и кругового дихроизма, были приготовлены аналогичным образом, за исключением того, что каждая донорная цепь была смешана с 30% избытком ее комплементарной цепи (для обеспечения полной гибридизации донорных цепей) и что концентрация доноров при отжиге составляла 5.08 мкМ.

Образцы для эталонного исследования A-РНК FRET были гибридизованы, как указано выше, с 30% избытком его комплементарной цепи (для обеспечения полной гибридизации донорных цепей) и концентрацией донорной цепи 2 мкМ во время отжига.

Гибридизация образцов для исследования FRET от A- до Z-РНК была достигнута путем смешивания каждой донорной цепи со 100% избытком ее комплементарной цепи при 22 ° C с последующим быстрым нагреванием до 75 ° C и, через 10 мин, охлаждением. до 55 ° C при 1,7 ° C h ^-1 с последующим охлаждением до 5 ° C при 60 ° C h ^-1 .Концентрация донорной нити во время отжига составляла 20 мкМ (была выбрана более высокая концентрация, чтобы способствовать гетеродуплексному отжигу по сравнению с самоотжигом в шпильки).

Все образцы, использованные для измерения РНК A-формы, были впоследствии разбавлены до 2 мкМ фосфатным буфером, тогда как образцы Z-формы были разбавлены фосфатным буфером и достаточным количеством NaClO ₄ · H ₂ O (Sigma-Aldrich) для получения результата. в желаемой концентрации NaClO ₄ (8 M, если не указано иное), принимая во внимание результирующее изменение плотности раствора (18), а также корректируя разницу в концентрации образца (определяемую по поглощению при 260 нм) .

Все образцы измеряли сразу после отжига или хранили при -20 ° C между измерениями.

РНК УФ-плавление и круговой дихроизм

РНК в УФ-диапазоне регистрировали на Cary 4000 (Varian Technologies) с программируемым блоком температуры, состоящим из нескольких ячеек, путем нагревания от 20 ° C до 90 ° C и последующего охлаждения до 20 ° C со скоростью 0,5 ° C мин. ^-1 . Поглощение при 260 нм регистрировали каждые 0,5 ° C в течение двух циклов. Концентрация дуплекса во всех измерениях составляла 2 мкМ.Температуры плавления рассчитывались как максимум первой производной кривых плавления в УФ-диапазоне после сглаживания с помощью FFT-фильтрации.

Спектры кругового дихроизма (КД) регистрировали на спектрометре КД Chirascan (Applied Photophysics), сканирование которого составляло от 200 до 600 нм, с использованием времени интегрирования 0,5 с и трех повторов. Концентрация дуплекса составляла 2 мкМ, и все спектры корректировались на фоновый вклад.

Измерения флуоресценции

Спектры стационарного излучения регистрировали на SPEX Fluorolog 3 (Jobin Yvon Horiba) с длиной волны возбуждения 377 нм.Концентрация дуплекса во всех образцах составляла 2 мкМ в стационарном режиме и при измерении срока службы. Эмиссия регистрировалась между 385 и 745 нм при скорости сканирования 600 нм мин ^-1 .

Квантовые выходы были измерены для дуплексов, в которых присутствует только tC ^O (т.е. нет tC _nitro ) с длиной волны возбуждения 356 нм, с использованием сульфата хинина (Φ _f = 54,6%) в 0,5 MH ₂ SO ₄ в качестве справки. Эмиссия регистрировалась в диапазоне от 360 до 690 нм при скорости сканирования 600 нм мин ^-1 .

$$ \ begin {уравнение *} \ langle \ tau \ rangle = \ frac {{\ mathop \ sum \ nolimits_i {\ alpha _i} {\ tau _i}} } {{\ mathop \ sum \ nolimits_i {\ alpha _i}}} \ end {формула *} $$

$$ \ begin {уравнение *} E = 1 — \ frac {{{I _ {{\ rm DA }}}}} {{{I _ {\ rm D}}}} \ end {уравнение *} $$

$$ \ begin {уравнение *} E = 1 — \ frac {{{\ tau _ {{\ rm DA}}}}} {{{\ tau _ {\ rm D}}}} \ end {формула *} $$

Рисунок 2.

( A ) Общие трехмерные структуры A- и Z-формы РНК. ( B ) Иллюстрация шести основных ступенчатых параметров, используемых при построении структур нуклеиновых кислот. Рисунок адаптирован из Lu et al. (20).

Рисунок 2.

( A ) Общие трехмерные структуры A- и Z-формы РНК. ( B ) Иллюстрация шести основных ступенчатых параметров, используемых при построении структур нуклеиновых кислот.Рисунок адаптирован из Lu et al. (20).

А-форма

Z-образная

Для обеспечения возможности сравнения между тремя ранее описанными Z-образными структурами (1T4X, 2GBX и 1QBJ), которые являются 6-мерными, и нашей структурой, которая представляет собой 14-мерную структуру, мы использовали метод, в котором мы расширяли 6меров ранее описанной PDB- файлы на 14меров с использованием усредненных параметров базового шага. PDB-файлы сначала были проанализированы с помощью Web 3DNA для получения параметров базового шага для каждой структуры (24). Каждый параметр был усреднен для создания усредненных параметров базового шага GC и CG для конкретной структуры.Используя эти параметры, для каждой структуры был создан новый файл базовых шагов, содержащий 14 вместо исходных 6 базовых пар. Наконец, используя эти базовые файлы, стандартные геометрии пар оснований Уотсона-Крика, квантовый выход tC ^O в Z-РНК (Φ _f = 21,3%) и спектральное перекрытие между эмиссией tC ^O . и абсорбция tC _нитро в Z-РНК ( J _DA = 1,4 × 10 ¹⁴ нм ⁴ M ^-1 см ^-1 ), теоретическая эффективность FRET при различных разделениях для каждой структуры рассчитывались с помощью FRETmatrix (19).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Синтез tC

Мы недавно сообщили о синтезе и включении в РНК tC ^O -рибонуклеозида и пришли к выводу, что рибо-tC ^O сохраняет дуплекс A-формы, поддерживает высокий квантовый выход независимо от контекста последовательности и, следовательно, является отличным FRET. кандидат в доноры для межосновного FRET в РНК (9). В данной работе мы сообщаем о синтезе неэмиссионного акцептора FRET tC _нитро -рибонуклеозида и его фосфорамидитного субстрата 5 (схема 1).2′-O-TBS-защищенный рибонуклеозид tC _nitro ( 4 , схема 1) был синтезирован в масштабе нескольких граммов по пятиэтапному протоколу. Силильная защитная группа соединения 1 , включая защиту 2′-OH TBS, необходимую для конечного строительного блока, была введена на первом этапе на основе ранее опубликованной методологии (25). Затем соединение 1 было подвергнуто кросс-сочетанию CS-катализатора с тиолом 2 , что позволило селективно образовывать связь CS при сохранении защитных групп и стереохимии нуклеозидного фрагмента с получением соединения 3 в Доходность 81%.Трициклическая ароматическая система tC _nitro была сконструирована с конденсацией с замыканием цикла, для которой PyBOP оказался уникально активным. В мягких условиях продукт внутримолекулярной конденсации был получен с высокой селективностью по межмолекулярной реакции. Затем с полученного полностью защищенного нитро рибонуклеозида tC _{снимали защиту с получением соединения 4 . Две стандартные стадии защиты (26,27) дали желаемый строительный блок из нитро} -фосфорамидита tC _{5 для включения олигорибонуклеотида.}

Схема 1.

Синтез tC _нитро фосфорамидита 5 . Реагенты и условия: ( A ) t -Bu ₂ Si (OTf) ₂ , DMF, 0 ° C, 1 ч; затем имидазол, 0 ° C, 30 мин; затем TBS-Cl, RT, 12 ч. ( B ) NH ₂ NH ₂ (водн.), EtOH, КТ, 18 ч. ( C ) CuI, Cs ₂ CO ₃ , ДМСО, 60 ° C, 24 ч. ( D ) PyBOP, DBU, MeCN, 0 ° C, 1 ч; затем КТ, 4 ч.( E ) Py · (HF) _x , CH ₂ Cl ₂ , 0 ° C -> RT, 6 ч. ( F ) DMTr-Cl, Py, 0 ° C, 30 мин; затем КТ, 4 ч. ( G ) CEP-Cl, DIPEA, THF, RT, 20 ч.

Схема 1.

Синтез tC _нитро фосфорамидита 5 . Реагенты и условия: ( A ) t -Bu ₂ Si (OTf) ₂ , DMF, 0 ° C, 1 ч; затем имидазол, 0 ° C, 30 мин; затем TBS-Cl, RT, 12 ч. ( B ) NH ₂ NH ₂ (водн.), EtOH, КТ, 18 ч. ( C ) CuI, Cs ₂ CO ₃ , ДМСО, 60 ° C, 24 ч. ( D ) PyBOP, DBU, MeCN, 0 ° C, 1 ч; затем КТ, 4 ч. ( E ) Py · (HF) _x , CH ₂ Cl ₂ , 0 ° C -> RT, 6 ч. ( F ) DMTr-Cl, Py, 0 ° C, 30 мин; затем КТ, 4 ч. ( G ) CEP-Cl, DIPEA, THF, RT, 20 ч.

Тест FRET А-формы РНК

Для изучения FRET в РНК с использованием tC ^O и tC _nitro , мы синтезировали три донорные последовательности, содержащие tC ^O , и четыре комплементарных акцепторных последовательности, содержащие tC _nitro (рис. 3A), а также их немодифицированные аналоги, названные D0 и A0 соответственно.Эти нити позволяют формировать дуплексы с 2–13 п.н., разделяющими донор и акцептор. Спектры КД дуплексов, модифицированных tC _nitro , очень похожи на спектры соответствующего немодифицированного дуплекса, что указывает на то, что tC _nitro не нарушает A-форму (дополнительный рисунок S1). Кроме того, свойства УФ-плавления дуплексов, модифицированных нитро tC _{, указывают на то, что tC nitro , как и tC ^O , оказывает немного стабилизирующее действие на РНК A-формы, причем степень стабилизации зависит от ближайших соседей (1 .4–1,7 ° C для 5′-C tC nitro U-3 ‘; 3,9–4,2 ° C для 5’-U tC nitro C-3 ‘; Дополнительная таблица S1) (9).}

Рисунок 3. Последовательности

( A ) РНК, используемые для исследования характеристик межосновного FRET в А-форме РНК. ( B ) Последовательности РНК, используемые для исследования перехода от A- к Z-форме РНК. Обозначения последовательностей DX и AY отражают положения донора, tC ^O (синий), и неэмиссионного акцептора, tC _nitro (оранжевый), в последовательности, считая от ( A ) 5′- конец или ( B ) 5′-конец GC-повтора донорсодержащей последовательности.Каждая комбинация последовательностей содержала только один донор и максимум один акцептор. Абазовые сайты обозначены нижним подчеркиванием. Полный список всех дуплексов, используемых в этом исследовании, см. В дополнительных таблицах S1 и S7.

Рисунок 3. Последовательности

( A ) РНК, используемые для исследования характеристик межосновного FRET в А-форме РНК. ( B ) Последовательности РНК, используемые для исследования перехода от A- к Z-форме РНК. Обозначения последовательностей DX и AY отражают положения донора, tC ^O (синий), и неэмиссионного акцептора, tC _nitro (оранжевый), в последовательности, считая от ( A ) 5′- конец или ( B ) 5′-конец GC-повтора донорсодержащей последовательности.Каждая комбинация последовательностей содержала только один донор и максимум один акцептор. Абазовые сайты обозначены нижним подчеркиванием. Полный список всех дуплексов, используемых в этом исследовании, см. В дополнительных таблицах S1 и S7.

Флуоресцентные свойства tC ^O и tC _nitro в A-форме РНК суммированы в таблице 1. Важно отметить, что tC ^O сохраняет высокий и стабильный квантовый выход флуоресценции независимо от контекста последовательности (9), и там представляет собой отличное перекрытие между длинноволновой полосой излучения tC ^O и полосой поглощения tC _nitro (рис. 4).Предполагая свободное вращение дипольных моментов перехода (κ ² = 2/3), теоретическое расстояние Ферстера для tC ^O –tC _нитро FRET-пары в РНК составляет 28 Å, что соответствует почти одному полному обороту спираль А-формы РНК.

Абсорбционные и флуоресцентные свойства tC ^O и tC _nitro внутри двухцепочечной А-формы РНК

Рис. 4.

Спектральное перекрытие между испусканием tC ^O и поглощением tC _nitro в А-форме РНК. Спектры нормированы на их длинноволновые максимумы. Измерения проводили при комнатной температуре в фосфатном буфере, pH 7,4, 123 мМ Na ⁺ .

Рис. 4.

Спектральное перекрытие между испусканием tC ^O и поглощением tC _nitro в А-форме РНК. Спектры нормированы на их длинноволновые максимумы. Измерения проводили при комнатной температуре в фосфатном буфере, pH 7,4, 123 мМ Na ⁺ .

Для исследования применимости межосновного FRET с использованием tC ^O и tC _nitro в системах РНК, измеренная эффективность FRET сравнивалась с теоретическим значением для РНК A-формы, которое было рассчитано на основе установленной структуры РНК и свойств зонда.Для сравнения также были рассчитаны теоретические значения, основанные на B-форме РНК. В этом исследовании эффективность FRET как функция расстояния донор-акцептор была измерена с использованием измерений как стационарного излучения, так и времени жизни флуоресценции tC ^O в дуплексах с tC _nitro и без него (дополнительные таблицы S2 и S3; дополнительный рисунок S2). На рисунке 5 показана средняя эффективность переноса этих двух методов вместе с теоретической эффективностью FRET для tC ^O –tC _nitro внутри статической A-формы и B-формы нуклеиновой кислоты.Пунктирные кривые, показывающие эффективность переноса также при неестественном нецелочисленном разделении, добавлены к рисунку для направления взгляда. Локальные минимумы этих кривых происходят от разделений, где диполи перехода донора и акцептора будут перпендикулярны друг другу и, следовательно, составляют геометрию, в которой передача энергии не может происходить в этом статическом теоретическом представлении структуры нуклеиновой кислоты.

Рис. 5.

Эффективность FRET между tC ^O и tC _nitro в А-форме РНК как функция разделения пар оснований.Голубые ромбы обозначают усредненные данные измерений в установившемся режиме и в течение всего срока службы. Черные ромбы обозначают прогнозируемую эффективность FRET для tC ^O –tC _nitro внутри РНК А-формы, а пунктирная кривая показывает прогнозируемую эффективность FRET при нецелочисленных разделениях. Серые ромбы обозначают прогнозируемую эффективность FRET для tC ^O –tC _nitro внутри нуклеиновой кислоты B-формы, а пунктирная кривая показывает прогнозируемую эффективность FRET при нецелочисленных разделениях. Измерения проводили при комнатной температуре в фосфатном буфере, pH 7.4, 123 мМ Na ⁺ .

Рис. 5.

Эффективность FRET между tC ^O и tC _nitro в А-форме РНК как функция разделения пар оснований. Голубые ромбы обозначают усредненные данные измерений в установившемся режиме и в течение всего срока службы. Черные ромбы обозначают прогнозируемую эффективность FRET для tC ^O –tC _nitro внутри РНК А-формы, а пунктирная кривая показывает прогнозируемую эффективность FRET при нецелочисленных разделениях. Серые ромбы обозначают прогнозируемую эффективность FRET для tC ^O –tC _nitro внутри нуклеиновой кислоты B-формы, а пунктирная кривая показывает прогнозируемую эффективность FRET при нецелочисленных разделениях.Измерения проводили при комнатной температуре в фосфатном буфере, pH 7,4, 123 мМ Na ⁺ .

Измеренные данные точно соответствуют предсказанному паттерну FRET А-формы, показывая, что аналоги оснований прочно укладываются внутри РНК, и убедительно предполагая, что они не вызывают значительного возмущения структуры РНК. Таким образом, это эталонное исследование показывает, что пара tC ^O – tC _nitro FRET отлично подходит для измерения межосновного FRET в РНК, особенно при разделении 4–12 п.н. Ранее мы показали, как связывание нетропсина с ДНК и переход от B к Z в ДНК можно изучать с помощью межосновного FRET (7,8).Поскольку фотофизические свойства tC ^O и tC _nitro хорошо известны (см. Таблицу 1 выше), аналогичные исследования внутри РНК теперь должны быть возможны, что делает межосновный FRET с использованием tC ^O –tC _nitro мощным дополнением к существующие методы изучения структуры РНК, конформационных изменений и динамики.

От A до Z-формы FRET

Чтобы проиллюстрировать потенциал этого метода, мы разработали исследование, в котором tC ^O –tC _нитро межосновной FRET применяли для исследования конформационных изменений в РНК, в данном случае перехода от A- к Z-РНК.Структура правой B-формы ДНК и A-формы РНК хорошо охарактеризована. Однако и ДНК, и РНК также могут принимать левую структуру, называемую Z-формой. Z-форма ДНК была кристаллизована и охарактеризована с помощью рентгеновской кристаллографии впервые в 1979 году (28), тогда как первая левая структура РНК была описана в 1984 году (29). Как и в случае с Z-формой ДНК, переход от A- к Z-форме РНК происходит предпочтительно в чередующихся GC-повторах, но для индукции трансформации необходимы более экстремальные солевые условия.Биологическая роль Z-формы РНК до сих пор неясна, но окрашивание антителами Z-РНК указывает на ее присутствие в цитоплазме и ядрышке (30), а некоторые белки интерферонового ответа имеют домены, которые могут стабилизировать Z-форму РНК (31). Однако не хватает инструментов, которые могли бы контролировать структурные изменения Z-РНК в системах живых клеток, а структурные исследования Z-РНК немногочисленны; только две 6-мерные структуры были представлены в базе данных PDB: исследование ЯМР, в котором Z-форма индуцируется высокой концентрацией соли (6 M NaClO ₄ , PDB ID: 1T4X), и кристаллографическое исследование Z-формы РНК вместе с фермент ADAR1 (PDB ID: 2GXB) (31,32).

Чтобы сравнить структуры, депонированные в PDB, и структуры, использованные в этом исследовании, мы применили теорию FRET для прогнозирования паттернов FRET, ожидаемых от tC ^O –tC _nitro при вставке в разные положения в два олигорибонуклеотида, каждый из которых имеет структура, соответствующая одной из упомянутых выше записей PDB (рисунок 6A). Поскольку некоторые исследования указывают на сильное сходство между Z-формой ДНК и РНК, теоретический паттерн FRET, полученный с использованием структуры Z-формы ДНК, связанной с ADAR1 (PDB ID: 1QBJ), был включен в качестве дополнительного сравнения (31,33).Как видно на рисунке 6A, теоретический паттерн FRET для трех указанных структур демонстрирует общее сходство, но также и значительные различия из-за структурных различий между ними. Поскольку Z-форма в основном встречается в GC-повторах, наши аналоги цитозина предоставляют прекрасную возможность изучить конформационные изменения от A- к Z-форме РНК. Наша цель в этом исследовании РНК из A- в Z-форму была двоякой: во-первых, установить, можно ли использовать FRET между основаниями для исследования перехода РНК из A- в Z.Это конформационное изменение обычно контролируется с помощью CD, для чего требуются приборы, которые реже используются в научно-исследовательских лабораториях, значительно большее количество образцов, чем при измерениях флуоресценции, и несовместимо с измерениями в целлюлозе . Во-вторых, чтобы получить новую структурную информацию о Z-РНК и поместить ее в контекст ранее определенных структур Z-РНК.

Рисунок 6.

( A ) Измеренная эффективность FRET между tC ^O и tC _nitro для GC-повтора в Z-форме (зеленые кружки) вместе с прогнозируемыми значениями FRET ранее описанных структур Z-формы. : Записи PDB 1T4X (синие треугольники, структура ЯМР Z-формы РНК в 6 M NaClO ₄ ), 2GXB (оранжевые ромбы, кристаллическая структура Z-формы РНК, связанная с ADAR1) и 1QBJ (красные квадраты, кристаллическая структура Z -форма ДНК, связанная с ADAR1) (31–33).( B ) Измерена эффективность FRET между tC ^O и tC _nitro для GC-повтора в A-форме (черные квадраты) и Z-форме (зеленые кружки). Стрелки указывают направление изменения при переходе с A- на Z-форму. Измерения проводили при комнатной температуре в фосфатном буфере, pH 7,4, 123 мМ Na ⁺ (A-форма) или с добавлением 8 M NaClO ₄ (Z-форма) и представляют собой усредненные данные из измерений в установившемся состоянии и в течение срока службы.

Рисунок 6.

( A ) Измеренная эффективность FRET между tC ^O и tC _nitro для GC-повтора в Z-форме (зеленые кружки) вместе с прогнозируемыми значениями FRET ранее сообщенной Z-формы структуры: записи PDB 1T4X (синие треугольники, структура ЯМР Z-формы РНК в 6 M NaClO ₄ ), 2GXB (оранжевые ромбы, кристаллическая структура Z-формы РНК, связанная с ADAR1) и 1QBJ (красные квадраты, кристаллическая структура Z-форма ДНК, связанная с ADAR1) (31–33).( B ) Измерена эффективность FRET между tC ^O и tC _nitro для GC-повтора в A-форме (черные квадраты) и Z-форме (зеленые кружки). Стрелки указывают направление изменения при переходе с A- на Z-форму. Измерения проводили при комнатной температуре в фосфатном буфере, pH 7,4, 123 мМ Na ⁺ (A-форма) или с добавлением 8 M NaClO ₄ (Z-форма) и представляют собой усредненные данные из измерений в установившемся состоянии и в течение срока службы.

Последовательности с GC-повторами очень склонны к самодимеризации и образованию шпилек, и поэтому требуют другого и более тщательного дизайна последовательности по сравнению с нашим первоначальным эталонным исследованием (рис. 3A).Чтобы уменьшить помехи от образования шпильки, GC-повтор был как можно короче (14-мерный), при этом позволяя исследовать полный виток спирали, то есть донорно-акцепторное разделение до 10 п.н., без истирания концов. Кроме того, GC-повтор фланкирован одним базовым сайтом и восемью основаниями с каждой стороны. Восемь фланкирующих оснований были введены, чтобы удерживать концы вместе в А-форме на протяжении всего эксперимента и для повышения стабильности согласованного дуплекса в рамке считывания, в то время как базовые сайты служат в качестве гибкого линкера, позволяющего формировать GC-повтор. Z-РНК, пока концы остаются в А-форме.

Для этого исследования использовали 8 М NaClO ₄ для индукции Z-формы. Исследования CD показывают, что Z-форма стабильна при комнатной температуре в течение> 18 часов в этих условиях и что донор и акцептор не препятствуют ее образованию (дополнительный рисунок S3), что является дополнительным признаком того, что модифицированные основания РНК служат хорошими аналогами их естественные аналоги цитозина. Чтобы исследовать разницу между FRET в A- и Z-форме РНК, измерения с использованием времени жизни как стационарной эмиссии, так и флуоресценции были выполнены для обеих конформаций (Рисунок 6B, дополнительный рисунок S4 и дополнительные таблицы S5 и S6).Поскольку донор и акцептор в последовательностях GC находятся в одной цепи для нечетных разделений и в противоположных цепях для четных разделений, FRET-паттерн GC-повтора в A-форме отличается от эталонного исследования, в котором донор и акцептор являются в противоположных прядях для всех разделений (дополнительный рисунок S5). В данных Z-формы имеется несоответствие между эффективностями FRET в установившемся режиме и на основе срока службы для седьмого и девятого разделения (дополнительная таблица S7). Эти два разделения были измерены с использованием последовательностей, меченных одной и той же цепью, где образование шпильки может сблизить донор и акцептор в пространстве (0–2 п.н.).На таких коротких расстояниях тушение доноров может иметь непосредственный контакт (например, перенос электронов по Декстеру) и, следовательно, происходить во временном масштабе, который невозможно разрешить с помощью нашей настройки времени жизни флуоресценции. При таких обстоятельствах только время жизни правильно свернутой фракции образца, то есть дуплексов Z-формы РНК, будет видно в затухании флуоресценции, в то время как стационарная эмиссия будет дополнительно подавляться и, следовательно, приведет к кажущемуся более высокому FRET. значение. Поскольку наши результаты показывают разницу между установившимся режимом FRET и FRET на протяжении жизни на седьмом и девятом разделении и, следовательно, указывают на частичное образование «темных частиц» (например,грамм. шпильки) в этих образцах, для этих точек данных в последующей оценке использовались только значения эффективности FRET на основе срока службы (рисунок 6).

Во-первых, мы исследовали, можно ли использовать FRET между основаниями РНК для исследования перехода РНК из A- в Z. Разница в паттерне FRET между A- и Z-формами РНК поразительна, с изменением эффективности переноса на 25-87% для семи из восьми исследованных разделений (рис. 6B), что указывает на то, что система достаточно чувствительна для изучения изменений между РНК в A- и Z-форме путем отслеживания изменения FRET только при одном или нескольких разделениях.Квантовый выход tC ^O по существу одинаков в обеих конформациях (дополнительная таблица S8), что убедительно свидетельствует о том, что наблюдаемые изменения эффективности переноса обусловлены структурными изменениями в РНК, а не вариациями в микроокружении зонда. Взятые вместе, это показывает, что межосновная РНК FRET между tC ^O и tC _nitro , разделенными 4–10 п.н., может с высокой чувствительностью исследовать структурные изменения A- в Z-РНК, что дополнительно иллюстрирует общую адаптивность этого метода для исследование структурных изменений нуклеиновых кислот.Существенные различия в продолжительности жизни флуоресценции между соответствующими дуплексами РНК A- и Z-формы указывают на возможные применения микроскопии для визуализации времени жизни флуоресценции (FLIM), в которой РНК, конкретно в Z-форме, может контролироваться с помощью микроскопии живых клеток.

Во-вторых, мы сравнили наши данные FRET с теоретически полученным паттерном FRET из нескольких существующих структур PDB. Паттерн FRET, который мы получили для Z-формы РНК, хорошо согласуется с паттернами ранее описанных структур на коротких и длинных расстояниях (рис. 6А).Однако на промежуточных расстояниях (6–8 п.н.) наблюдаемая эффективность FRET значительно ниже, чем значения, рассчитанные на основе опубликованных средних параметров 6-мерных структур PDB. Одним из объяснений этих расхождений может быть то, что структура Z-РНК отличается для ранее описанной короткой и по своей природе менее стабильной 6-мерной РНК по сравнению с нашей 14-мерной системой, где концы удерживаются на месте фланкирующими основаниями РНК А-формы. Структуры 6-мерной Z-РНК, определенные с помощью методов ЯМР или рентгеновского излучения, также могут немного отличаться от структуры в растворе при более физиологически значимых концентрациях РНК.Учитывая очень мало отчетов, содержащих структурную информацию для Z-формы РНК, слишком рано давать подробные комментарии о структурной однородности этой дуплексной формы РНК. Это потребует большего количества сравнительных исследований, посвященных таким аспектам, как длина олигорибонуклеотида и тип связывающего белка.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Мы показали, что пара tC ^O – tC _nitro FRET хорошо подходит для мониторинга межосновного FRET в дуплексах РНК.Зонды прочно расположены внутри РНК, и паттерн FRET точно соответствует предсказанным значениям для A-РНК. Мы наблюдаем большое изменение эффективности FRET, поскольку Z-РНК образуется из A-формы с использованием высокой концентрации NaClO ₄ , что показывает, что, как и в ДНК, межосновное FRET РНК может использоваться для исследования структурных изменений в физиологических условиях. с высокой чувствительностью, а также универсальностью в отношении шага tC ^O –tC _nitro . При сравнении нашего измеренного паттерна FRET с несколькими существующими структурами PDB Z-формы РНК, мы обнаруживаем общие сходства, но также и существенные различия.Сходные по величине различия также могут быть обнаружены между структурами PDB, подразумевая, что необходимо исследовать больше структур Z-РНК, чтобы определить, имеет ли РНК Z-формы одну однородную структуру с уникальным набором параметров для извлечения. Учитывая более высокое структурное разнообразие и динамику РНК и комплексов РНК-белок по сравнению с ДНК, это представляет собой значительный шаг вперед не только для межосновного FRET как общей методологии нуклеиновых кислот, но, что важно, для быстрорастущей области структуры и динамики РНК. исследования в частности и исследования РНК в целом.В отличие от большинства методов исследования структуры и динамики, межбазовый FRET может выполняться в физиологических условиях. Следовательно, мы предполагаем, что основная полезность этого метода заключается в мониторинге структурных изменений РНК в системах живых клеток, либо отдельно, либо в гибридных подходах вместе с рентгеновскими лучами или ЯМР, для выявления ценной новой информации об основных молекулах жизни, РНК. .

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ ДАННЫЕ

Дополнительные данные доступны в NAR Online.

БЛАГОДАРНОСТИ

Мы благодарим Афаф Х. Эль-Сагира и профессора Тома Брауна (Оксфордский университет, Великобритания) за обучение A.F.F. и М. в очистке РНК.

ФИНАНСИРОВАНИЕ

Шведский фонд стратегических исследований [SSF, IS14-0041, IRC15-0065 до L.M.W., ID14-0036 до M.G.]; Шведский исследовательский совет [VR, 2017-03707 к L.M.W.]. Финансирование платы за открытый доступ: Шведский исследовательский совет [VR, 2017-03707].

Заявление о конфликте интересов .Ничего не объявлено.

ССЫЛКИ

Dethoff

E.A.

Chugh

J.

Mustoe

A.M.

Аль-Хашими

Х.М.

Функциональная сложность и регуляция через динамику РНК

Природа

2012

482

322

330

Harpur

A.G.

Wouters

F.S.

Bastiaens

P.I.H.

Визуализация FRET между спектрально подобными молекулами GFP в отдельных ячейках

Nat. Biotechnol.

2001

19

167

169

Hillger

F.

Hanni

D.

Nettels

D.

Geister

S.

Grandin

M.

Textor

M. Шулер

Б.

Исследование взаимодействий белок-шаперон с помощью флуоресцентной спектроскопии одиночных молекул

Angew. Chem. Int. Эд.

2008

47

6184

6188

Губаев

A.

Klostermeier

D.

Klostermeier

D.

Hammann

C.

Структура и складывание РНК: биофизические методы и прогнозирование.

2013

Берлин

Де Грюйтер

181

214

Peulen

T.O.

Опанасюк

O.

Seidel

C.A.M.

Сочетание графических и аналитических методов с молекулярным моделированием для точного анализа измерений FRET меченых макромолекул с временным разрешением

J. Phys. Chem. В

2017

121

8211

8241

McPhee

S.A.

Huang

L.

Lilley

D.M.

Критическая пара оснований в k витках, которая придает характеристики сворачивания и коррелирует с биологической функцией

Nat. Commun.

2014

5

5127

Dumat

B.

Larsen

A.F.

Wilhelmsson

L.M.

Изучение переходов Z-ДНК и B- в Z-ДНК с использованием аналога цитозина FRET-пары

Nucleic Acids Res.

2016

44

e101

Wranne

M.S.

Füchtbauer

AF

Dumat

B.

Bood

M.

El-Sagheer

AH

Brown

T.

H.

Grøtli

M.

Wilhelmsson

LM

На пути к полной гибкости последовательности аналога основания нуклеиновой кислоты FRET

J. Am. Chem. Soc.

2017

139

9271

9280

Füchtbauer

A.F.

Preus

S.

Börjesson

K.

McPhee

S.A.

Lilley

D.M.

Wilhelmsson

L.M.

Флуоресцентный аналог цитозина РНК — внутренний зонд для детальных исследований структуры и динамики

Sci. Отчет

2017

7

2393

Shin

D.

Sinkeldam

R.W.

Tor

Y.

Эмиссионный алфавит РНК

J. Am. Chem. Soc.

2011

133

14912

14915

Ровира

А.Р.

Fin

A.

Tor

Y.

Химический мутагенез алфавита эмиссионной РНК

J. Am. Chem. Soc.

2015

137

14602

14605

Xie

Y.

Dix

A.V.

Tor

Y.

FRET позволяет в реальном времени обнаруживать связывание малых молекул РНК

J. Am. Chem. Soc.

2009

131

17605

17614

Tanpure

A.A.

Srivatsan

S.G.

Конформационно-чувствительные аналоги нуклеозидов в качестве зондов включения флуоресценции, специфичных для топологии, для G-квадруплексов ДНК и РНК

Nucleic Acids Res.

2015

43

e149

Эрнандес

A.R.

Kool

E.T.

Компоненты xRNA: Синтез и флуоресценция полного генетического набора расширенных по размеру рибонуклеозидов

Org. Lett.

2011

13

676

679

Börjesson

K.

Preus

S.

El-Sagheer

A.H.

Brown

T.

Albinsson

B.

Wilhelmsson

L.M.

Аналог основания нуклеиновой кислоты FRET-Pair, облегчающий подробные структурные измерения в системах, содержащих нуклеиновые кислоты

J. Am. Chem. Soc.

2009

131

4288

4293

Bood

M.

Füchtbauer

A.F.

Wranne

M.S.

Ro

J.J.

Sarangamath

S.

El-Sagheer

A.H.

Rupért

D.L.M.

Fisher

R.S.

Magennis

S.W.

Джонс

A.C.

Пентациклический аденин: универсальный и исключительно яркий флуоресцентный аналог основания ДНК

Chem. Sci.

2018

9

3494

3502

Хан

J.H.

Yamamoto

S.

Park

S.

Sugiyama

H.

Разработка системы Vivid FRET на основе высокоэмиссионной аналоговой пары dG-dC

Chem. Евро. J.

2017

23

7607

7613

Миллер

M.L.

Doran

M.

Концентрированные солевые растворы.II. Вязкость и плотность тиоцианата натрия, перхлората натрия и йодида натрия

J. Phys. Chem.

1956

60

186

189

Preus

S.

Kilså

K.

Miannay

FA

Albinsson

B.

Wilhelmsson

LM

для моделирования и общего метода анализа FR FRET в нуклеиновых кислотах

Nucleic Acids Res.

2013

41

e18

Лю

X.J.

Олсон

W.K.

3DNA: программный пакет для анализа, восстановления и визуализации трехмерных структур нуклеиновых кислот

Nucleic Acids Res.

2003

31

5108

5121

Олсон

W.K.

Бансал

М.

Берли

S.K.

Дикерсон

R.E.

Gerstein

M.

Harvey

S.C.

Heinemann

U.

Lu

X.J.

Neidle

S.

Shakked

Z.

Стандартная система координат для описания геометрии пары оснований нуклеиновых кислот

J. Mol. Биол.

2001

313

229

237

Sandin

P.

Börjesson

K.

Li

H.

Mårtensson

J.

Brown

T.

Albinsson

B.

Характеристика и использование беспрецедентно яркого и структурно не нарушающего флуоресцентного аналога основания ДНК

Nucleic Acids Res.

2008

36

157

167

Preus

S.

Börjesson

K.

Kilså

K.

Albinsson

B.

Wilhelmsson 9 acceptor

FR LM

J. Phys. Chem. Б.

2010

114

1050

1056

Чжэн

Г.Х.

Лю

X.J.

Olson

W.K.

Web 3DNA — веб-сервер для анализа, реконструкции и визуализации трехмерных структур нуклеиновых кислот

Nucleic Acids Res.

2009

37

W240

W246

Серебряный

В.

Бейгельман

Л.

Эффективный препарат защищенных рибонуклеозидов для синтеза фосфорамидитной РНК

Tetrahedron Lett.

2002

43

1983

1985

Sinha

ND

Biernat

J.

McManus

J.

Köster

H.

Полимерная подложка, олигонуклеотидный синтез 9 -000C7000 β-N0008, , бета-N0008 , N -Диалкиламино- / N -Морфолинофосфорамидит дезоксинуклеозидов для синтеза фрагментов ДНК, упрощающих снятие защиты и выделение конечного продукта

Nucleic Acids Res.

1984

12

4539

4557

Xu

Y.

Ishizuka

T.

Kimura

T.

Komiyama

M.

U-Tetrad стабилизирует структуру теломерной РНК человека

J. Am. Chem. Soc.

2010

132

7231

7233

Ван

А.H.J.

Quigley

G.J.

Kolpak

F.J.

Crawford

J.L.

Vanboom

J.H.

Vandermarel

G.

Rich

A.

Молекулярная структура левостороннего двухспирального фрагмента ДНК при атомном разрешении

Природа

1979

282

680

686

Холл

К.

Cruz

P.

Tinoco

I.

Jovin

T.M.

Vandesande

J.H.

Z-РНК — двойная спираль левой РНК

Природа

1984

311

584

586

Зарлинг

Д.А.

Calhoun

C.J.

Feuerstein

B.G.

Сена

E.P.

Цитоплазматическая микроинъекция иммуноглобулина Gs, распознающего спирали РНК, подавляет рост клеток человека

J. Mol. Биол.

1990

211

147

160

Placido

D.

Коричневый

B.A.

Lowenhaupt

K.

Rich

A.

Athanasiadis

A.

Левая двойная спираль РНК, связанная Z-альфа-доменом редактирующего РНК фермента ADAR1

Структура

2007

15

395

404

Popenda

M.

Milecki

J.

Adamiak

R.W.

Структура высокосолевого раствора двойной спирали левой РНК

Nucleic Acids Res.

2004

32

4044

4054

Schwartz

T.

Rould

M.A.

Lowenhaupt

K.

Herbert

A.

Rich

A.

Кристаллическая структура Z-альфа-домена редактирующего фермента человека ADAR1, связанного с левой Z-ДНК

Наука

1999

284

1841

1845

Заметки автора

© Автор (ы) 2019. Опубликовано Oxford University Press от имени Nucleic Acids Research.

Динамическая структурная биология на основе FRET: проблемы, перспективы и призыв к практикам открытой науки

Понимание того, как биомолекулы соединяют структурную динамику с функцией, лежит в основе нескольких дисциплин и остается выдающейся целью биологии. Связывание конформационных состояний и их переходов с биохимической функцией требует способности точно определять структуру и динамику биологической системы, которая часто изменяется при связывании лиганда или находится под влиянием химических и физических свойств окружающей среды.Наиболее хорошо зарекомендовавшие себя инструменты структурной биологии предоставили с высоким разрешением «снимки» состояний в кристаллизованной или замороженной форме (например, рентгеновская кристаллография и криоэлектронная микроскопия одиночных частиц, криоЭМ) или усредненное по ансамблю всех конформаций. (например, ядерный магнитный резонанс, ЯМР; малоугловое рассеяние рентгеновских лучей, SAXS; малоугловое рассеяние нейтронов, SANS; двойной электронно-электронный резонанс, DEER; сшивающая масс-спектрометрия, XL-MS; ансамбль-FRET). В последние годы дальнейшие разработки позволили этим традиционным структурным инструментам обнаруживать конформационную динамику и промежуточные продукты реакции.Например, методы ЯМР (Anthis and Clore, 2015; Clore and Iwahara, 2009; Palmer, 2004; Ravera et al., 2014; Sekhar and Kay, 2019) и методы электронного парамагнитного резонанса (Jeschke, 2018; Jeschke, 2012; Krstić et al., 2011) были продвинуты для изучения конформационной динамики и захвата временных промежуточных соединений. Кристаллографические исследования с временным разрешением использовались для определения функционально значимых структурных смещений, связанных с биологической функцией (Kupitz et al., 2014; Moffat, 2001; Schlichting et al., 1990; Шлихтинг и Чу, 2000; Schotte et al., 2003). Достижения в микрожидкостных устройствах для смешивания и распыления позволили использовать криоЭМ с временным разрешением (Feng et al., 2017; Kaledhonkar et al., 2018) и масс-спектрометрию с поперечными связями (XL-MS или CL-MS) (Braitbard et al., 2019 ; Brodie et al., 2019; Chen et al., 2020; Iacobucci et al., 2019; Murakami et al., 2013; Славин, Калисман, 2018). Прогресс в вычислительных методах также предоставил новые инструменты для изучения биомолекулярной структуры и динамики. Каждое из этих достижений подчеркивает возросшее понимание того, что необходимо напрямую и непрерывно отслеживать динамические свойства отдельных биомолекул, чтобы понять их функции и регуляцию.

В этом контексте FRET (называемый резонансным переносом энергии флуоресценции или резонансным переносом энергии Фёрстера [Braslavsky et al., 2008]) исследования на ансамблевом и одномолекулярном уровнях стали важными инструментами для измерения структурной динамики как минимум на протяжении 12 порядков величины во времени и картирование конформационных и функциональных неоднородностей биомолекул в условиях окружающей среды. FRET изучает затухание флуоресценции на уровне ансамбля (Grinvald et al., 1972; Haas et al., 1975; Хаас и Стейнберг, 1984; Hochstrasser et al., 1992) (FRET с временным разрешением) позволили уже в начале 1970-х годов изучать структурные неоднородности во временных масштабах, превышающих время жизни флуоресценции (несколько нс). Этот подход используется до сих пор (Becker, 2019; Orevi et al., 2014; Peulen et al., 2017) и перенесен в исследования одиночных молекул. Возможность измерения FRET в отдельных молекулах (Deniz et al., 1999; Ha et al., 1996; Lerner et al., 2018a) сделала этот метод еще более привлекательным.Одномолекулярный FRET (smFRET) широко используется для изучения конформационной динамики и биомолекулярных взаимодействий в стационарных условиях (Dupuis et al., 2014; Larsen et al., 2019; Lerner et al., 2018a; Lipman et al. ., 2003; Margittai et al., 2003; Mazal and Haran, 2019; Michalet et al., 2006; Orevi et al., 2014; Ray et al., 2019; Sasmal et al., 2016; Schuler et al., 2005; Schuler et al., 2002; Steiner et al., 2008; Zhuang et al., 2000). Примечательно, что во многих механистических исследованиях достаточно использовать FRET для различения различных конформаций и определения кинетических скоростей, так что абсолютные эффективности FRET и, следовательно, расстояния не нужно определять.Однако возможность точного измерения расстояний и кинетики с помощью smFRET привела к его появлению в качестве важного инструмента в эту новую эру «динамической структурной биологии » для картирования биомолекулярных неоднородностей и измерения структурной динамики в широком диапазоне временных масштабов (Lerner et al., 2018a; Mazal, Haran, 2019; Sanabria et al., 2020; Schuler, Hofmann, 2013; Weiss, 1999).

Одномолекулярные методы FRET (smFRET) имеют много преимуществ в качестве метода структурной биологии, в том числе:

• чувствительность к макромолекулярным расстояниям (2.5–10 нм),

• способность разрешать структурные и динамические неоднородности,

• высококачественных измерений с низким потреблением образцов интересующих молекул (низкие концентрации и низкие объемы), поскольку образец анализируется по одной молекуле за раз,

• определение структурных переходов в равновесии, следовательно, без необходимости синхронизации,

• возможность обнаружения (очень) редких событий.Действительно, в биологии наиболее интересными молекулами для изучения часто являются редкие, функционально активные молекулы среди моря неактивных молекул,

• высокая чувствительность и специфичность для меченых молекул. Поскольку только меченая молекула вносит уникальный вклад в детектируемый сигнал, эти индикаторы также могут применяться в качестве FRET-репортеров в тесноте (Dupuis et al., 2014; Soranno et al., 2014; Zosel et al., 2020b) (отсюда smFRET может использоваться для проверки результатов, полученных изолированно, или обнаружения модуляции конформационных предпочтений и / или структурной динамики посредством так называемых пяти взаимодействий [Guin and Gruebele, 2019]), и

• высокая специфичность в отношении остатков / доменов за счет специфического мечения.Биомолекулы могут быть специально помечены уникальной парой красителей, что позволяет проводить измерения smFRET для всех размеров молекул, включая большие сложные сборки (см. Рисунок 1 [Kilic et al., 2018]), активные биологические машины (например, рибосомы) ( Dunkle et al., 2011) и даже на целых нативных вирионах (Lu et al., 2019; Munro et al., 2014).

Рабочий процесс моделирования динамических структур по измерениям FRET.

( A ) Интеграционное моделирование требует структурной и динамической информации. Предварительная информация из традиционных подходов (рентген, ЯМР, криоЭМ) вместе с вычислительными инструментами определяет пространство возможных решений для структурного моделирования с помощью FRET. Комбинация структурной (расстояния между красителями) и динамической информации (кинетическая связь и обменные курсы) позволяет идентифицировать непротиворечивую модель. ( B ) Изучение структуры и динамики хроматиновых волокон.Комбинированное TIRF и конфокальное FRET исследование структуры и динамики хроматиновых волокон с использованием трех позиций маркировки FRET (DA1-3) для двух пар красителей с различными расстояниями Ферстера. Расстояния Фёрстера (определены в разделе Расстояния между красителями, уравнение 6). Предварительная структурная информация, полученная с помощью криоэлектронной микроскопии (вверху слева) (Song et al., 2014) и рентгеновской кристаллографии (вверху, справа PDB ID: 1ZBB Schalch et al., 2005), объединена со структурной и динамической информацией. полученные в результате экспериментов FRET на иммобилизованных молекулах, измеренных с помощью микроскопии полного внутреннего отражения (TIRF), и на свободно диффундирующих молекулах с помощью конфокальной микроскопии (Kilic et al., 2018). На основе объединенной информации получена согласованная модель конформаций хроматиновых волокон со смещенными регистрами, которые связаны медленными (> 100 мс) и быстрыми процессами декомпакции (150 мкс), которые протекают не напрямую, а скорее через открытое волокно. конформация. Рисунок 1B был воспроизведен с рисунков 1, 3 и 6 в Kilic et al., 2018, Nature Communications с разрешения, опубликованном под Международной общественной лицензией Creative Commons Attribution 4.0 (CC BY 4.0; https: // creativecommons.org / licenses / by / 4.0 /).

© 2018, Kilic et al. Панель B была воспроизведена с рисунков 1, 3 и 6 в Kilic et al., 2018 с разрешения, опубликованного в соответствии с Международной общественной лицензией Creative Commons Attribution 4.0.

Несколько методов были использованы для определения структурных ансамблей, таких как ЯМР, одночастичная криоЭМ или XL-MS, а недавно также smFRET в интегративном / гибридном (I / H) подходе с компьютерным моделированием для преодоления разреженности экспериментальных данных. относительно атомистического описания (Берман и др., 2019; де Соуза и Пикотти, 2020; Димура и др., 2020; Gauto et al., 2019; Кукос и Бонвин, 2020; На и Пэк, 2020; Тан и Гонг, 2020; Webb et al., 2018). Структурные модели I / H, полученные из экспериментов smFRET с использованием расстояний между красителями в качестве ограничений, были описаны для гибких свернутых белков (Brunger et al., 2011; Hellenkamp et al., 2017; Margittai et al., 2003; McCann et al., 2012). ), конформационные ансамбли неупорядоченных / неструктурированных и развернутых белков (Borgia et al., 2018; Holmstrom et al., 2018; Schuler et al., 2020), нуклеиновые кислоты и комплексы белок-нуклеиновая кислота (Craggs et al., 2019; Craggs, Kapanidis, 2012; Kalinin et al., 2012; Lerner et al., 2018b; Muschielok et al., 2008). ; Возняк и др., 2008).

Еще одним уникальным аспектом исследований smFRET является то, что структурная, кинетическая и спектроскопическая информация о больших и сложных системах может быть записана одновременно в одном измерении. Это облегчает объединение динамической и структурной информации в интегративный подход к (рис. 1A) (Hellenkamp et al., 2017; Килич и др., 2018; Ли и др., 2020b; Санабрия и др., 2020; Вассерман и др., 2016; Янез Ороско и др., 2018):

• определяют количество возможных структур, согласующихся с данными,

• потенциально снижает неоднозначность между различными структурными моделями, совместимыми с экспериментальными данными, а

• раскрывают структурно разрешенные динамические пути обмена.

В качестве примера на рисунке 1B показан результат мультимодального исследования smFRET конформационного ландшафта 12-мерного массива хроматина (~ 2.5 MDa) (Kilic et al., 2018) с динамикой, происходящей во временных масштабах от наносекунд до часов. SmFRET эксперименты могут обнаруживать гибкие конформации хроматина (рис. 1B, средняя панель), показывая их динамическую структурную неоднородность (рис. 1B, нижняя панель), в отличие от хорошо упорядоченных статических структур хроматиновых волокон (рис. 1B, верхняя панель). Эти гибкие, частично открытые и открытые конформации, которые довольно многочисленны в растворе (популяция> 70%; рис. 1B, нижняя панель), не были разрешены ранее, хотя они необходимы для правильной организации и функции гена.Они представляют собой центральный узел взаимопревращений для отдельных регистров стэкинга хроматина и их трудно обнаружить с помощью других структурных методов. Такой подход к визуализации биомолекул в действии в условиях окружающей среды подчеркивает важность их динамической природы путем разрешения переходов между различными конформационными состояниями, что во многих случаях способствует их функции (Aviram et al., 2018; Henzler-Wildman et al., 2007; Iljina et al., 2020; Lerner et al., 2018b; Sanabria et al., 2020; Tassis et al., 2020).

SmFRET обычно выполняются с использованием двух подходов: с использованием иммобилизованных на поверхности молекул с использованием флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения (TIRFM) и обнаружения на основе камеры или со свободно диффундирующими молекулами в растворе с использованием конфокальной микроскопии и точечных детекторов. Экспериментальные системы имеются в продаже, но обычно их изготавливают самостоятельно. Образцы готовятся, а данные собираются с использованием специальных лабораторных протоколов, где данные хранятся в различных форматах файлов и анализируются с использованием набора все более мощного программного обеспечения.Для полевых исследований в целом и для структурных исследований в частности важно продемонстрировать, что smFRET как метод является воспроизводимым и надежным независимо от того, где и как измеряется образец. С этой целью под руководством Торстена Хугеля двадцать лабораторий объединились для измерения smFRET на нескольких конструкциях дцДНК (Hellenkamp et al., 2018a). Изучая шесть различных образцов с разными красителями и различными расстояниями между красителями, средняя эффективность FRET, полученная участвующими лабораториями, показала удивительно высокую степень согласия (ΔE между 0.02 и 0,05 в зависимости от деталей образца). Количественная оценка и воспроизводимость измерений smFRET на основе интенсивности и обсуждение анализа данных стали важной вехой. Эти стандарты дцДНК FRET теперь доступны для ежедневной калибровки и особенно полезны для новых групп, присоединяющихся к сообществу.

Вдохновленный идеями, полученными в ходе вышеупомянутой попытки FRET (Hellenkamp et al., 2018a), были начаты новые многолабораторные слепые исследования.Следующее сравнительное исследование FRET, проведенное Thorben Cordes, исследует надежность и надежность экспериментов smFRET на белках, претерпевающих индуцированные лигандом конформационные изменения (Gebhardt et al., В стадии подготовки). В этом исследовании используются два различных модельных белка для оценки воспроизводимости и точности smFRET на основе белков для измерения расстояния между красителями. Белковые системы ставят новые задачи, включая статистическую маркировку красителей, специфические для сайта свойства красителей, стабильность белков, транспортировку, хранение и конформационную динамику.Следовательно, в исследовании также оценивается способность smFRET обнаруживать и количественно оценивать динамику в различных временных масштабах от микросекунд до секунд. Еще одна задача FRET, инициированная Соней Шмид, — это программа kinSoftChallenge (http://www.kinsoftchallenge.com, Götz et al., В стадии подготовки), которая оценивает существующие инструменты для извлечения кинетической информации из временных траекторий одиночных молекул. Эта задача направлена ​​на: (1) продемонстрировать способность кинетического анализа на основе smFRET точно выводить динамическую информацию и (2) предоставить сообществу средства оценки различных доступных программных инструментов.

Одним из важных результатов различных исследований FRET в нескольких лабораториях было то, что, хотя согласие было хорошим, его можно было улучшить еще больше. В частности, анализ данных и, в частности, исправления могут повлиять на определенную эффективность FRET и результирующие расстояния. Следовательно, открытое обсуждение того, какие подходы работают наиболее надежно, при каких условиях необходимо. Доступ к первичным данным и возможность их обработки с помощью различных подходов к анализу были и останутся наиболее прозрачным способом продвижения вперед в этой области.В настоящее время это сложно, учитывая множество вариантов используемых методов, их документации, форматов файлов и экспериментальных процедур, применяемых в разных лабораториях, для установления оптимальных условий, рабочего процесса и передовых практик даже для существующих, хорошо протестированных методов, поскольку сравнение этих методов затруднительно. требует много времени, а необходимая информация во многих случаях недоступна. С расширением открытых научных практик и представлением опубликованных данных в репозитории необходим консенсус относительно того, какие данные и метаданные следует хранить и в каких возможных форматах, чтобы их могло легко использовать сообщество.

В связи с этими соображениями и множеством возможностей для роста сообщества smFRET, несколько лабораторий, имеющих опыт работы с FRET, без претензий на исчерпывающий или исключительный характер, собрались, чтобы поддержать эти усилия и предложить шаги по организации сообщества вокруг последовательной и открытой науки. практики. Это действие переводится в общие методологические рекомендации или предложения, которые мы представляем после типичного рабочего процесса эксперимента smFRET, включая подготовку и определение характеристик образцов, описание установки, сбор и сохранение данных, а также анализ данных.Эти рекомендации о том, как «практиковать» smFRET, являются не попыткой систематизировать сообщество, а скорее первоначальным предложением, которое направлено на поощрение открытого диалога о существующих практиках в нашей области и приводит к более высокой воспроизводимости результатов экспериментов smFRET.